Микротрубочки нестабильны полимеры и их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Здесь мы опишем протокола с сегментированные микротрубочки с photoablatable стабилизирующих колпачками. Деполимеризация сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя анализ движений с разборки концах микротрубочек.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микротрубочек деполимеризации может обеспечить силу для перевозки различных белковых комплексов и белковые покрытием бусы в пробирке. Основные механизмы, как полагают, играют жизненно важную роль в микротрубочки зависит движений хромосом во время деления клеток, но соответствующие белки и их точные роли плохо определены. Таким образом, существует растущая потребность в разработке анализов, с которой для изучения такой моторику в пробирке с использованием очищенных компонентов и определенный биохимический среду. Микротрубочки, однако, по сути своей нестабильными полимеры; их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Протоколы мы описываем здесь воспользоваться сегментированных микротрубочек, которые сделаны с photoablatable стабилизации шапки. Деполимеризация таких сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя исследования моторики на разборки концах микротрубочек. Этот метод может быть использован до примерноRRY количественный анализ числа молекул в флуоресцентно меченных белковых комплексов, которые движутся поступательно с динамическим микротрубочек заканчивается. Для оптимизации отношения сигнал-шум в этом и других количественных флуоресцентный виды анализа, покровные должны рассматриваться, чтобы уменьшить неспецифическую поглощение растворимых дневно-меченых белков. Подробные протоколы предоставляются учитывать неравномерность флуоресцентного освещения, и определить интенсивность одной флуорофором использованием эквидистантный Gaussian нужным. Наконец, мы опишем использование сегментированных микротрубочек учиться микротрубочек в зависимости от движений микросфер белковых покрытием, обеспечивая полное представление о способности различных моторных и nonmotor белков в пары микротрубочек деполимеризации к поступательного движения грузов.
Введение
Микротрубочки высоко консервативны цитоскелета структур, которые важны для клеточного архитектуры, подвижности клеток, клеточного деления, и внутриклеточного транспорта 1. Эти динамические полимеры собрать из тубулина в присутствии ГТФ, и они спонтанно переключения между ростом и сокращения 2. Микротрубочки являются очень тонкими (всего 25 нм в диаметре), следовательно, специальные оптические методы для повышения контрастности должен быть использован для наблюдения микротрубочки с помощью оптического микроскопа. Предыдущая работа с этих полимеров рассмотрены их динамическое поведение с использованием дифференциальной помехи контраст (DIC) 3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Необходимое оборудование: Эксперименты, описанные ниже, требуют светового микроскопа оборудованная для ДВС и флуоресцентной томографии (табл. 1). Яркий поле светодиодная подсветка может быть использована, чтобы значительно улучшить обнаружение покровное подключением семян микротрубочек 37, которые трудно наблюдать с обычной галогеновой лампы. Для контроля потока жидкости в камерах микроскопии, растворы должны быть обменены с использованием перистальтического насоса, способного скоростей потока от 10-100 мкл / мин. Шприцевой насос также может быть использован, но следует позаботиться, чтобы избежать воздушных пузырей, котор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Белки слежения с деполимеризующим микротрубочек заканчивается. Дрожжи кинетохор компонент Dam1 на сегодняшний день лучший совет-трекер из деполимеризующих микротрубочки заканчивается 14. Этот 10-субъединица комплекс помечены GFP может быть легко выражено и очищают от бактериальных клеток 18,38, поэтому мы рекомендуем использовать его в качестве положительного контроля для наконечника отслеживания анализа. Флуоресцентный белок, который отслеживает с деполимеризующих конце микротрубо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Многие одинокие анализы молекул в настоящее время обычно используют специально обработанные покровные резко снизить неспецифическую налипание белка. Процедура мы описываем здесь является модификацией оригинального протокола, разработанного в лаборатории Ховард 32, и мы находим, что silanizing покровные хорошо стоит усилий даже с борта анализов ДВС на основе, которые не используют флуоресценцию. Камеры собранные с такими покровные показывают намного более чистым поверхности, и результаты, полученные в присутст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить FI