Методическая статья

Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска по разработке модели мышей от рака молочной железы Метастазы в головной мозг с последующим продольного МРТ

18.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51146

⸱

6 марта 2014 г.

 , 
1Radiology, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Рак мозга метастазы модель груди мыши устанавливается с ультразвуковой визуализации наведением внутрисердечной инъекции MDA-MB231/Br-GFP клеток. Развитие мультифокальными внутричерепных метастазов была контролироваться продольно использованием высокого разрешения 9.4 T MRI.

Аннотация

Рак молочной железы метастазами в головной мозг, происходящие в 30% больных раком молочной железы на стадии IV, связано с высокой смертностью. Медиана выживаемости составляет всего 6 месяцев. Это важно иметь подходящие животные модели для имитации гемодинамики распространение метастатических клеток в клинической ситуации. Здесь мы представляем использование небольшого ультразвуковых животное, чтобы вести точную инъекцию мозга раковых клеток тропический груди в левый желудочек бестимусных голых мышей. Продольная МРТ используется для оценки внутричерепного инициирование и рост метастазов в головной мозг. Ультразвуковая руководствуясь внутрисердечное впрыска обеспечивает не только точное инъекции и настоящим более высокую успешную ставку, но и значительно снизилась смертность, по сравнению с нашей предыдущей ручной процедуре. В естественных условиях с высоким разрешением МРТ позволяет визуализировать гиперинтенсивным мультифокальными поражений, как малые, как 310 мкм в диаметре на Т 2-взвешенных изображениях на 3 недели после инъекции. Фоллож-до МРТ показывает внутричерепное рост опухоли и увеличение количества метастазов, которые распространяют по всей мозга.

Введение

Мозг метастазы является наиболее распространенным внутричерепное злокачественных опухолей у взрослых. Прогноз крайне бедных, при медиане выживаемости 4-6 месяцев даже с агрессивного лечения. Рак молочной железы является одним из трех основных первичных раковых заболеваний с высокой заболеваемостью метастаза мозга 1-3. Несколько линий рака молочной железы мозга Тропик способны развивать метастазы мозга после внутрисердечной или intracarotid инъекции 4. Прямой впрыск опухолевых клеток в левый желудочек может обойти капиллярное русло легких и тем самым увеличить частоту формирования метастазов в головном мозге при минимизации висцеральные метастазы. MDA-MB231Br линия является одним из наиболее широко используемых человека линий рака молочной железы по развитию мозга метастазы в моделях грызунов 5,6.

Как и многие другие исследования 4,7, мы провели ручную процедуру инъекции внутрисердечной в наших предыдущих исследованиях. Тем не менее, только 50% успеха ставка была получена с руководствомвпрыска и доля мышей умерли от повторных инвазивных процедур, если предыдущие испытания не удалось. Здесь мы представляем использование процедуры обработки изображений наведением, чтобы закрепить инъекцию мозга ищущих раковых клеток молочной железы в левый желудочек бестимусных мышей. Продольная высокое разрешение МРТ применяется следовать внутричерепное развитие метастазов в головной мозг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Техаса Юго-западного медицинского центра.

