Методическая статья

Дизайн и анализ поведения предпочтения температуры и его циркадный ритм в Drosophila

DOI:

10.3791/51097

⸱

13 января 2014 г.

 ,  , 
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно мы определили роман Drosophila циркадный выход, ритм предпочтения температуры (TPR), в котором предпочтительная температура у мух поднимается в течение дня и падает в ночное время. TPR регулируется независимо от другого циркадного производства, локомотивной деятельности. Здесь мы описываем дизайн и анализ TPR в Drosophila.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркадные часы регулируют многие аспекты жизни, в том числе сон, локомотивной активности, и температура тела (BTR)ритмы 1,2. Недавно мы определили роман Drosophila циркадный выход, называемый ритм предпочтения температуры (TPR), в котором предпочтительная температура у мух поднимается в течение дня и падает в течение ночи 3. Удивительно, но активность TPR и локомотива контролируется с помощью различных циркадных нейронов3. Дрозофила локомотивной деятельности является хорошо известным циркадных поведенческих выход и предоставил сильный вклад в открытие многих консервативных млекопитающих циркадных генов часов имеханизмов 4. Поэтому понимание ТПР приведет к выявлению до сих пор неизвестных молекулярных и клеточных циркадных механизмов. Здесь мы описываем, как выполнять и анализировать анализ TPR. Этот метод не только позволяет рассекать молекулярные и нервные механизмы TPR, но и дает новое представление о фундаментальных механизмах функций мозга, которые интегрируют различные экологические сигналы и регулируют поведение животных. Кроме того, наши недавно опубликованные данные свидетельствуют о том, что муха TPR разделяет особенности с млекопитающим BTR3. Дрозофила являются эктотермы, в которых температура тела, как правило, поведенчески регулируется. Таким образом, TPR является стратегия, используемая для создания ритмичной температуры тела в этихмух 5-8. Мы считаем, что дальнейшее исследование Drosophila TPR облегчит характеристику механизмов, лежащих в основе контроля температуры тела у животных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Температура является вездесущим экологическим сигналом. Звери проявляют различные виды поведения, чтобы избежать вредных температур и искать удобные. Drosophila демонстрируют надежное поведение предпочтения температуры6,7. Когда мухи высвобождаются в температурный градиент от 18-32 градусов по Цельсию, мухи избегают как теплых, так и холодных температур и, наконец, выбирают предпочтительную температуру 25 градусов поЦельсию утром 3. Датчики теплой температуры являются набор термосенсорных нейронов, ак нейронов, которые выражают Drosophila преходящих рецепторов потенциал (TPR) канал, TRPA16,9. Датчики холодной температуры расположены в 3-м сегменте антенны, так как ablating 3-й сегмент антенны вызывает отсутствие холодной температуры избегания6. Недавно был выявлен белок TRPP Brivido (Brv)10. Так как Brv выражается в 3-м сегменте антенны и опосредует обнаружение холода, Brv является возможной молекулой холодного зондирования, которая имеет решающее значение для поведения предпочтения температуры. В общем, мухи используют эти два датчика температуры, чтобы избежать теплых и холодных температур и найти предпочтительную температуру.

В то время как млекопитающие генерируют тепло для регулирования температуры тела, эктотермы обычно адаптируют температуру тела к температуре окружающейсреды 11. Некоторые эктотермы, как известно, демонстрируют ежедневное поведение TPR, который, как полагают, является стратегией для эктотерм для регулирования их BTR12. Чтобы определить, продемонстрировали ли мухи TPR, мы повторили поведенческий анализ температурных предпочтений в различных точках в течение 24 часов. Мы обнаружили, что Drosophila экспонат ежедневно TPR, который является низким утром и высоко вечером и следует шаблону, аналогичной BTR улюдей 13.

В Drosophila, Есть 150 часов нейронов в головном мозге. Нейроны часов, регулирующие активность локомотивов, называются осцилляторами M и E. Однако, что интересно, осцилляторы M и E не регулируют TPR, вместо этого, мы показали, что DN2 часовые нейроны в головном мозге регулируют TPR, но не локомотивную активность. Эти данные указывают на то, что TPR регулируется независимо от деятельности локомотива. Примечательно, что БТР млекопитающих также самостоятельно регулируется от локомотивной деятельности. Абляционные исследования на крысах показывают, что БТР контролируется с помощью конкретных нейронов SCN, которые нацелены на другой подмножество нейронов подпаравентрикулярной зоны, чем те, которые контролируют активностьлокомотивов 14. Таким образом, наши данные рассматривают возможность того, что млекопитающие БТР и муха TPR эволюционносохраняется 3, так как и летать TPR и млекопитающих БТР экспонат циркадных часов зависимых температурных ритмов, которые независимо регулируются от локомотивной активности.

Здесь мы описываем детали того, как проанализировать TPR поведенческий анализ в Drosophila. Этот метод позволяет изузнать не только молекулярный механизм и нейронные цепи TPR, но и то, как мозг интегрирует различные экологические сигналы и внутренние биологические часы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка мух

  1. Светлые темные (LD) Эксперименты
    1. Поднимите мух в инкубаторах (25 градусов по Цельсию/40-60%относительной влажности (RH)) при свете 12 часов/темные 12 часов (LD) циклов. Интенсивность света инкубаторов составляет 500-1000 евро люкс.
    2. Два инкубатора необходимы для завершения анализа поведения в течение 24 часов. Оба инкубатора должны иметь программируемый свет с функциями ON OFF. Они также должны иметь прочные двери, которые не проницаемы для света(т.е. без стекла или плексигласа).
      Примечание: Один инкубатор должен быть назначен "дневным" инкубатором и установлен на цикл LD 12 часов света и 12 часов темноты. Второй инкубатор должен быть назначен "ночной" инкубатор и установить на обратный первый с 12 часов темноты следуют 12 часов света. Ночной инкубатор должен быть помещен в комнату, доступную в темноте, таким образом мухи испытывают ночные условия могут быть легко доступны для экспериментов.
    3. Поместите флаконы мухи в дневные или ночные инкубаторы. Собирайте вылупившихся мух в свежем флаконе, 20-30 за анализ и держите в том же инкубаторе 2-3 дня.
    4. Через 2-3 дня используйте мухи для поведенческого анализа температурных предпочтений.
      1. В течение дня (время времени Зейтгебера (ЗТ) 0-12) эксперименты, собирать мух из дневного инкубатора.
      2. Прямо перед поведенческими экспериментами, возьмите собранные флаконы мухи из инкубатора дня.
      3. На ночь (ЗТ 13-24) экспериментирует, собирает мух из ночного инкубатора.
      4. Прямо перед поведенческими экспериментами вынёт собранные флаконы из ночного инкубатора, заверните алюминиевой фольгой и поместите в коробку в темной комнате под красную лампу.
        Примечание: Поскольку поведенческий анализ температурных предпочтений проводится в темноте для ночных экспериментов, воздействие света на мух должно быть предотвращено до конца поведенческих экспериментов.
        Примечание: Мухи не должны подвергаться воздействию двуокиси углерода в день, когда должны состояться эксперименты.
  2. Эксперименты постоянной тьмы (DD)
    1. День ДД
      1. Дополнительный инкубатор необходим для дневных экспериментов ДД, которые мы называем «переходным» инкубатором для остальной части рукописи. Переходный инкубатор должен быть помещен в комнату, доступную в темноте, таким образом, мухи, испытывающие условия DD, могут быть легко доступны для экспериментов. Пример светового графика для переходного инкубатора будет иметь свет ON с 13:00 до 19:00 и свет OFF в 19:00-13 вечера(рисунок 1).
      2. Соберите мух, которые были подняты в дневном инкубаторе. Поместите флаконы мух в переходный инкубатор между 13:00-7 вечера, когда свет ON. Таким образом, мухи должным образом подвергаются воздействию света до 7 вечера, в это время свет выключается OFF.
      3. На следующий день, до 13:00, в темных условиях вынюхайте флаконы из переходного инкубатора, заверните их алюминиевой фольгой и поместите в коробку. Храните коробку в любом инкубаторе еще один день.
    2. DD Ночь
      1. Соберите мух, которые были подняты в ночном инкубаторе в темноте под красной лампой. Или дополнительно собирать мух, когда свет ночного инкубатора ON.
      2. Оберните собранные флаконы с алюминиевой фольгой в темноте в любое время огни OFF и поместите флаконы в коробку. Храните коробку в любом инкубаторе еще два дня(рисунок 1B).
        Примечание: Поскольку поведенческий анализ температурных предпочтений проводится в темноте для ночных экспериментов, воздействие света на мух должно быть предотвращено до конца поведенческих экспериментов.
  3. Эксперименты с постоянным светом (LL)
    1. Ll день
      1. Дополнительный инкубатор необходим для дневных экспериментов LL. Этот инкубатор поддерживает состояние LL (25 градусов по Цельсию, 800 люкс), со светом ON непрерывно.
      2. Собирайте мух, которые были подняты в дневном инкубаторе. Поместите флаконы мух в инкубатор LL в любое время во время их "дня".
    2. LL Ночь
      1. Собирайте мух, которые были подняты в ночном инкубаторе. Передача флаконов мухи из ночного инкубатора в инкубатор LL во время света в ночном инкубаторе ON.
        Примечание: Например, свет выключается в 7 утра в ночном инкубаторе. Перенесите флаконы с ночного инкубатора в инкубатор LL до 7 утра и держите флаконы в инкубаторе LL еще 4 дня.
        Примечание: В день 4 в условиях LL, колебания активности локомотиваотменено 15,16, в то время как TPR по-прежнему поддерживается 3.

2. Аппарат для поведенческого анализа предпочтений температуры

  1. Поместите крышку из плексигласа (29 см х 19,2см) (рисунок 4)на алюминиевую пластину.
  2. Мониторинг температуры воздуха между пластиной и крышкой. Шесть температурных зондов прикрепляются в различных положениях на внутренней стороне крышки в пределах одной из полос движения(рисунок 2).
    Примечание: Убедитесь, что зонды не касаются ни алюминиевой пластины, ни крышки плексигласа. Температура воздуха должна быть установлена в градиенте от 18-32 градусов по Цельсию.
  3. Поместите аппарат в экологическое помещение при 25 градусах по Цельсию/65-75% RH. Эта комната должна быть закрыта от любого внешнего света. Экологическая комната обычно оборудована вентиляторами для поддержания определенной температуры и влажности.
    Примечание: Воздух из вентилятора, вероятно, нарушает стабильный градиент температуры на аппарате. Чтобы предотвратить это, мы используем прозрачный лист, который охватывает область, окружающую аппарат.
  4. Подготовьте термометр и гигрометр, чтобы проверить температуру и влажность в экологической комнате.
    Примечание: Свет влияет на температурные предпочтения Drosophila3. Такая же интенсивность света должна поставляться на аппарат равномерно. Интенсивность наших экологических огней комнате составляет 800 фунтов стерлингов люкс.
    Примечание: Когда поведенческие эксперименты будут сделаны, поместите трубку,соединенную с резервуаром CO 2 или поставку вблизи отверстия верхней части аппарата для того, чтобы анестезировать и избавиться от мух.

3. Подготовка аппарата к использованию

  1. Включите аппарат в течение не менее 30 минут, чтобы правильно установить температурный градиент на поверхности пластины(рисунок 3).
  2. Пальто крышку аппарата поведения с водоотталкивающим, чтобы предотвратить мух от восхождения стены или потолок крышки. Протрите излишки водоотталкивающего и оставьте крышку на 25-30 минут, чтобы высохнуть.
  3. Удалите конденсат на алюминиевой пластине. Поместите крышку плексигласа на алюминиевую пластину и закрещив с шестью C-зажимами(рисунок 2).
    Примечание: Очень важно, чтобы крышка была хорошо запечатана, при необходимости может быть использована двойная палка.
  4. Оставьте крышку, по крайней мере 15 мин. Градиент температуры воздуха между алюминиевой пластиной и крышкой создается от 18-32 градусов по Цельсию.

4. Анализ предпочтений температуры поведения

  1. Загрузите мух в пространство между алюминиевой пластиной и плексигласовой крышкой аппарата через небольшие отверстия в центре каждой полосы покрытия(рисунки 2 и 4). Обложка отверстия с крышкой скользит, чтобы предотвратить мух от побега.
  2. Для темных условий, выключите все огни в экологической комнате. Красная лампа может быть использована, когда мухи помещаются в аппарат. Убедитесь, что мухи не подвергаются воздействию каких-либо огней, за исключением красной лампы, пока поведенческие эксперименты не будут сделаны.
  3. Для каждого испытания используйте 20-25 взрослых мух, которые не должны использоваться повторно в последующих испытаниях. Поведенческий анализ проводится в течение 30 минут. Сделай несколько фотографий с или без вспышки. Будьте осторожны, чтобы не сделать много шума или каких-либо резких движений во время экспериментов.
  4. Замехать температуру всех шести зондов на аппарате. Обратите внимание на комнатную температуру, а также влажность.
  5. Обезболивать мух в аппарате углекислым газом, ослабить зажимы, удалить крышку плексигласа, и удалить мух из пластины. После каждого эксперимента мухи отбрасываются. Протрите конденсат или влагу с тарелки. Замените крышку на пластине и затяните зажимами в рамках подготовки к следующему эксперименту.
  6. Для того, чтобы иметь представление о температурных предпочтениях в течение всего дня, 24-часовой период делится на восемь часовых поясов, четыре в течение дня и четыре ночью. Например, мы используем эти ЗТ или КТ 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 и 22-24.
    Примечание: Поскольку фенотипные вариации, вызванные эффектами маскировки, ожидаются сразу после того, как свет включен (ЗТ0) или OFF (ЗТ12), мы не исследуем поведение предпочтения температуры в это время (ЗТ или КТ 0-1, 11,5-13 и 23,5-24). По крайней мере пять испытаний должны быть сделаны в каждом часовом поясе для того, чтобы результаты были статистически обоснованными.

5. Анализ данных

  1. Рассчитайте градиент температуры следующим образом: Определите, где расположены температурные зонды на основе двух рядов, которые расположены на верхней и нижней стороне крышки плексигласа покраям (рисунок 2A).
  2. Температурный градиент между температурными зондами оценивается как линейный. Основываясь на расположении температурных зондов, а также на соответствующих зарегистрированных температурах, рисуйте линии, представляющие каждую степень температуры в соответствующем положении на снимках. Подсчитайте количество мух, расположенных в каждом интервале градуса. Исключите любые мухи на стенах или потолке крышки.
  3. Рассчитайте процент мух в каждом температурном диапазоне каждой полосы движения. Средняя предпочтительная температура рассчитывается путем суммирования процентной доли мух и температуры каждого интервала, как показано ниже:
    % мух х 18,5 кк х % мух х 19,5 кк й % мух х 20,5 "C ...." % мух х 31,5 КК % от мух х 32,5 С.
  4. Рассчитайте среднюю предпочтительную температуру в каждом часовом поясе: поведение предпочтения температуры выполняется >5 раз в каждом часовом поясе (ЗТ 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 и 22-24). Для расчета средней предпочтительной температуры в каждом часовом поясе средняя предпочтительная температура каждого испытания усредовылась вместе. Бары ошибок .m s.e. равны погрешности между испытаниями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример ритма температурных предпочтений показан на рисунке 5. Если процедура поведения успешно выполнена, мухи должны проявлять TPR, в котором они предпочитают низкую температуру утром и более высокую температуру в вечернее время. Увеличение на 1-1,5 градуса по Цельсию в дневное время в температурных предпочтениях следует наблюдать в течение дня, независимо от генетического фона, так как мы показали, что w1118, yw и Canton S мухи демонстрируют аналогичные предпочтени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы иллюстристрм детали поведенческих предпочтений температуры аппарата и анализ поведения TPR. Drosophila демонстрируют основные, надежные и воспроизводимые особенности тактовой TPR. Тем не менее, наши данные показывают, что по крайней мере два фактора, окружающий свет и возраст, значительно нарушают TPR поведенческих фенотипов.

Мы наблюдаем, что свет значительно влияет на температурные предпочтения в Drosophila. Это согласуется с тем фактом, что w1118 мух хран...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны докторам Аравинтхану Сэмюэлю и Марку Гершоу, которые помогли разработать начальную версию поведенческого аппарата, и Мэтью Бати, который модифицировал поведенческий аппарат. Это исследование было поддержано попечителем Грант из Цинциннати Детская больница, JST / PRESTO, Марш Dimes и NIH R01 GM107582 в F.N.H.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bright Lab Jr. SafelightAmazon#B00013J8UYКрасный свет для темных помещений
Дождь XПродуктыВодоотталкивающие средства: Нанесите покрытие из плексигласа
C-ClampHome Depot
Температура/гигрометрFisher15-077-963
Устройства ПельтьеTE Technology, Inc.HP-127-1.4-1.15-71P
ТермометрFlukeFluke 52II
Настольный контроллерOven Industries5R6-570-15R и 5R6-570-24R
Датчик температуры Датчик температурыOven IndustriesTR67-32
Generic 480 Вт ATX блокохлаждения
MCR220-QP-RES Dual 120 мм Радиатор с резервуаром охлаждения компьютераSwiftech
MCP350 Встроенный насос постоянного тока 12 Вохлаждения компьютераSwiftech
компьютера MCW50 Жидкостный кулер видеокартыохлаждения компьютераSwiftech
Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH вентилятор Scythe Kaze-Jyuniохлаждения компьютераCrazy PC
SOPUS питания компьютера система Система Система Система охлаждения Система Система

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
  2. Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
  3. Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
  4. Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
  5. Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
  6. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  7. Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
  8. Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. Review: Thermal preference in Drosophila. J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).
  9. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and. Nature. 423, 822-823 (2003).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
  11. Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
  12. Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
  13. Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
  14. Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
  15. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  16. Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
  17. Crocker, A., Sehgal, A. Genetic analysis of sleep. Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).
  18. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  19. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
  20. Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila

Похожие статьи