Атауллаханов за помощь в разработке и производстве многоразовые камеры потока, Н. Дашкевича, Н. Gudimchuk и А. Korbalev за предоставление фотографий для фигур, Н. Gudimchuk и П. Захарова для разработки протокола и предоставления реагенты подготовить дигоксигенином меченных семена микротрубочек, А. Потапенко за помощь в редактировании текста и других членов Грищук лаборатории для советов и дискуссий. Эта работа была частично поддержана NIH грант GM R01-098389 и пилот грант Пенсильвания мышц института в ELG, который является Киммел Академия, грантов РФФИ 12-04-00111-А, 13-04-40190-H и 13 -04-40188-Н, русский академия наук Президиума гр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Таблица 1. Микроскопия и другое оборудование. | |||
| Микроскоп | Zeiss Nikon | Axio Imager 2 Eclipse Ti | другие модели микроскопов, способные к DIC и эпифлуоресцентной визуализации могут быть использованы |
| Объектив | Zeiss Nikon | 420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49 | 100X, DIC, 1.3-1.49 NA |
| Объективный нагреватель | Bioptechs | 150803, 150819-19 | |
| Флуоресцентный фильтр cube | Chroma | 49004 или 49008 41017 или 49020 | оптимизированный для флуоресценции родамина оптимизировано для GFP Флуоресцентное |
| программное обеспечение для сбора | бесплатно MicroManager Молекулярные устройства | не применимы MetaMorph 7.5 | http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ другое программное обеспечение может быть использовано для получения изображений и для слежения за частицами |
| EMCCD камера Andor | iXon3, DU-897E-cs0-#BV | Высокочувствительная камера EMCCD | |
| Улавливающий лазер | IPG Фотоника | YLR-10-1064-LP | лазер 1,064 нм, 10 Вт |
| Лазеры флуоресцентного возбуждения | Coherent, Inc. Coherent, Inc. | Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP | возбуждение зеленых флуорофоров возбуждение красных флуорофоров |
| Плазменный очиститель | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Коммерческие проточные камеры | Warner Instruments | RC-20 или RC-30 | |
| Перфузионный насос | Cole Palmer Harvard Apparatus | Masterflex 77120-52 Pico Plus | Оба насоса обеспечивают требуемую скорость потока жидкости, но перистальтический насос может пульсировать с очень низкой скоростью. Поток с помощью шприцевого насоса более стабилен для широкого диапазона скоростей, но этот насос имеет инерцию. |
| Таблица 2. Подготовка камеры для микроскопии. | |||
| Модифицированные предметные стекла для многоразовых камер | Прецизионное выдувание стекла в Колорадо | Индивидуальный заказ www.precisionglassblowing.com | Звуковые слоты в слайдах с использованием схем в Рисунок 1 |
| Полиэтиленовая трубка | Intramedic | 427410 | внутренний диаметр 0,58 мм, внешний диаметр 0,965 мм; используйте эти трубки для соединения собранной камеры с насосом и контейнером для отходов |
| Полиэтиленовая трубка | Intramedic | 427400 | Внутренний диаметр 0,28 мм, Наружный диаметр 0,61 мм; используйте эти трубки для изготовления многоразовой камеры |
| Обычные предметные стекла для микроскопа | VWR | 48312-003 | Другие подобные предметные стекла могут быть использованы |
| Покровные стекла | VWR | 48393-150, 48366-067 | Другие подобные покровные стекла могут быть использованы |
| Силиконовый герметик | World Precision Instruments | KIT, СИЛИКОНОВЫЙ ГЕРМЕТИК 5 МИН ОТВЕРЖДЕНИЕ | |
| Эпоксидный клей | Loctite | 83082 | |
| Цианоакрилатный клей | Scotch 3M | AD114 | Или цианоакрилатный клей других производителей |
| Таблица 3. Покровные стекла для чистки и нанесения покрытия. | |||
| молекулярные сита, класс 564 | Macron | 4490-04 | |
| Банка для окрашивания покровного стекла | Ted Pella, Inc. | 21036 | |
| Покровный керамический держатель | Thomas Scientific | 8542e40 | |
| PlusOne Repel Silane | GE Healthcare Biosciences | 17-1332-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Анти-дигоксигенин AB | Roche Applied Science | 11093274910 | |
| Table 4. Получение семян и сегментированных микротрубочек. | |||
| Тубулин | очищенный из коровьих мозгов Cytoskeleton, Inc | T238P | Протоколы очистки см. в 49– 51 Немеченый |
| тубулин свиньи Меченый тубулин | Цитоскелет, Inc Invitrogen Invitrogen | TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin) | Меченый родамином свиной тубулин Тубулин может быть помечен любым амино-реактивным красителем, как в ссылке52. |
| GMPCPP | Jena Biosciences | NU-405 | Aliquot и хранить при -70 °deg; C |
| VALAP | Вазелин, ланолин и парафин в масштабе 1:1:2 по массе | см. ссылку9 |
Ссылки
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
- Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., Brien, O., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