1. Подготовка клеток MDA-MB231/Br-GFP

  1. Получить и культура клеток MDA-MB231/Br-GFP (любезно предоставленные доктором. Пальмиери и Steeg, NCI) в DMEM среде, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина.
  2. Соблюдайте состояние клеток и цвет среде, и заменить среднего каждые 2-3 дня.
  3. Trypsinize и сбора клеток при 80% слияния будет достигнута, как описано в пунктах 1.3.1-1.3.5:
    1. Удалите старый среду полностью и добавить 5 мл PBS (1x), чтобы промыть клетки мягко. Снимите PBS от блюда.
    2. Добавить 1,5 мл трипсина в блюдо; наклонить блюдо осторожно, чтобы гарантировать, что все клетки покрыты трипсина. Поставьте блюдо обратно в камеру инкубатора и держать его при 37 ° С в течение 1 мин.
    3. Возьмите блюдо из инкубатора и наблюдатьклетки под оптическим микроскопом для обеспечения клетки отделяются от блюда.
    4. Добавить 3 мл среды прекратить действие трипсина. Сбор смеси клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга смеси при 2000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
    5. Осторожно снимите среду и не ресуспендирования клеток в 5 мл бессывороточной среде до получения однородной консистенции.
  4. Всего соответствующее количество клеток и ресуспендируют их в бессывороточной DMEM среде с конечной концентрации 1,75 × 10 5 клеток в 100 мкл объем.
    1. Возьмите 50 смесь мкл клеток и добавить 50 мкл трипанового синего. После смешивания, взять 10 мкл смеси и тщательно добавить в счетной ячейки слайда. Используйте несколько образцов, чтобы обеспечить точную оценку номер ячейки.
    2. Придерживайтесь в счетной ячейки горкой, одного конца в то время, и клеточной счетчик начинает отсчет автоматически. Возьмите среднее значение всех результатов подсчета и расчета общего количества клеток.
    3. Центрифуга клетки снова и ресуспендируют их вСоответствующий объем бессывороточной среде, приведет к конечной концентрации 1,75 × 10 5 клеток/100 мкл объем.
  5. Место клетки на льду до внутрисердечной инъекции.

2. Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска

  1. Используйте Обнаженная мышей (BALB / с ню / ню) между 6-8 недель.
  2. Войти в систему визуализации. Инициализация датчика 704 (40 МГц).
  3. Начните новое исследование и заполните информацию.
  4. Обезболить (3% isoflurane/100% О 2 в индукционной камере) и поддерживать животных изофлураном (2%) в 100% O 2 (1 дм 3 / мин) в течение всей процедуры через носовой обтекатель. Анестезия подтверждается, когда нет вывода рефлекс не наблюдается с ног крайнем случае.
  5. Установите температуру таблицы изображений до 37 ° C. Лента наркозом мышь к столу с подогревом изображений в положении лежа на спине.
  6. Держите ультразвуковой гель при 37 ° С до имстарения. Нанесите гель на грудь мыши.
  7. Установите датчик в держатель. Опустите датчик до достижения требуемой глубины изображения. Перемещение на сцену, пока левый желудочек не отождествляется с восходящей аорты как ориентир (рис. 1А). Зафиксируйте этап, когда четкое представление о левого желудочка визуализируется.
  8. Нарисуйте 100 мкл смеси клеток в 1 мл шприц с 22 G иглы. Место и закрепите шприц на шприц монтировать.
  9. Перемещение шприц вперед к груди мыши и тщательно перемещать его из стороны в сторону, пока кончик иглы не находится в поле изображения зрения (перед входом мышь).
  10. Отрегулируйте высоту иглы и угол, чтобы прицелиться вниз в левый желудочек.
  11. Проникнуть иглу шприца в межприбрежного пространства незамедлительно через кожу и мышечные слои в левый желудочек под руководством ультразвуковой визуализации.
    Указание успешного введении иглы в левую VentriНКУ является рефлюкс свежего артериальной крови (розового цвета в отличие от темно-красного венозной крови) в шприц
  12. Введите смеси клеток медленно (рис. 1В).
  13. После завершения, извлеките иглу, поднимите преобразователь, очистить ультразвуковой гель с влажной марлей и удалить ленту.
  14. Подготовьте чистую клетку с разогретой площадку.
  15. Место животное на площадку и наблюдать животное до полного выздоровления.
  16. Контролировать поведение животного каждые 24 ч в течение двух дней.
  17. Мониторинг Общие условия и неврологические признаки осложнений в подопытных мышей регулярно.

