Методическая статья

Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными В месте Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание

DOI:

10.3791/51091

⸱

23 января 2014 г.

 ,  ,  , 
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы установили флуоресцентной гибридизации протокола месте в для обнаружения упорной вирусной ДНК генома в пределах срезов ткани животных моделях. Этот протокол позволяет изучение инфекционного процесса по codetection вирусного генома, его РНК продуктов, а также вирусными или клеточными белками в пределах отдельных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноместный клеток codetection гена, его продуктом РНК и клеточные регуляторные белки имеет решающее значение для изучения регуляции экспрессии генов. Это вызов в области вирусологии, в частности для применения в атомной тиражирование стойких вирусов ДНК, которые включают модели животных для их изучения. Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) устанавливает пожизненное латентной инфекции в периферических нейронах. Латентный вирус служит резервуаром, из которого он реактивирует и вызывает новую герпетической эпизод. Клеточной биологии ВПГ-1 задержки еще малопонятным, отчасти из-за отсутствия методов обнаружения ВПГ-1 геномов на месте в животных моделях. Мы описываем ДНК-люминесцентные в гибридизация (FISH) подход эффективно обнаруживать низким копирования вирусных геномов внутри разделов нейронных тканей от инфицированных животных моделях. Метод основан на основе термической антигена разоблачения, и непосредственно меченые самодельные ДНК-зонды, или коммерчески доступные датчики. Мы разработали тройную СтаиНин подход, сочетающий ДНК-FISH с РНК-FISH и иммунофлюоресценции, используя усиление сигнала пероксидазную основе для размещения каждое требование окрашивания. Основным усовершенствованием является возможность получения в течение 10 мкм срезов тканей, низкофоновых сигналов, которые могут быть отображены с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии и широким полем обычной эпифлуоресцентной. Кроме того, тройной окрашивание работал с широким спектром антител, направленных против клеточных и вирусных белков. Полный протокол занимает 2,5 дня, чтобы разместить антитела и проникающий зонд в ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) является постоянным человеческий вирус нейротропным, установление долгосрочного латентной инфекции в нейронах тройничного ганглиев (ТГ) периферической нервной системы, от которой он реактивирует периодически копировать и распространяться. ВПГ-1 геном является 150 кб днДНК локализация в ядре принимающей нейрона, где он остается как MultiCopy chromatinized плазмиды, которые не интегрироваться в принимающих-геном клетки 1,2. Во время задержки, генетический программа ВПГ-1 репликативной цикл сильно подавлены, и экспрессия гена ограничена латентного связанных транскрипта (LAT) локуса, от латентного установления к инициации реактивации 3. LAT выдает длинный 8.5 KB некодирующих РНК обработанный в крупный 2 кб стабильной лассо, и несколько микроРНК 4-7. ВПГ-1 задержки, таким образом, характеризуется наличием вирусной геномной ДНК, РНК LAT, а также отсутствие обнаруживаемых репликативных белков цикла.

ontent "> Животные модели, преимущественно мыши и кролика, экспериментальные модели Резюмируя несколько особенностей задержки в человека. Одним из главных интересов этих моделей является то, что они позволяют изучать физиологические аспекты HSV-1 задержки в иммунокомпетентных. За последние десятилетия , много экспериментальных инструментов, таких как генетически модифицированных вирусов и мышей, были разработаны для изучения физиологии, генетики и клеточной биологии HSV-1 задержки, из животных тканей. До сих пор вирусной геномной ДНК не была обнаружена и количественно с помощью саузерн-блоттинга и КПЦР от диссоциации ТГ. Тем не менее, в настоящее время нет доступный метод для выявления ВПГ-1 геном на в гибридизация на срезах тканей 8. Следовательно, задержка обычно начисленных на гистологических срезах путем выявления LAT РНК с помощью РНК в гибридизация, а не вирусная обнаружения генома. Потому что это было невозможно охарактеризовать инфицированные клетки в зависимости от наличия вирусных геномов, Тхис техническим ограничением была главным недостатком к анализу многими аспектами принимающей антивирусных взаимодействий, таких как отношения между вирусного генома и клеточной и генной экспрессии вирусного или клеточного иммунного ответа хозяина 9,10.

Самое главное, что неоднородность клетки к клетке из латентной инфекции остается относительно неисследованными и было показано, что одним из ключевых элементов задержки на мышах и в человеческих чувств нейронов ганглиев, имплантированных в SCID мышей 11-17. Как правило, было показано, кПЦР, что геном число копию HSV-1 в клетке колеблется от 5 до нескольких сотен. Хотя LAT появляется как ключевой регулятор латентности и реактивации, КПЦР данные о изолированных нейронов и в месте ПЦР показал, что только часть латентно инфицированных нейронов, по цене от 30%, выражает LAT локус 11,12,18-21. Как клетка-хозяин и сотовый среда, в воздействии ткани о создании латентного вируса ивыражение вирусный ген, остается неясным. Здесь мы опишем надежную люминесцентные в гибридизация (FISH) метод для эффективного обнаружения низкого копирования HSV-1 геномной ДНК в животных секциях нервной ткани. Такой метод был разработан и используется нами, чтобы получить доступ к высоким разрешением микроскопии изображений, которая необходима для изучения взаимодействия вирусного генома с клеткой-хозяином внутри ядерных компонентов 22. Кроме того, мы опишем метод множественного окрашивания для одновременного обнаружения вирусной ДНК с РНК и белков, что является уникальным инструментом для описания вирус-хозяин взаимодействий, которые регулируют экспрессию вирусных генов. Способ также может применяться для широкого диапазона испытаний, требующих обнаружения HSV-1 латентного генома, например, количественной зараженные нейроны в большом количестве секций. Ключевым шагом является применение антиген лечение извлечения сделать вирусная ДНК доступной для гибридизации. Таким образом, этот протокол также может быть эффективным для обнаружениядругих вирусов двухцепочечной ДНК, которые в настоящее время не обнаружено обычными подходов ДНК-промысел в тканях животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод был использован в исследовании, опубликованном ранее 22. Для общем фоне и описание обычного манипулирования на ISH, IF и рыбу, мы предлагаем следующую доступную литературу 23.

1. Животное Инфекция

Все процедуры, связанные с экспериментальных животных соответствовали этическим вопросам из Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление на использование животных в научных исследованиях, и они были одобрены местным комитетом по этике УПО-3296-CNRS, по в соответствии с Европейским сообществом Директива Совета 86/609/EEC. Все животные получали неограниченный доступ к пище и воде.

Способ инфекции мыши с HSV-1 описано ниже был использован в ранее опубликованных исследований 24-26.

  1. Подготовьте следующие решения для подготовки перед запуском:

    ВПГ-1 вируса раствор
    Обезболивающий решение - Ketaminэлектронной 100 мг / кг и ксилазина-10 мг / кг
  2. Поднимают 1 мкл вируса (10 6 БОЕ) в 5 мкл стекла микрошприца, подключенного к микрошприцу насоса устройства доставки 0,1 мкл / сек. Примечание: Ресуспендируют вируса запас в фенолового красного среде без видеть граница между красного масла представить в капилляре и раствора вируса и, чтобы избежать инъекции воздуха в месте инокуляции вируса.
  3. Положите наркозом мышь (Кетамин-100 мг / кг и Ксилазин-10 мг / кг) на его задней лицевой стороной вверх.
  4. Расположите наркозом голову мыши под бинокулярным стерео-микроскопа и вставить иглу в субэпителиальной слоем левой верхней губой на слизистых границы. Введите раствора вируса в два этапа (дважды 0,5 мкл) при скорости 0,5 мкл на 5 сек. Примечание: Респект 10 сек паузы между двумя 0,5 мкл инъекции, чтобы дать возможность вирусной суспензии поглощать в месте инъекции.
  5. Наведите в37 ° C инкубатор до пробуждения.
  6. Оставьте мышь в объектах животного восстановиться в течение необходимого времени. Примечание: В модели мыши, ВПГ-1 вызывает первичную инфекцию, которая называется острая инфекция, которая длится менее 10 дней на месте прививки и в течение нескольких нейронных тканей, включая ТГ, верхний шейный ганглий (SCG), и ганглии задних корешков (DRG) в зависимости от месте прививки. Признаки первичной инфекции постепенно исчезают и задержки считается полностью создана около 28-30 дней после заражения (DPI) и далее. Нейронов ткани могут быть собраны, как правило, от 4 руб за исследования по острой инфекции, и с 28 точек на дюйм для задержки исследований.

2. Мышь перфузии-фикс

  1. Подготовьте следующие решения перед началом: 50 мл буфер физиологического раствора

    60 мл 1x PBS
    150 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида в 1х PBS
    60 мл 20% сахарозы в 1х PBS. <бр />
  2. Подготовка трубки перфузии: подключение иглу в капилляр, который соединен с перистальтическим насосом.
  3. Обезболить мышь, как описано выше (SREP 1.2) и положите его на спину на рассечение лоток, придаваемом четырех ногах с булавками.
  4. Использование ножницами вырезать кожу от живота до горла *. Сорвите тонкий слой ткани, покрывающей органы. Открытый грудную клетку путем разрезания ребер на одной стороне грудины. Снимите кожу при отрыве. Отойдите от друга право и левые части грудной клетки, чтобы выявить сердце Примечание:. Обратите внимание, чтобы не надрезать кишки, легких и большие сосуды (сонные артерии и яремной вены), которые сделают заливать-фиксация невозможно.
  5. Вставьте иглу в левом желудочке *. Надрезать правое предсердие с ножницами. Продолжайте обескровливания путем введения 20 мл физиологического раствора в кровеносных сосудах в сердце. Пусть кровоток в лоток. Неттэ: Во время этой процедуры, обращать внимание не на прокол через другую сторону сердца.
  6. Заливать 150 мл 4% PFA в 1x PBS в течение 15 мин * (Внимание: PFA является токсичным, манипулировать под вытяжным шкафом). Заливать 60 мл 20% сахарозы в 1x PBS в течение 6 мин. На этом этапе мышь готова для TG заготовки. Примечание: Установить насос 10 мл / мин. Хороший перфузии заметен, когда хвост мыши застывает, подними затем снова упадет.

3. Т.Г. Уборочная

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    20% сахарозы в 1x PBS
  2. Отрежьте голову на уровне шеи. Отрежьте кончик носа позади резцов с целью выявления полости носа. Надрезать неба в два с ножницами и отойти каждую сторону неба. Примечание: ТГ появляется прямо под небом, в виде двух белых и продолговатой формы масс 2-3 мм в длину, расположенной на правой илевой стороны и подключен к тройничного нерва.
  3. Вырезать тройничного нерва филиалы на каждой стороне ТГ выпустить ТГ из ствола мозга. Снимите ТГ с хирургическими щипцами и держать их в 20% сахарозы стерильного раствора в течение 24 часов. Примечание: Использование двух различных получателей для левой и правой ТГ, чтобы избежать путаницы между левым ТГ (зараженной) и правой ТГ (не или слабо заражены). Выдержите ТГ в 20% сахарозы в 1x PBS в течение 24 часов перед вложением.
  4. Код ТГ в одном блоке в cryosectioning вложение среды и замораживание при -80 ° С
  5. Храните блоки при -80 ° С до секционирования.

4. Cryosection Подготовка

  1. Разрежьте продольном TGS как 10 мкм разделов на -20 ° C криостат, и разместить их на слегка подогретой (30 ° С) SuperFrost слайды. Пусть ломтики высохнуть в течение 5-10 мин, затем заморозить и хранить при температуре -80 ° С до использования. Примечание: До 4-5 секции могут быть плаКНИ на одном слайде, если большое количество секций должны быть обработаны одновременно. Мы проделайте следующее: серийные срезы наносят на 3 серии слайдов с надписью A1, B1 и C1, то A2, B2, C2 и так далее. Таким образом, каждая серия слайд (A, B, и C) могут быть обработаны для различного окрашивания (в гибридизация, рыба, на месте ПЦР, LCM) и данные, полученные с помощью различных методов можно сравнить зная, что слайды, несущие такое же количество соответствуют в той же области ТГ.

5. ВПГ-1 Маркировка зонд

Протокол, описанное ниже для обнаружения HSV-1 генома ДНК FISH был успешно использован с двумя типами датчиков. Первым из них является самодельным Су3 меченных флуоресцентного зонда, который подходит для тонкой анализа ядерной организации в отдельных клетках, по большом увеличении флуоресцентной микроскопии. Второй является коммерчески доступным биотинилированного зонда, который может быть комбинироватьг с усилением сигнала пероксидазой основе, чтобы обеспечить светлое сигнал. Последний подходит для идентификации и количественного определения вируса, содержащего нейроны при малом увеличении в цельной части, и для анализа HSV-1 шаблонов генома. Конечные пользователи должны оценить, какой подход лучше всего подходит цель их изучения. Коммерчески доступный зонд перечислены в разделе реагента, а также подготовка самодельного зонда описан ниже.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    ВПГ-1 генома, содержащие векторы (см. шаг 1)
    70% этанол, молекулярная биология класса.
  2. . Подготовка космиды, содержащие 30 Kb части HSV-1 геномов (космиды число 14, 28, 56 и описано со ссылкой 20 с использованием колонки очистки, предназначенные для больших векторов Примечание: Другой тип библиотек, содержащих HSV-1 геномы, например, бактериальных искусственных хромосом должен работать, а, пока зонд охватывает альArge часть ВПГ-1 генома производить достаточное сигнал 27-29. В наших руках, зонды, изготовленные из космиды векторного скелета не производить никаких сигналов, и были использованы в качестве отрицательного контроля. Таким образом целые космидных векторы, содержащие ВПГ-1 последовательность были использованы в нашем исследовании. Кроме того, можно вырезать последовательность HSV-1 и использовать его для приготовления зонд.
  3. . Этикетка 2 мкг каждого космиде с Cy3-дЦТФ использованием набора ник-трансляции в соответствии с рекомендациями производителя Примечание: Выполните маркировку с реакционной смеси, содержащей только Су3 дЦТФ и не имеющей маркировки дЦТФ.
  4. Остановить реакцию добавлением 3 мкл 0,5 М ЭДТА в смеси и нагреванием при 70 ° С в течение 10 мин. Охладите на льду.
  5. Очищают зонд на G50 гель отчуждения миниколонку. Добавить 150 мкг ДНК спермы лосося с зондом и осадок зонд осаждением этанолом. Осадок ДНК должны быть розовыми из-за Cy3 регистрации. Вымойте гранул с 70% этанола и удалить как можно больше этаноланасколько это возможно с помощью пипетки. Не позволяйте гранул сухой.
  6. Растворите таблетку 100 мкл деионизированной формамидом (Внимание! формамид токсичен Манипулирование под вытяжным шкафом.). Концентрация зонд не может быть достоверно определена в этой точке. Указанные в тексте зонд величины относятся к количеству ДНК-матрицы, используемой для изготовления зонда. Протокол основываясь на 2 мкг ДНК-матрицы и 100 мкл формамида, она считается 20 нг / мкл. Хранить при -20 ° С. Меченый зонд может быть получен в больших количествах и хранить в замороженном виде в течение нескольких месяцев.

6. ДНК-FISH

На рисунке 1 показан обзор основных шагов протокола ДНК-FISH, и как выполнить ДНК-FISH в рамках многократного эксперимента окрашивания в codetect РНК и белка, как описано в Протоколы 7-9.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    0,5% Тритон Х-100 в 1x PBS
    2x SSC и 0,2 x SSC буфера
    100 мМ рН 6,0 цитрат буфера (10x раствор) и 10 мМ рН 6,0 цитрат буфер (рабочий раствор)
    2x гибридизации буфер (см. Протокол 4)
  2. В день 1, поместите препараты на держателе слайдов при комнатной температуре, и пусть разделы высохнуть в течение 10 мин. Обведите разделы с гидрофобным пера. Увлажняет секции в 1x PBS в течение 10 мин. Инкубируйте секций 20 мин с 0,5% Triton X-100 в 1x PBS в проницаемыми ткани. Вымойте 3x 10 мин с 2х SSC, и держать в 2х SSC до разоблачение буфер не нагревается (см. ниже).
  3. Для разоблачения, подготовить слайд лоток стекла (20 скользит мощности), заполненную 200 мл 10 мМ цитрат натрия буфером (рН 6,0). Поместите лоток в емкости большего объема, заполненную 500 мл дистиллированной воды. Этот параметр позволяет лучше контролировать отопления импульсов. Перед размещением слайды в лоток, не разогрейте буфер в микроволновой печи, пока буffer достигает кипения (около 8 минут при 800 Вт).
  4. Поместите слайды в предварительно разогретой цитрат буфера, содержащего лоток, и убедитесь, что они полностью покрыты буфера. Тепло в течение 20 секунд, пока буфер не достигнет кипения. Внимание, не позволяйте буфер над кипения, что может привести к повреждению тканей. Охладить при комнатной температуре в течение 2 мин. Повторите 6x отопление цикла (всего 7 циклов нагрева) *. Охладить 2 мин и передавать слайды в 2х SSC в течение 5 мин.
    Примечание *: Это одна из наиболее важных стадий. Оптимальное количество и продолжительность циклов нагрева должна быть определена эмпирически и могут варьироваться в зависимости от типа ткани или типа используемого зонда. Микроволновая печь, лоток, контейнер и объем буфера в лоток и воды в контейнере должны храниться одинаковы для воспроизводимости разоблачения. Чрезмерное кипения может привести к потере тканей и поврежденных клеток. Для каждого отопительного импульса, появление кипения, тщательно наблюдал, и теплоIng следует прекратить при первых признаках кипения. После настройки демаскирования появляется надежной и воспроизводимой. Фиг.2А показывает, что ВПГ-1 геном могут быть обнаружены демаскации различных буферов, указывая, что демаскирующих условия могут быть дополнительно изучены. Цитрат основе разоблачение было установлено, последовательно обеспечить хороший сигнал рыбу, и сохранение тканей, с разделами из различных моделей лабораторных и животных.
  5. Инкубируйте слайдов в метанол: уксусная кислота: PBS смеси (3:01:04) в течение 15 мин, а затем в метанол: смеси уксусной кислоты (3:1) в течение 15 мин (Внимание: уксусная кислота вызывает коррозию Манипулирование под дыма. капот и использовать адекватную защиту. Подготовьте это решение непосредственно перед использованием).
  6. Обезвоживают путем последовательного раздел 10 мин инкубации в 70%, то 2x 10 мин в 100% этаноле. Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 10 мин. не допускайте попадания воды до зондирования.
  7. Подготовьте зондирования решение следующим образом: заранее подготовить 20 мл запас 2х гибридизации буфера сотрудничестваntaining 20% ​​декстрансульфат (MW 500000), решение 2x Денхардта, 4x SSC *. Алиготе решение как 500 мкл в микропробирок, и хранить при температуре -20 ° С. За 1 слайд (покровное 22 мм х 50 мм), смешать 90 нг HSV-1 Су3 меченым зондом (30 нг зонда для каждого космиде), и завершить объем до 40 мкл с формамидом. Добавить 40 мкл 2х буфера гибридизации. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
    Примечание *: Для приготовления буфера 2х гибридизации, смешать 4 г МВт сульфата декстрана 500000 в 10 мл дистиллированной воды. Это делает вязкую смесь, которая растворяет по 3-4 часов при 70 ° С Смешайте регулярно, чтобы помочь растворить. Добавить 4 мл 20x SSC, 400 мкл 100x раствор Денхардта. Заполните до 20 мл и хорошо перемешать с помощью вихрь.
  8. Падение 80 мкл раствора на зондировании высушенных секций. Накрыть 22 мм х 50 мм покровным стеклом, и убедитесь, что зондирования решение распространяется нався поверхность покровного стекла. Внимание: не должно быть никаких пузырей. Наличие пузырьков снижает эффективность гибридизации. Уплотнение покровное использованием резиновый клей, и дайте ему высохнуть. Хранить слайды в темноте при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часов для оптимального сигнала гибридизации по всей слайда.
    Примечание: Резина цемент удобно, поскольку это быстро сохнет, является водонепроницаемым, и защищает образец от высыхания во время гибридизации. Это также легко шелушится удалить покровное после гибридизации. Лак для ногтей является альтернативным эффективным, но менее удобный вариант.
  9. Продолжайте денатурации путем размещения слайдов на 80 ° C слайд-инкубаторе в течение 5 мин. Кроме того, поместите препараты на металлический поднос и поместите лоток на водяной бане 80 ° C (лоток должен плавать). Тогда быстро передавать слайды на металлическую лоток помещают на лед. Оставьте на 5 минут. Трансфер слайды при 37 ° C (нагревателя слайд или инкубатора) на одну гибридизации. Примечание: Мы не рекомендуем короткую гибридизации, в результате чего слабая или отсутствие сигнала.
  10. В день 2, снимите резиновый клей щипцами, сохраняя слайд на нагреватель сохранить раздел при 37 ° С Удалить покровное мягко кончиком лезвие скальпеля.
  11. Wash 3x с 2х SSC при 37 ° С в течение 5 мин, и в три раза с 0,2 × SSC при 37 ° С в течение 5 мин. Вымойте один раз 2х SSC при комнатной температуре в течение 5 мин и заполните окрашивания ДНК и монтажа (см. Протокол 10 ниже).
    Примечание: Этот метод позволяет для обнаружения клеточных геномных мишеней, с использованием соответствующих зондов на зондирующего растворе вместе с HSV-1 специфических зондов, опубликованной в центромерной и прицентромерных последовательностей 22.

7. Двойной РЫБЫ РНК-ДНК

См. рисунок 1, зеленые ящики для обзора.

