Методическая статья

Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация

DOI:

10.3791/51086

⸱

12 апреля 2014 г.

 ,  , 
1School of Biological Sciences, Monash University, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поколение четырехмерных (4D) конфокальной данных; , состоящий из последовательностей изображений 3D в течение долгого времени; обеспечивает отличную методику, чтобы захватить клеточные поведения, связанные с процессами развития. Возможность отслеживать и следовать клеточные движения ограничена образцов движений, которые происходят из-за дрейфа образца или, в некоторых случаях, рост в течение получения изображений. Отслеживание клетки в наборах данных, пострадавших от дрейфа и / или роста будет включать эти движения в любом анализе положения клеток. Это может привести к видимым движением статических структур в образце. Поэтому до отслеживания клеток, любой образец дрейф должно быть исправлено. Использование с открытым исходным кодом Фиджи распределение 1 из ImageJ 2,3 и включены локусов инструменты 4, мы разработали правильный 3D дрейфа плагин для удаления ошибочной движение образца в конфокальной данных. Этот протокол эффективно компенсирует перевода образца или изменением фокусного роsition, используя корреляцию фаз для регистрации каждого тайм-точку четырехмерного конфокальной наборов данных, сохраняя при этом способность визуализировать и измерять движения клетки в течение длительного экспериментов покадровой.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальной визуализации широко используется в клеточной и эволюционной биологии следовать клеточные движения и изменения в морфологии. Захват серию оптических срезов на разных фокальных плоскостях позволяет генерировать трехмерной (3D) модели образца, который затем может быть продлен на четыре измерениях (4D) путем создания покадровой серию 3D данных. Поколение 4D наборов данных позволяет детальное измерение движений и поведения клеток. В долгосрочных покадровой экспериментов он является общим для наблюдения движения образца. Это может быть вызвано небольшими неточностями в контролирующей стадии аппаратной и координационных позиций. В то время как в других случаях, дрейф является результатом движений, вызванных ростом образца или гибкости в образце монтажной СМИ. Существуют методы, чтобы компенсировать или ограничивать эти движения, включая усовершенствование системы фокусировки аппаратных и повышенной жесткости монтажной среды. Однако эти подходы не могут быть применены во многих случаях из-за формирования изображения сдр. до обязаны предоставлять благоприятные условия для поддержания и роста образцов. Программного обеспечения с открытым исходным кодом решения существуют для коррекции движения в 2D с течением времени, через использование StackReg и TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 плагинов в ImageJ или Фиджи, но они не могут применяться к 4D данных.

Для коррекции образца дрейфа мы разработали плагин (Правильное 3D дрейф), чтобы использовать с открытым исходным кодом визуализации обработки платформу, Фиджи 1. Наш плагин способен выполнять фазовой корреляции регистрацию исправить движение, которое происходит в результате выборки дрейфа в трехмерных экспериментов покадровой. Фаза корреляция 6 является вычислительная эффективный метод, чтобы определить различия между изображениями. Плагин описано здесь использует фаза-корреляции библиотеку, разработанную Preibisch др.. 7. В экспериментах многоканальных, плагин использует один канал, чтобы детерпе требуется коррекция. Эта поправка затем применяется к любым дополнительным каналам в результате чего регистрации набора данных 4D.

В данио модели системы можно осуществлять покадровой обработки изображений в течение многих часов или даже нескольких дней 8. Распространенным методом для монтажа данио является внедрение анестезированной живой эмбрион в низкой температурой плавления агарозы (0,8-1,5%), ограничивая свое движение 9-11. В то время как движение ограничено рост образца все еще имеет место, в результате чего клеток в поле зрения меняющихся положение. Для того чтобы проследить движение клеток в эмбрионе, необходимо сначала коррекции движения всей выборки. Этот протокол был разработан с данио образцов, и были использованы в разработке изображение сомитов 12, но может быть применен к любой 4D конфокальной данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 4D Покадровый Визуализация Эксперименты

Используемые для получения изображений настройки будут отличаться в зависимости от используемого оборудования. Способность конфокальной микроскопии в оптически секции образца зависит от ряда факторов: длина волны возбуждения, отверстие размера, числовой апертурой объектива, показателя преломления образца и среды, в которой образец встроенной. Размер конфокальной точечным выбранной будет определять толщину оптической части собраны. Меньшее отверстие будет производить более тонкую секцию оптического увеличения разрешения Z-оси, но уменьшая количество света, захваченное. Большее отверстие будет увеличивать толщину оптической части, уменьшая разрешение Z-оси, но растет количество света, захваченное.

