Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рассечение

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51118

⸱

4 марта 2014 г.

 , 
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как препарировать премиграторных черепной нервный гребень (NC) от Xenopus Laevis neurulas. Эти экспланты можно покрыть на фибронектине и культивировали в пробирке, или привиты обратно в эмбрионы хозяев. Этот метод позволяет изучать механизмы НК эпителий-в-мезенхимы перехода, миграции и дифференциации.

Аннотация

Нервного гребня (NC) является переходным население спинной нервной трубки клетка, которая подвергается переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) в конце нейруляции, мигрирует широко к различным органам и дифференцируется в многих видов производных (нейроны, глиальные, хрящи и кости, пигментные и эндокринные клетки). В этом протоколе, мы опишем, как рассекают премиграторных черепной NC из эмбрионов Laevis Xenopus, с целью изучения развития NC в естественных условиях и в пробирке. Лягушка модель имеет много преимуществ для изучения раннего развития; обильные партии имеются, эмбрионы развиваются быстро, в естественных условиях усиления и потеря стратегий функциональных позволяют манипуляции экспрессии генов до NC вскрытия в донора и / или эмбрионов хозяев. Эксплантаты NC можно покрыть на фибронектине и используется для исследований в пробирке. Они могут быть культивированы в течение нескольких дней в бессывороточной среде. Мы также описать, как привить ЧПУ эксплантов назадв эмбрионы принимающих для изучения NC миграцию и дифференцировку в естественных условиях.

Введение

Нервного гребня (NC) является переходным эмбриональных клеточная популяция, которая возникает из нервной трубки в конце нейруляции у эмбрионов позвоночных. События сигнализации и генетические, которые контролируют спецификации NC начаться уже в гаструляции. NC задается на границе между нервной и не-нейральной эктодермы по сигналам от окружающих спинной тканей. В конце нейруляции, NC клетки пройти переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) и мигрируют широко в зародыше следующее стереотипных маршрутов, отвечая на окружающих руководящие сигналы. После того, как они достигли своего конечного пункта назначения, они дифференцируются в широкий спектр производных, например нейронов, глии, кости, хрящи и пигментных клеток 1-5. Из-за их вклад в многих типах клеток и эмбриональных тканей, дефектов на любом этапе НК развития клеток, от индукции до конечной дифференциации, может вызвать врожденные синдромы названные neurocristopathies 6. Experimental манипуляции с развивающейся NC на разных стадиях - Спецификация, ЕМТ, миграции и дифференцировки - улучшит наше понимание neurocristopathies и позволяют дизайн потенциальных терапевтических стратегий.

Xenopus Laevis эмбрион является моделью выбора для изучения развития ЧПУ. Большое количество эмбрионов легко получить, и внешний оплодотворение дает доступ к самых первых шагов развития. Многие инструменты доступны для экспериментально манипулировать X. Laevis эмбрионального развития. Джин усиления из-функции и нокдаун легко выполнить с помощью microinjecting отдельные клетки ранних Бластулы. Эмбриональные ткани можно вырезать для реассоциации в пробирке 7-11 или обратно-прививки анализов 12,13.

В этом протоколе, мы опишем, как рассекать из премиграторных черепной NC в X. Laevis поздно neurulas, до ​​миграции. Эти экспланты можно культивировать на фибронектина-Coateд пластины для изучения миграции и дифференциации в контролируемых в пробирке экспериментальных условиях. NC экспланты также могут быть привиты в нормальных или манипулировать эмбрионов принимающих изучать их миграции и дифференциации в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты соответствовать государственным и европейских правилах, касающихся защиты животных, используемых для научных целей и с международно установленных принципов замены, сокращения и уточнения.

1. Подготовка Фибронектин покрытием блюда 14

  1. Пипетка 500 мл 10 мг / мл культуральной класса фибронектина, разведенного в 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в стандартной пластиковой чашке Петри (диаметр 40 х 11 мм). Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Примечание: при использовании стеклянной посуды или покровные стекла для последующего изображений, использовать 100 мг / мл фибронектина решение.
  2. Промыть три раза 1х PBS.
  3. Заменить PBS 500 мл 1x PBS с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
  4. Промыть три раза 1х PBS.
  5. Залейте 1x PBS и держать при температуре 4 ° С до использования (обычно в течение 24-48 часов).