Для кратногоокрашивания процедуры, включая в шаге РНК-FISH, как правило, рекомендуется сначала выполнить обнаружение РНК в качестве такого цели чувствителен к деградации РНКазой и химикатов. Кроме того, процедура ДНК-FISH включает процедуры, которые снижают эффективность других окрашивания. Для РНК-FISH, мы выбрали фермент подход обнаружения (Tyramide Усиление сигнала (TSA), используя биотинилированных зондов и пероксидазу (HRP) в сочетании стрептавидином). АСП на основе флуоресцентной tyramide подложки (см. таблицу реагентов для деталей), который ковалентно связан с тканью с помощью реакции ферментативного пероксидаза. Сигнал РНК-РЫБА, таким образом, сохраняется в течение ДНК-FISH.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    Вектор для транскрипции в пробирке LAT локуса (pSLAT-2)
    1X PBS, содержащем 2 мМ РВК
    0,5% Тритон Х-100 в 1x PBS, содержащем 2 мМ РВК
    3% H 2 0 2 в дистиллированной воде.
    70%, 80%, 95% этанол, молекулярная биология класса.
    4x РНК решение гибридизации (см. Протокол 4)
  2. По крайней мере, за один день до эксперимента РНК-FISH, подготовить РНК FISH зонд. Для обнаружения HSV-1 задержки связаны Стенограмма (LAT), готовят биотинилированный рибо-зонд от pSLAT-2 вектора 30, или другого вектора в пробирке транскрипции локуса LAT, как описано выше в ссылке 26. Кратко: линеаризуем 10 мкг pSLAT-2 с HindIII и очистить расщепленного вектора с комплектом очистки ДНК. Обобщение одной нити рибо-зонда от 2 мкг переваренной pSLAT-2 с Т7 в пробирке транскрипции комплекта в присутствии биотин-16-UTP *. Очищают зонд с мини-колонки РНК и количественного при 260 нм с помощью спектрофотометра. Развести зонда при 50 нг / мкл ДНКазы в / РНКазы свободной воды и хранить при температуре -80 ° С, в виде небольших аликвот, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
    Примечание *: биотин-16-UTP: соотношение UTP необходимо эмпирически определяется. Мы екруглый соотношение 40:60 создание зондов эффективно обнаруживая LAT РНК-FISH.
  3. В день 1, поместите препараты на держателе слайдов при комнатной температуре, и пусть разделы высохнуть в течение 10 мин. Обведите разделы с гидрофобным пера. Увлажняет разделы в 1x PBS, содержащем 2 мМ рибонуклеозид ванадильного комплекса (РВК) * в течение 10 мин. Инкубируйте разделы в течение 20 мин с 0,5% Triton X-100 в 1x PBS, содержащем 2 мМ РВК в проницаемыми ткани. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS, 2 мМ РВК. Утолить любой активности эндогенной пероксидазы, инкубировать раздел в 3% H 2 O 2 для 2х 10 мин, а затем мыть один раз с 1x PBS, 2 мМ РВК.
    Примечание *: Во время процедуры РНК-FISH, рибонуклеозид ванадильного комплекса (РВК) добавляется к буферов и решений для предотвращения деградации РНК.
  4. Выдержите 2x 10 мин в 70%-ном этаноле. На этом этапе секции могут быть сохранены в 70% этаноле при -20 ° С в течение нескольких недель. Высушить секции путем инкубации в 80%, 95% и 100% ETHAnol, 5 мин каждый. Пусть раздел высохнуть в течение не менее 10 мин.
    Примечание: В некоторых случаях лечение этанол может быть вредным для обнаружения других целей. Альтернативный протокол, используя шаг Предгибридизацию в 50% формамиде - 2x SSC может быть использован (см. ниже в Протоколе 9 Подробнее о тройной окрашивания). Однако лечение этанола является наиболее универсальным подходом для РНК-FISH и обеспечивает самую низкую фон.
  5. Подготовьте зондирования решение следующим образом: заранее подготовить 10 мл запас 4-кратным РНК гибридизации раствора, содержащего 8x SSC, 20x раствор Денхардта, 4 мМ ЭДТА, 40% декстран *. Алиготе решение как 500 мкл в микропробирок, и хранить при температуре -20 ° С. За 1 слайд подготовить 80 мкл раствора (покровное 22 мм х 50 мм), путем смешивания 20 нг биотинилированного LAT рибозонд, 40 нг тРНК дрожжей, 2 мм РВК и полное 20 мкл водой. Добавить 20 мкл 4-кратным РНК гибридизации решения, и 40 мклформамида (50% конечная концентрация). Для облегчения пипетки и перемешивания, рекомендуется prewarm на 4x РНК решение гибридизации при 75 ° С Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
    Примечание *: Для приготовления РНК гибридизации решение 4x, смешать 4 г сульфата декстрана (MW 500000) в 3 мл дистиллированной воды и 4 мл 20х SSC. Это делает вязкую смесь, которая растворяется при 3-4 ч при 70 ° С Смешайте регулярно, чтобы помочь растворить. Добавить 2 мл 100x раствор Денхардта и 80 мкл ЭДТА 0,5 М. Заполните до 10 мл воды и хорошо перемешать с помощью вихрь. Внимание: используйте только РНКазы / ДНКаза бесплатные продукты.
  6. Денатурация зонд 10 мин при 75 ° С Между тем, поместите препараты на слайд инкубатор до 65 ° С Оставьте 80 мкл раствора зонда на секциях и быстро разместить покровное на капли. Внимание: не должно быть ни один пузырь. Наличие пузырьков уменьшается гибридизации эффiciency. Инкубационный должно происходить во влажной камере с покровное не запечатан. Используйте либо слайд-инкубатор, который может удерживать воду (см. материал таблицу), или подготовить влажной камере в запечатанной коробке и поместить его в 65 ° C гибридизации духовке.
  7. Выдержите в течение ночи при 65 ° C. Примечание: LAT RNA-FISH проводится при 65 ° С для предотвращения неспецифического связывания зонда, которое наблюдается при 37 ° С Многие другие РНК-зонды FISH должно привести к хорошим сигналом при 37 ° С
  8. В день 2, перед началом стирки, приготовления реагентов обнаружения в соответствии с инструкциями завод-изготовитель комплекта обнаружения TSA. Обнаружение осуществляется с помощью коммерческого набора TSA обнаружения, включающей в себя пероксидазой хрена (HRP) в сочетании стрептавидином и зеленого или синего флуоресцентного субстрата.
  9. Держите слайды на слайде нагревателя при 65 ° С Осторожно снимите покровное и быстро добавить 1 мл 50% формамида в 2х SSC, предварительно нагретойт 65 ° С. Внимание, не позволяйте раздел сухой. Промыть два раза 10 мин при 65 ° С в 50% формамиде в 2х SSC и 2x 10 мин в 2х SSC при 65 ° С Вымойте еще раз с 2х SSC и поместить слайд на 37 ° C слайд нагревателя.
  10. Продолжайте этапе обнаружения в соответствии с инструкцией обнаружения комплект TSA производителя. Концентрацию HRP-стрептавидина, концентрация флуоресцентного субстрата и время реакции должны быть определены эмпирически *. Для LAT обнаружения РНК, мы обычно используется следующее условие: HRP-стрептавидин разбавляют в 1/500, флуоресцентный реагент на 1/100 для синей флуоресценции и 1/500 для зеленой флуоресценции и время реакции 10 мин. Сигнал может быть быстро проверил с перевернутой флуоресцентного микроскопа без монтажной, прежде чем приступить к ДНК-FISH.
    Примечание *: Протокол усиление будет дизайн в соответствии с основными целями эксперимента. Например, чтобы точно локализовать целевую РНК, это объявлениевизируются использовать короткое время реакции. В противоположность этому, быстро определить и считать положительных клеток при малом увеличении, время реакции может быть увеличена, чтобы генерировать яркий сигнал.
  11. Для ДНК-FISH, следуйте процедуре, указанной выше, начиная с разоблачительной стадии (шаг 6.2).

8. РЫБЫ Иммуно-ДНК

См. рисунок 1, фиолетовые ящики для обзора.

Подобно РНК-ДНК-FISH, рекомендуется выполнить сначала иммунофлюоресценции, так как ДНК-FISH, вероятно, денатурации белков и предотвращения их обнаружения антител. Качество иммунофлуоресцентного сигнала сильно зависит от характеристик антитела, и несколько антитела должны быть проверены, когда это возможно. Эпитоп разоблачение выполняется один раз перед иммунофлюоресценции улучшить как обнаружение белка и ДНК-FISH. Чтобы сохранить иммунофлюоресценции сигнал на образце во время процедуры ДНК-FISH необходимо COValently связать его с ткани. Мы приведем здесь два подхода, которые обеспечили хорошие результаты в наших руках, антитела после фиксации и tyramide обоснованное выявление (см. шаг 8.5). Выбор должен быть обусловлен предварительных испытаний для каждой пары цель / антител.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    1X PBS, содержащем 3% нормальной козьей сывороткой (NGS).
    2% PFA в 1x PBS (разведение от 4% раствора)
  2. В день 1, первые шаги идентичны ДНК-FISH, до разоблачения шаг (шаги 6.1-6.2).
  3. После демаскируя, инкубировать секции с 1X PBS, содержащем 3% NGS в течение 1 часа.
  4. Инкубировать с первичным антителом, разведенным в 1х PBS, содержащем 3% NGS в течение 24 часов. Нижняя Инкубационный период может быть использован, чтобы сократить протокол, хотя мы обнаружили, что инкубации в течение ночи, как правило, приводит к более сильным сигналом. До 48-72 ч инкубации может потребоваться для низкое сродство первичных антител, таких как IgM.
  5. В день2, мыть 3x 10 мин с 1x PBS.
  6. Протокол с антителом после фиксации: Инкубируют 1 час с вторичным антителом в сочетании с зеленым флуоресцентным красителем, на 1/200 в 1 × PBS, содержащем 3% NGS. Вымойте три раза 10 мин с 1x PBS. После фиксация осуществляется с помощью 2% PFA в 1x PBS в течение 10 мин *. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Протокол с обнаружением TSA: инкубировать 1 час с HRP-в сочетании вторичным антителом на 1/250 в 1x PBS, содержащего 3% NGS. Вымойте три раза 10 мин с 1x PBS. Продолжайте обнаружения tyramide в соответствии с инструкциями производителя. Как было указано выше (этап 7.9), разбавление реагентов и времени реакции должны быть определены эмпирически. В большинстве случаев, наш протокол был основан на разведении 1/500 флуоресцентного субстрата и 10 мин времени реакции. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Примечание *: Сообщение-фиксация является важным шагом в иммуно-FISH, и требует тщательного настройку. Чем сильнее после фиксациилучше сигнал ПЧ, и тем ниже эффективность ДНК-FISH.
  7. Продолжайте ДНК-FISH со стадии кислоты метанол-уксусная (шаг 6.3). Продолжительность иммуно-ДНК-FISH, как правило, 3 дня, с первого антитела инкубировали в течение ночи.

9. Двойной ДНК-РНК FISH В сочетании с иммунофлуоресценции

См. рисунок 1, оранжевые ящики для обзора.

РНК-РЫБА выполняется в первую очередь, а затем иммунофлюоресценции, и, наконец, ДНК-FISH. Если иммунофлюоресценции обнаруживается реакции tyramide, он является ключевым, чтобы утолить полностью деятельность HRP на стадии РНК-FISH с Н 2 О 2, и чтобы убедиться, что тушение эффективно. Это делается с помощью одного слайда в качестве контроля "нет первичного антитела".

Поскольку этанол на основе обезвоживание является вредным для некоторых белков растворителей чувствительны, этот шаг РНК-FISH может ингибировать иммунофлюоресценции. Если это так, РНК-FISH может быть выполнена WIth альтернативный протокол, как описано ниже в stpe 9,3.

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    50% формамида в 1х PBS, содержащем 2 мМ РВК
  2. В день 1, подготовить РНК-FISH зонд и выполните для двойного РНК-FISH, до H 2 O 2 тушение шага (шаг 7.2).
  3. Случай 1, окрашивание иммунофлюоресценции работает после этанола обезвоживания: продолжить РНК-FISH, как указано выше в шагах 7,3-7,9. Затем переходите к шагу 9.6 ниже.
  4. Случай 2, окрашивание иммунофлюоресценции предотвращается путем обработки этанолом: Поместите слайды в увлажненной камере на слайд нагревател, установленного на 65 ° С и выдержать в течение 1,5 ч в прегибридизационным раствором, содержащем 50% формамид, 1X PBS и 2 мМ РВК. Слейте Предгибридизацию решение и падение 80 мкл раствора гибридизации, как указано в пунктах 7.4 и 7.5. Затем переходите с РНК-FISH-гибридизации и обнаружения, как указано Абовэ с шагом 7,6-7,9 (день 2 и 3).
  5. На 2-й день, после РНК-FISH завершена, приступить к иммуно-ДНК-FISH начиная с разоблачительной стадии (см. шаг 6.2). Затем выполните протокол иммуно-ДНК-FISH, как указано выше в шагах 8,2-8,6.

10. Презентация Монтаж и обработка изображений

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    Hoechst 33342 на 0,5 мкг / мл в 1 × PBS
  2. Пятно ядра в течение 10 минут с DAPI или Hoechst 33342 * в 0,5 мкг / мл в 1x PBS в течение 10 мин. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Примечание *:. Внимание Если одна из систем обнаружения использует флуоресцентные синий краситель, не используйте DAPI или Hoechst. Вместо этого используйте флуоресцентные красители ДНК с спектров излучения в дальней красной волны, таких как Topro3.
  3. Слейте столько жидкости, как можно дальше от слайда. Оставьте 80 мкл монтажной среды, содержащие antifading агента на одном конце слайда. Покройте участки с высоким оптическим качествомпокровное (№ 1,5 стакана). Пусть покровное спуститься медленно, поддерживая его на одном конце щипцами, с тем чтобы позволить монтажную среду спред разделе без пузырьков.
  4. Печать с лаком для ногтей и хранить при температуре 4 ° С в темном поле слайда.
  5. Прямое наблюдение ДНК-FISH сигнала латентных HSV-1 геномов требует 40X или большем увеличении масло погружения цели, с высокой числовой апертурой (например 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) и источник света возбуждения по крайней мере, эквивалентно 100 Вт ртутной лампы. Мы советуем с помощью микроскопа передачи высокой эффективности, такие как те, которые предусмотрены производителей в последние 5 лет (см. таблицу оборудования). Конфокальной микроскопии предоставляет инструменты для сбора изображений с низкой фоне из-за автофлуоресценции ткани, такие как тонкий срезов или спектральных изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После нескольких месяцев тщательного тестирования, мы обнаружили, что на основе термической химической разоблачение сделал скрытая ВПГ-1 геном доступны для люминесцентных в гибридизация. В процессе, мы попробовали различные разоблачения процедуры, и только тепловые основе лечения (то есть нагревание разделы до температуры суб-кипения в микроволновой печи) оказался верным. Затем мы протестировали несколько буферов соли, которые обычно используются в иммуногистохимии (IHC) и электронной микроскопии для п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь позволяет обнаружить ВПГ-1 латентной генома в нейронах мыши секциях нервной ткани. Наше понимание путей регуляции экспрессии вирусного гена была ограничена отсутствием метода для выявления ВПГ-1 геномной ДНК на месте внутри нейронов тканей. Информация о генома числа копий и доля инфицированных нейронов пришли в основном из ПЦР-анализа на диссоциированных нейронов 11,12. В выяснении роли ядерной архитектуры хост-клеток на HSV-1 задержки, мы устанавливаем для определения локал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Н. Sawtell (Hospital Medical Center Цинциннати Детская, Цинциннати, Огайо, США), С. Efstathiou (Кембриджский университет, Великобритания) и Джеймс Хилл (ЛГУ Health Sciences Center, Новый Орлеан, США) за предоставление образцов из ВПГ-1 -инфицированных мышей и кроликов, соответственно, и для реагентов; Х. Масумото (Kazusa НИИ ДНК, Чиба, Япония) и С. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Гренобль, Франция) за полезные обсуждения.

Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального центра де-ла-Научных Исследований (CNRS) (программа ATIP, к ЛП, http://www.cnrs.fr), Национальное агентство исследований Французский (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), FINOVI Фонд ( http://www.finovi.org/:fr:start ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) из Университете Лиона, в рамках программы "Investissemenц d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) управляется ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association Pour La Recherche Контр ле Рак (АРК-7979 и ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), ла Лига Nationale Контр ле Рак (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), и инков (программа EPIPRO, http://www.e -cancer.fr ). ФК и ЛП CNRS исследователи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Balb/c мышиJanvier, France6-недельные самки
штаммы ВПГ-1штамма SC16 (дикий тип)См. Labetoule, M. et al. Invest. Офтальмол. Vis. Sci 44, 217– 225 (2003) для получения подробной информации о штамме ВПГ-1 и подготовке вирусного фонда.
Кетамина гидрохлоридSigmaK2753Внутрибрюшинное введение раствора, содержащего Кетамин (100мг/кг) и Ксилазин (10мг/кг)
Ксилазина гидрохлоридSigmaX1251
Параформальдегид (PFA)Sigma158127Суспензировать 4 г PFA в 90 мл воды. Прибавьте 50 и микро; 1N NaOH и нагрев при 60°С; С на водяной бане с перемешиванием. PFA растворяется примерно за 30 минут. Добавьте 10 мл 10x PBS. Этот раствор можно приготовить заранее и хранить при -20°С; C в пробирках по 5 мл. Осторожность. Манипуляции под вытяжным шкафом.
физиологический растворSigma07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7,4 (стерильный)Life Technologies10010-015 
СахарозаSigma84100Приготовьте 20% раствор сахарозы в 1x PBS.
Криосекционная среда для встраивания - Tissue-Tek OCT CompoundSAKURA4583 
Набор для очистки ДНК большого вектораQiagen12462Для очистки космида или BAC вектора, содержащего геном ВПГ-1, и хранения при температуре -20 °°С; C
Nick переводческий комплектRoche Applied Sciences10 976 776 001 
Cy3-dCTPGE HealthcarePA53021Защита от света
0,5 М ЭДТАSigmaE6758 
G50 Мини вращающаяся колоннаGE Healthcare27-5330-01 
ДНК спермы лосося 10 мг/млInvitrogen Life Technologies15632-011 
Этанол молекулярная биология маркиSigma87047Приготовьте 70% раствор
спермы лосося ДНКInvitrogen Life Technologies15632-011 
Формамид Молекулярная биология классаSigmaF9037Осторожно. Манипулируйте под вытяжным шкафом.
Биотинилированный промышленный зонд HSV-1 Энцо Медико-биологические наукиENZ-40838 
Гидрофобная ручка ImmEdgeVector LaboratoriesH-4000 
20x Цитрат солевого раствора натрия (SSC)SigmaS6639Приготовьте 2x раствор SSC в ddH20.
Triton X-100SigmaT8787Приготовьте 10% исходный раствор в воде и храните при температуре +4 °C. Приготовьте 0,5% раствор в 1x PBS непосредственно перед использованием.
10 мМ цитрата натрия pH 6,0SigmaS1804Приготовьте 100 мМ стоковый раствор (10x). Весить 10,5 г лимонной кислоты (MW 210.14). Осторожно, раздражителен и токсичен, надевайте соответствующую маску и перчатки) и растворите в 400 мл воды. Отрегулируйте pH на уровне 6,0 с помощью 1 N NaOH (осторожно, раздражающий, надевайте перчатки). Доведите до 500 мл с помощью дистиллированной воды. Перед использованием разбавьте в 10 раз дистиллированную воду.
Уксусная кислотаSigma320099 
Метанол, молекулярная биология маркиSigma322415 
Сульфат декстрана - 500 000 МВтEuromedexEU0606-A 
Решение Денхардта (100x)Euromedex1020-A 
Резиновый цемент "FixoGum"Марабут290110000&nbsp;
Набор для очистки ДНК  - Набор для очистки ПЦР QiaquickQiagen28104 
T7 in vitro набор для транскрипцииAmbion Life TechnologiesAM1314 
Биотин-16-УТПRoche Прикладные науки11388908910 
Миниколонка для очистки РНКQiagen73404 
Рибонуклеозид ванадиловый комплексНовая Англия БиолабсS1402S 
H2O2SigmaH3410Приготовьте 3% раствор в дистиллированной воде. Хранить при +4 °deg; C и беречь от света.
Дрожжевая тРНКInvitrogen15401011приготовить раствор 10 мг/мл в свободной РНКазе воде
Normal GoatSerum InvitrogenPCN5000 
Первичные антителалюбого поставщикаВ разделе результатов были использованы следующие первичные антитела: антимышиные CENP-A (кролик mAb C51A7, Cell Signaling Technologies) и анти-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Вторичные флуоресцентные антителаInvitrogen Life TechnologiesФлуоресцентные вторичные антитела, обычно используемые в нашем протоколе, представляют собой меченые Alexa Fluor козьи антитела (IgG H+L). Антитело, используемое в разделе результатов, представляет собой антитело против козы кролика, лабализированное с помощью Alexa Fluor 488 (артикул A11001)
Набор для усиления сигнала тирамида (TSA) - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (синяя флуоресценция)Invitrogen Life Technologies#T20937наборы TSA также доступны из набора Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (зеленая флуоресценция)Invitrogen Life Technologies#T20932
Hoechst 33342Invitrogen Life TechnologiesH3570Приготовьте 0,5 & микро; г/мл раствора в 1x PBS непосредственно перед применением. Выбросьте оставшийся раствор.
Покровное стекло 22 мм x 50 мм. N&DEG; 1,5 стеклаЭлектронная микроскопия наук72204-04 
Монтажный материал с антивыцветающим веществом - VECASHIELDVector LaboratoriesH-1000Еще один традиционный продукт - Fluoromount G от Electron Microscopy Science
Superfrost стеклянные стеклаFisherScientific12-550-15 
Оборудование/Материал КомпанияСправочнаяинформация
Игла для инфекцииСтеклянная микропипетка горячего вытяжения. На заказ.
Оборудование для рассеченияМориа, ФранцияМикрохирургические ножницы и щипцы
Перистальтический насосCole Palmer InstrumentsEasyload Masterflex
Микрошприцевой насос (Nano Pump)kdScientificKDS310 
КриостатLeica FranceCM 1510-1 
-80 °°°; C морозильная камераSanyoUltra Low -80 &dg; C
Бытовая микроволновая печь 
Нагреватель сухих блоковEppendorf 022670204 
Инкубатор Горный ровBoekel Scientific240000 
Coplin JarDominique Dutscher68512 
Тара для витражного стеклаDominique Dutscher68506 
Флуоресцентный микроскопZeissИзображения, представленные в разделе результатов, были получены с помощью Zeiss AxioObserver с объективом 40X LD NeoFluor N.A 0.6 и 100X PlanApochromat N.A 1.3. Набор фильтров #38, #43 и #43. Источник флуоресцентного света HXP 120. Фотометрическая ПЗС-камера CoolSNAP HQ2. Сигнал будет легче наблюдать на современных высокоэффективных микроскопах, таких как серии Zeiss AxioImager/AxioObserver, серии Nikon Ti-E/Ni-E или Leica DM/DMI6000 серии

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HSV 1 DetectionNeuronal Tissue AnalysisTrigeminal Ganglion SectioningHeat Based Antigen UnmaskingDNA RNA Protein Triple StainingConfocal Microscopy ImagingViral Genome LocalizationLatent Virus DetectionSingle Cell Codetection

Похожие статьи