Дополнительные факторы, которые следует учитывать при сборе 4D данных до коррекции включают в себя:

  1. Оптимизация скорости сканирования для удаления или предел, дрейф ðо время захвата одного момента времени. Поэтому время, необходимое для сбора изображений должна быть небольшая часть интервала между временных точках.
  2. Прекрасно повторяющиеся структуры, или решетки, не пригодны в качестве структур для регистрации, как это не представляется возможным определить требуемую коррекцию. Случайно распределенных шарики или неровные структуры позволит однозначно регистрацию.
  3. Если дрейф ожидается, увеличить площадь сканирования и верхний и нижний пределы фокус в целях обеспечения сферой интересов остается в стеке изображения.
  4. В дополнение к обеспечению этом есть соответствующая пространственное разрешение, чтобы решить эти структуры интересов, установить частоту дискретизации, чтобы обеспечить временное разрешение для динамических событий изучаются.
    Примечание: В связи с этим время между изображением временных точках должно быть не менее половины времени интервал между регулярными повторяющихся событий и уменьшить для нерегулярных событий.

2. Открытие конфокальной Dataset

С открытым исходным кодом пакет Фиджи является распределение программы ImageJ, который содержит предварительно установленные плагины для выполнения многочисленных процессов на данных, собранных от микроскопических экспериментов. Программное обеспечение обеспечивает более легкий архитектуру обновления плагина и включает в себя копию правильном 3D дрейфа плагина, используемого для этого протокола. Программное обеспечение поддерживает импорт широкий спектр собственных форматов микроскопии изображения за счет использования био-форматы импорта плагина в открытом Микроскопия среды.

  1. Установите программу Фиджи (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Загрузите приобретенный набор данных с помощью плагина Импортер LOCI Био-форматы.
  3. Если набор данных больше, чем памяти, выделенной для программы, выберите "Использовать опцию виртуального стека" в секции управления памяти.

3. Коррекция Drift 3D-объекта в Постобработка

В ходе длительного покадровойэкспериментировать образец может двигаться даже при его внедрении. Чтобы исправить любое движение и позволить миграционные события распечатанных быть проанализированы, после обработки изображений может быть выполнена. Вся обработка сообщение Изображение должно быть четко описаны в методологии любого анализа, полученных от этой работы.

  1. После того, как набор данных загружается, запустите Правильное 3D плагин дрейфа.
  2. При наличии нескольких каналов изображения, выберите канал, который будет использоваться для регистрации изображения. Это в идеале должны представлять статическую структуру в образце, а не каких-либо миграционных или подвижных элементов. Однако, если это невозможно канал с наименьшим движения должны быть выбраны.
  3. Если свободной оперативной памяти в системе, используемой для анализа меньше в два раза больше первоначального набора данных, выберите опцию использовать виртуальные стека. Это будет хранить зарегистрированный HyperStack в виде последовательности изображений, а не сохранять файл в ОЗУ.
    1. Выберите папку для плагина для вывода человека исправлены ИМАGES файлы. Отдельный файл изображения будет создан для каждого канала в каждой позиции г.
  4. Модуль будет проводить фазовый анализ корреляции парного между каждой временной точке, чтобы определить требуемую коррекцию который затем применяется к набору данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В развивающихся данио, быстрые мышечные клетки сливаются в многоядерных волокон от 19 часов после оплодотворения (20 - сомитов) 13. Для того чтобы визуализировать движение ядер и слияние мышечных клеток мы проведенных 4D конфокальной микроскопии покадровой использованием трансгенного штамма, который выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем скелетной α-актин промотора маркировать все мышцы клетки 14 и вводят РНК, кодирующей красный флуоресцентный белок mCherry с меткой последователь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша способность использовать программное обеспечение постобработки исправить образец дрейф наборов данных, полученных из расширенных покадровой экспериментов микроскопии ограничивается рядом факторов. Способность различать дрейф в зависимости от миграционного движения образца зависит от клеточных маркеров, используемых. Сотовые маркеры, которые либо широко выраженные в образце или не участвующие в миграционных событий во время получения изображения обеспечивают лучший источник для коррекции дрейфа. Модуль использует од...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Gaby Мартинс и организаторов семинара EMBO2010 3D Развивающие изображениями, где началась эта работа и все из авторов проектов Фиджи и ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Этил3-аминобензоат метансульфонат (трикаин)Sigma-AldrichA5040
Низкая температура гелеобразования агарозыSigma-AldrichA9414-25G
Dumont #4 Щипцыдля электронной микроскопии Sciences0208-4-PO
Одноразовый 3 мл градуированныйSamco212
Полиэтиленовая трансферная пипетка
Чашки Петри 9см бактериального классаGreiner Bio One632180
Трубка из фторированного этиленпропилена (FEP)BolaS1815-04
Zeiss LSM-710 Конфокальный микроскопZeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC ObjectiveZeiss421452-9600-000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  2. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
  3. Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
  4. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  5. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
  6. Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
  7. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
  9. Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
  10. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
  11. Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
  12. Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
  13. Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
  14. Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

4DFiji ImageJ3D

Похожие статьи