2. Вскрытие ЧПУ эксплантов

<ол>
  • Подготовка 3/4 Обычный Амфибия Средний (NAM) (110 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ Ca (NO 3) 2, 1 мМ MgSO 4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 мг / мл гентамицин 10,15). Не держите более 1 недели для вскрытия, хранить при температуре 4 ° С. Старые ДН могут быть использованы для подготовки агарозные покрытием рассечение блюда (ниже).
  • Подготовка 60 мм чашки Петри для вскрытия, покрытые 10 мл 2% агарозы в 3/4 ДН.
  • Сбор рассечение инструментов: пластиковые Пипетки Пастера, лучшие насекомых контактный установлен на держателе контактный (см. таблицу материалов ссылка на), в "брови нож" (производства с бровей волос заливали в парафин на кончике стеклянной пипетки Пастера 16), два штрафа рассечение пинцет, P1000 пипетки и наконечники, бинокль стереоскоп с увеличением 8-40X до 50, источник яркого света с оптическими волокнами гидов. Все рассечения инструменты должны содержаться в чистоте, а после каждого эксперимента, промойте их в два раза дистиллированной водой, один раз шй 100% этанола и дайте высохнуть. Хранить в защищенном от пыли.
  • Заполните рассечение блюдо со свежим ДН почти к вершине.
  • Получить X. Laevis эмбрионов соответствии со стандартными процедурами 10 и возрастом их, пока они не достигнут нейрулы этап 16 (в соответствии с Nieuwkoop и Faber таблице 17 развития).
  • Наведите этап 16 эмбрионов в рассечение блюдо, используя пластиковую пипетку Пастера.
  • Провести все последующие шаги в рамках бинокулярного области. Удалить желточной оболочки с двумя парами щипцами. Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной части эмбриона.
  • Подождите, пока эмбрионы не достигли стадии 17, чтобы начать рассечение. Этап 17 является целесообразным, поскольку нервный гребень четко отделены от нервной трубки, в отличие от более ранних стадиях. После стадии 17, Северная Каролина начинает мигрировать и смешиваясь с окружающей мезенхимы.
  • Выкопайте небольшое отверстие в агарозы щипцами, чтобы сделать нишу для эмбрионов в целях поддержанияим во время вскрытия. Поместите один эмбриона спинной стороной вверх. Примечание: моделирование глина может быть использована для поддержания эмбрионов вместо копать яму в агарозы.
  • Сделайте надрез в боковой части передней части нервной раза с бровей ножом и насекомых штифта. Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком глубоко в зародыше: цель, чтобы прорваться через 2-3 слоя клеток (никогда не достигают так глубоко, как архентерона!). Во время всего процесса вскрытия, никогда не позволит рассеченные ткани, чтобы войти в контакт с воздуха и жидкой фаз, так как X. Laevis эмбриональные ткани лизируют поверхностного натяжения.
  • Сделать второй параллельный разрез в более спинной части нервной раз, используя те же самые инструменты.
  • При необходимости, поверните блюдо вокруг 90 °. Сделать третий перпендикулярную разрез с ножом и бровей насекомых штифта, на задней стороне первых двух разрезов. NC представляет собой густую массу клеток под пигментированной наружным слоем эктодермы, боковаяна нервной трубки.
  • Используйте кончик брови ножом отделить пигментированные эктодермы слой из основной штат Северная Каролина, начиная с третьего разреза края.
  • Используйте сторону брови ножом отделить NC ткани, начиная с третьего разреза. NC ткани довольно серо, в то время как в основе головной мезодермы белый. Осторожно отделите NC из мезодермы.
  • Снимите NC ткани спереди от глазного пузыря, и сократить на этом уровне, чтобы освободить эксплантов. В качестве контроля для первых экспериментов, проверка snail2 выражение (канонический NC маркер) в некоторых эксплантов на в гибридизация рекомендуется.

    • 3. Плакировка Экспланты на фибронектине

    1. Принудительная покрытой фибронектином блюдо с модифицированной Danilchick среды (МДМ, NaCl 53 мм, Na2CO 3, 5 мм, К глюконат 4,5 мм, Na глюконат 32 мм, MgSO 4 1 мм, CaCl 2 1 мм, BSA 0,1%, корректировки РН до 8,3 с помощью 1 М Bicine 18).
    2. Трансфер эксплантов в покрытой фибронектином блюдо с использованием P1000 пипетки. Никогда не позволяйте экспланты коснуться интерфейс воздух-жидкость. Во-первых, некоторые жидкости пипеткой в ​​наконечник, то эксплантаты, то некоторые снова жидкость. Не допускайте воздух в наконечник при передаче эксплантов в покрытой фибронектином блюдо. Как только верхушка находится внутри жидкости, покрытой фибронектином блюдо, пусть экспланты медленно спуститься под действием силы тяжести, или нажмите очень мягко. Избегайте слишком быстро извлечения эксплантов.
    3. Поместите 10-30 эксплантов в блюдо с помощью бровей нож. Избегайте стороны блюдо, которые не являются достаточными для последующей визуализации.
    4. Старайтесь не перемещать антенну до экспланты не приложил на фибронектина (она занимает около 15-30 мин). При необходимости перемещения антенны очень тщательно.
    5. Место блюдо в охлажденном инкубатора (между 15-20 ° С, для температуры на высотах см. 17). При помещении при 15 ° С, клетки аре правило миграции эффективно и рассеяния после 6 часов инкубации (это сроки могут варьироваться от экспериментов).

    4. Прививка эксплантов в хост эмбрионов

    1. Вырезать тонкой стеклянной покровное на очень мелкие кусочки, используя грубые щипцы. Размер кусков должно быть приблизительно 1,5 мм 2. Погрузите куски в чашку Петри, содержащую 3/4 NAM или PBS с помощью щипцов.
    2. Подготовка принимающей эмбриона: рассекать из хозяина NC в 3/4 ДН, как описано в пункте 3) с особой тщательностью, чтобы не повредить хоста эмбриона при удалении желточной оболочки и рассекает NC. Ткань напряжение имеет тенденцию к увеличению размера абляции: пусть хозяин эмбрион исцелить частично в то время рассечения доноров эмбрионов.
    3. В другом агарозном покрытием блюдо или в другой части того же самого блюда, рассекать из эксплантов NC от доноров эмбрионов, как описано в Протоколе 3. Передача трансплантата NC в чашку, содержащую хост с осторожностью, как описано вПротокол 3.
    4. Сразу же место эксплантов NC на принимающей абляции области с помощью щипцов. Эксплант должны придавать частично. Положите кусок покровного стекла на привитого эмбриона для поддержания трансплантат на месте. Выберите кусок стекла больше, чем эмбриона, чтобы избежать его повреждения. Эмбрион будет немного сплющенные.
    5. Подождите не менее 15-20 мин, затем аккуратно снимите покровное. Пусть эмбрион восстановить в течение еще 10 мин и осторожно пипеткой его в чистую посуду, заполненную 3/4 ДН, с помощью пластиковой пипетки Пастера.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    При посеве на фибронектина, нервного гребня экспланты быстро прикрепить (15-30 мин) и эксплантат распространяется плоским течение 2 часов (рис. 1А). После 3-6 час клетки начинают разбрасывать. На 24 ч при 15 ° С, многие клетки начали мигрировать от эксплантов (фиг. 1В и 1С). Желток делает клетки очень яркий под фазового контраста (рис. 1В). Сотовые выступы (filopodes и lamellipodes) отчетливо видны после фаллоидина окрашивание цитоскелета актина

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Этот протокол описывает простой метод для эксплантата премиграторных черепной NC в эмбрионах Laevis X.. Эмбрионы, используемые для таких экспериментов должны быть надежными и заживают. Отменить любые партию нездоровых эмбрионов. Кроме того, эмбрионы растут при различных температурах (от 12 до 18-20 ° С), для того, чтобы вырезать нервный гребень на этапе 17, а не позже. После стадии 17, нервный гребень может быть смешан с головной мезодермы и не может быть удалена полностью. Xenopus ткани быстро заживаю...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего раскрывать.

    Благодарности

    Авторы благодарят Adeline Долли для картин эксплантата на фибронектина, Эрик Theveneau за полезные обсуждения и вивария Института Кюри. CM является докторской парень из области Иль-де-Франс (Domaine d'intérêt Majeur стволовых полюс), Universite Paris Sud (атташе Temporaire d'Enseignement др. де Recherche) и Национальное агентство по де-ла-Recherche. Эта работа финансировалась по Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Национального центра де-ла-Научных Исследований (Программа действий Thematique ET Incitative сюр), Ассоциации залить ла Recherche Контр ле Рак Грант SFI20101201882, Лига Контр ле Рак, и Национальное агентство по Recherche (Agence Nationale-де-ла Recherche Программа Блан).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Фибронектин из бычьей плазмыSigmaF4759-1MG
    Бычья сыворотка Альбумин, фракция VEuromedex04-100-811-CБолее низкий сорт качества может быть подходящим для этого применения
    Нержавеющая сталь Булавки от насекомых, размер 000FST26001
    Dumont #5 щипцы 0,05 мм x 0,02 ммFST11252-20

    Ссылки

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Больше статей

    Диссекция нервного гребняэмбрионы Xenopus laevisчашка с фибронектиновым покрытиеммиграция нервного гребняметод трансплантации эмбрионовмаркеры нервного гребнякраниальный нервный гребеньанализ миграции клеток
    Рассечение
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.