3. МРТ Мониторинг внутричерепного развития опухоли

  1. Используйте 9,4 Тесла магнит для мониторинга внутричерепного развитие метастазов в головной мозг.
  2. Инициировать МРТ через две недели после имплантации опухоли и повторить один раз в неделю на срок до трех недель.
  3. Степенный животных с 3% изофлуран и поддерживать их под генаRAL анестезии (1,5% изофлуран).
  4. Контролировать и поддерживать температуру тела животных и постоянную дыхания в течение всего эксперимента.
  5. Высокое разрешение мультиспиральной (14 ломтики с толщиной 1 мм, без зазора) Т 1 - и Т 2-взвешенный корональные изображения, охватывающие область от лобной доли в задней черепной ямке, приобретаются со следующими параметрами: T 1-взвешенных изображениях: спинового эха несколько ломтик (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 мс, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм 2. T 2-взвешенных изображениях: быстро спинового эха несколько ломтик (FSEMS) последовательностей, TR / TE = 2500 msec/48 мс, 8 эхо поезда, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм 28,9.
    Опухолевые поражения появляются ярче, чем обычные тканях мозга на Т 2-взвешенных изображениях.
  6. Размер опухоли определяется на Т 2-взвешенных изображениях вручную изложением enhanCing долю массы на каждом изображении с помощью MATLAB программы, написанные нами 8.
    Учитывая большую часть опухоли диаметры меньше, чем толщина среза (1 мм), размер опухоли представлен как в плоскости области, а не объема.

4. Н & E Окрашивание Подтверждение метастазов

  1. Жертвоприношение мышей сразу после последнего MR сканирования, препарировать опухолями мозга и вставлять его в октябре среды и замораживали в -80 ° С
  2. Раздел серия 10 мкм толщиной корональной мозга образцы с криостата.
  3. Выполните H & E окрашивание на участках головного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С высоким пространственным разрешением МРТ (78 мкм в резолюции плоскости), гиперинтенсивных повреждения могут быть определены как малые, как 310 мкм в диаметре (рис. 2). Так как метастазы в этом исследовании очень малы и развитие некроза и отека минимальна, гиперинтенсивным поражение на Т 2-взвешенных изображениях действительно представлял массы опухоли.

Продольные исследования МРТ позволяют в естественных условиях неинвазивной оценки роста опухоли. Как п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы показали, что ультразвуковое исследование наведением впрыска левого желудочка обеспечивает точность, так что наблюдалось каждое животное в данном исследовании разработана метастазами в головной мозг и ни одно животное смерть. Красота изображений наведением инъекции, что путь проникновения иглы кожи и, наконец, в левый желудочек может контролироваться и регулироваться под изображением, которое отличается от ручной процедуры, требующее строгие анатомические ориентиры для подражания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарны д-ра. Диана Пальмиери и Патрисия Steeg из NCI за предоставленную нам MDA-MB231Br клетки. Мы благодарим доктора Ральфа Мейсон, мистер Джейсон Reneau и г-жу Рамона Lopes технической и коллегиального поддержки. Эта работа была частично поддержана на DOD IDEA наград W81XWH-08-1-0583 и W81XWH-12-1-0317. МРТ эксперименты проводились в Advanced Imaging Research Center, в объекте NIH BTRP # P41-RR02584 и ультразвуковым контролем впрыска внутрисердечное проводили с VisualSonics Vevo 770 под 1S10RR02564801.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMHyCloneSH30022.01 
ТрипсинМедиатех25-051-С1 
Автоматический счетчик ячеекBioRadTC10 
ИзофлуранБакстер Интернэшнл Инк.1001936060 
Система визуализации высокого разрешения VisualSonics Vevo 770 Компания Visual Sonics Inc. 
Магнит с горизонтальным отверстием 9,4 Т с системой Varian INOVA Unity Agilent 
O.C.T CompoundSakura Finetek США4583 

Ссылки

  1. Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
  2. Lin, N. U., et al. CNS metastases in breast cancer. J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
  4. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
  5. Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
  6. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
  7. Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
  8. Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
  9. Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
  10. Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
  11. Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
  12. Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи