Методическая статья

Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры

16.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51153

⸱

26 ноября 2013 г.

 ,  ,  , 
1The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Department of Molecular Biology, Princeton University, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает экспериментальную процедуру быстрого строительства искусственных факторов транскрипции (АССАЛХ) с родственными GFP репортеров и количественного определения способности АССАЛХ стимулировать экспрессию GFP через проточной цитометрии.

Аннотация

Синтетическая биология стремится рационально спроектировать и построить синтетические схемы с заданными количественными свойствами, а также предоставляет инструменты для допросить структуру родных цепей управления. В обоих случаях способность программы экспрессии генов в быстром и перестраиваемого образом, без мимо ворот эффектов, может быть полезным. Мы построили штаммов дрожжей, содержащие СИГН.1 промоутер вверх по течению кассеты URA3 последующим лиганд-связывающего домена рецептора человеческого эстрогена и VP16. При преобразовании этого штамма с линейным продукта ПЦР, содержащего ДНК-связывающий домен и выбора в отношении присутствии URA3, конститутивно экспрессируется искусственный фактор транскрипции (ATF) могут быть получены путем гомологичной рекомбинации. АССАЛХ сконструированные таким образом можно активировать уникальный ген мишень в присутствии индуктора, тем самым устраняя как мимо ворот активацию и нефизиологических условий роста, найденные с обычно используемой conditiрных систем экспрессии генов. Простой метод для быстрого строительства GFP репортерных плазмид, которые отвечают конкретно к нативной или искусственного фактора транскрипции интересующего также предоставляется.

Введение

Разработка генетических переключателей в дрожжах представляет большой интерес в научных и промышленных исследований. В идеальном случае, генетические переключатели могут использоваться для активации конкретного гена (или набор генов) только при желании экспериментатором. Последовательность, кодирующую ген, помещенный ниже по потоку от синтетического промотора не экспрессируется в отсутствие индуцирующего молекулы: при индуктора того ген должен быть быстро выражены. Это лишь недавно было показано, что такое переключение может быть спроектирован в дрожжах, где в отсутствие индуктора, штамм отображает фенотип удаления, но в присутствии индуктора, выражение активированного пропорционально уровню индуктора во всех клетках 1,2. Исторически сложилось так, условные системы экспрессии в дрожжах которые полагались на питательных аспекты последовательностей ДНК, в том числе МЕТ, PHO и GAL промоторов (деятельность которых чувствительны к внеклеточных уровней метионина, фосфата игалактоза, соответственно). В то время как условное выражение может быть достигнуто, это происходит за счет значительных плейотропных эффектов.

Гормональные рецепторы, такие как рецепторы человека эстрогена, оказались эффективными выключатели у эукариот 3,4. При отсутствии гормона, белок, слитый с рецептором гормона могут быть изолированы в цитоплазму, где он взаимодействует с шаперона Hsp90 комплекса. После связывания соответствующий лиганд, рецептор претерпевает конформационные изменения, в результате чего он будет выпущен из шаперонной комплекса Hsp90 и выявление сигнал ядерной локализации. Чтобы наблюдать динамику локализации того или иного рецептора, содержащих белок гормона, мы создали С-концевой слияние Gal4dbd.ER.VP16 (ГэВ, синтетического транскрипционного фактора, содержащего связывающий домен Gal4p ДНК, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека , и VP16) с GFP 2. Ядерная локализация наблюдалась в 8 мин после добавлениянасыщая количеств индуктора, ß-эстрадиола, к которому дикого типа дрожжей полностью инертны. К этому времени, большинство клеток имеют четко видимые активные центры транскрипции для GEV генов-мишеней (анализировали с помощью флуоресценции в гибридизация), а также полностью зрелые мРНК 2,5. Гены-мишени GEV увеличилась в экспрессии> 2 раза в течение 2,5 мин 2,6 (измерено с использованием микрочипов), демонстрируя, что он принимает <2,5 мин для химерного активатора к транслокации в ядро, связывать ДНК и активировать транскрипцию.

В то время как несколько других на-переключателей были применены в дрожжах, которые используют различные мелкие молекулы или наркотики (в том числе классических доксициклин основе коммутаторов от кишечной палочки 7,8 и переключатель индиго на основе 9 из арабидопсис), ни один не добились скорости, специфичность, или теснота регулирования выставлены гормона основе коммутаторов. Стоит отметить, тшапка быстрый от-переключателей были также разработаны в дрожжах, и обычно работают путем слияния гена протеазы в убиквитинлигазы или последовательность 2,10,11,12 ориентации. Способность быстро удалить целевой белок из клетки облегчает исследование важных генов, а также гены, которые склонны к генетической подавления при удалении 10.

Методы, описанные в данном протоколе являются для строительства и характеризующие синтетические на-переключателей в дрожжах. Во-первых, мы покажем, как быстро генерировать геномно интегрированные гибридные белки, состоящие из ДНК-связывающего домена интереса, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека, и VP16 (DBD-электромобилей). После нашего протокола, слитый белок экспрессируется из ACT1 промотора. Затем мы показываем, как создать узнаваемый репортер плазмиды для ATF и проверить ее функциональность, воспользовавшись проточной цитометрии. Хотя мы предполагаем эти репортер плазмиды используются с новыми АССАЛХ (рис. 1), они могут бе используется в качестве репортеров для родной активатор транскрипции, а также. Наконец, данные проверки эффекта активации АТФ на рост клеток в 96-луночных планшетах и ​​для инженерных индуцируемые геномных аллелей предоставляются.

Протокол

На рисунке 2 представлен схематический вид секции протокольных 1-3.

1. Создание АССАЛХ

  1. Создание праймеров для ПЦР амплификации ДНК-связывающий домен интересов. Гомологию с ACT1 промотора и гормональных рецепторов (как описано на фиг.3 и 4) добавляется через PCR, чтобы облегчить правильную рекомбинации в штамм yMN15.
  2. ПЦР-амплификации DBD интереса с использованием полимеразы высокой точностью.
  3. Transform> 1 мкг очищенного продукта ПЦР в дрожжах с использованием метода ацетат лития 13.
  4. После трансформации спиновые клетки на максимальной скорости в течение 15 секунд в микроцентрифуге и снимите смесь трансформации.
  5. Ресуспендируют в ~ 200 мкл стерильной воды и пластины на YPD.
  6. На следующий день, реплики пластина из YPD на 5-FOA пластин (5-FOA пластины изготовлены, как описано в дрожжевой Руководство Cold Spring Harbor) 13.
  7. Разрешить рост на 2-4 гн я, и restreak по крайней мере, 5-10 колонии на YPD. Выполнение ПЦР колоний с использованием праймеров в таблице 1 и последовательности, чтобы проверить включение.

2. Создание АТФ плазмиды Reporter

  1. Определите сайт связывания АТФ (скорее всего приехать из литературы).
  2. Закажите необходимое связывающую область как олигонуклеотидов (или Ultramers, если это необходимо). Заказать как верхней и нижней нитей с правильными свесами для NotI и XbaI, как показано в таблице 2.
  3. Развести олигонуклеотидов в эквимолярных концентрациях (100 мкм).
  4. Фосфорилировать с использованием полинуклеотидкиназы Т4 и затем отжига в амплификатор. Условия реакции приведены в таблице 3.
  5. Дайджест ~ 1-2 мкг pMN8 с NotI-HF и XbaI в течение 1 часа при 37 ° С (условия реакции в таблице 4).
  6. Гель очистить магистральную группу.
  7. Развести очищенную основу до 10 нг / мкл.
  8. Развести двухцепочечной, фосфорилованные сайт связывания до 5х молярную концентрацию позвоночника за мкл.
  9. Использование ДНК-лигазы Т4, лигировать в сайты связывания в переваренной позвоночника при комнатной температуре в течение 30 мин (табл. 5).
  10. Для трансформации, добавить половину реакции лигирования к 50 мкл стандарта, химически компетентных кишечной палочки, такие как XL1-Blue или DH5-альфа.
  11. Теплового шока клетки в течение 45 секунд в водяной бане при 42 °, а затем поместить на льду в течение 2 мин.
  12. Добавить 900 мкл SOC среде реакции трансформации.
  13. Расти при 37 ° С в течение 1 часа на роликовом барабане.
  14. Распространение 100-200 мкл клеток на LB + AMP (100 мкг / мл) пластины и инкубировать в течение ночи.
  15. Расти E. палочка в LB + AMP жидкости и урожай ДНК плазмиды. Последовательность проверки новой репортерной плазмидой от лигирования колоний с использованием праймера 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
  16. Transform новый репортер плазмиды в АТФ-содержащих дрожжей улайн из раздела 1, используя литиевую преобразование ацетат.

3. Количественной оценки влияния АТФ индукцией по экспрессии генов Использование GFP Reporter

Подготовка образцов:

  1. Сделать 25 мм β-эстрадиола акций (10 мл этанола + 0,0681 г β-эстрадиола). Хранить в холодильнике.
  2. Расти ATF + Репортер-штамм, содержащий одну ночь в 5 мл SC-УРА.
  3. Получить девять 250 мл встряхнуть колбы и добавить 25 мл SC-УРА друг.
  4. Добавить 0 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, или 10 мкМ β-эстрадиол. Проще всего это делается путем 10-кратного серийные разведения 25 мм β-эстрадиола складе. Для конечной концентрации 10 мкМ β-эстрадиола, добавить 10 мкл 25 мМ β-эстрадиола складе в 25 мл SC-URA.
  5. Добавить 125 мкл ночных культур в колбах (1:200 разведение).
  6. Для 2 оставшихся колб, прививку с учредительной GFP производства Straiн и штамм хватает GFP. Они необходимы для калибровки проточного цитометра.
  7. Взболтать при 200 оборотах в минуту при 30 ° С в течение 12-18 часов.
    Примечание: Оптимальное время инкубации определяется путем выявления, когда индукционные GFP больше не меняется следующее добавление β-эстрадиола.
  8. Возьмите 500 мкл каждой культуры и спином вниз в отдельных 1,7 мл микропробирок.
  9. Аспирируйте SC-УРА.
  10. Вымойте раз в 1 мл PBS 0,1% Твин-20 и аспирации.
  11. Добавьте 1 мл PBS 0,1% Твин-20 и ресуспендируют.
  12. Добавить 1 мл PBS +0,1% Tween-20 в пробирки Фалкон.
  13. Добавьте ресуспендировали клетки в 5 мл пробирки (конечный объем = 2 мл) (можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней).
  14. Дополнительно: соникатные клетки слегка, чтобы распада любые слипаются клетки.
    Проточной цитометрии анализа: Обзор: флуоресценция 10000-100000 клеток, как правило, анализируется на образец. Данные могут быть обработаны либо в FlowJo или с помощью пользовательских сценариев в MATLAB илиР. Убедитесь откалибровать напряжение GFP канала с помощью GFP положительные и отрицательные элементы управления. Как только файлы FCS экспортируется, сценарий, например, на Рисунке 6 вместе с функцией fca_readfcs ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) может быть использован для обработки данные.
  15. Выполните проточной цитометрии.
    1. Использование вперед разброс (ФСБ) и боковые разброс (SSC) для идентификации дрожжевых клеток.
    2. Установите расход до ~ 3000 ячеек / с.
    3. Измерьте GFP (FITC канал).
    4. После того, как данные, собранные, экспорт. FCS файлы
  16. Загрузите MATLAB.
  17. Перемещение. FCS файлы, fcs_readfcs.m и сценарий, похожий на что из рисунка 6 в ту же папку.
  18. Изменение настоящего рабочий каталог в папку, содержащую данные и сценарии.
  19. Запустите сценарий из рисунка 6 (обратите внимание:легенда, вручную внесенный производить то, что показано на рисунке 7).

4. Количественной оценки влияния АТФ индукции на рост клеток

  1. Из замороженных запасов, серия из как (1) АТФ-содержащий штамм и (2) штамм АТФ-не хватает (например, yMN15) на отдельные YPD пластин.
  2. После 2 дней роста, привить отдельные культуры пробирки, содержащие 5 мл YPD жидкости с каждого штамма и расти в течение ночи при 30 ° С
  3. Выполнение 10-кратных серийных разведений 0,25 мМ β-эстрадиола маточного раствора до 10000-кратного (0,025 мкМ β-эстрадиола) в 100% этаноле.
  4. Добавить 40 мкл ночных культур в 10 мл YPD жидкости (1-250 разбавление).
  5. Для каждого штамма, добавить 96 мкл разбавленных клеток в 18 лунки 96-луночного планшета с.
  6. Добавьте 4 мкл β-эстрадиола на клетки. Существенно, чтобы убедиться, что каждый хорошо имеет тот же объем от общего этанола. (В качестве альтернативы мо Re концентрированный запас β-эстрадиола могут быть использованы и в дальнейшем разбавляют до точки, эффект этанола на рост не поддается измерению).
  7. Выполните в трех экземплярах. Три из скважин для каждого штамма должно быть этанол только для управления.
  8. Накройте 96-луночный планшет в газовой мембраной.
  9. Монитор рост (OD 600) в ридере.
  10. Количественная оценка скорости роста с использованием любого количества стандартных методов, таких как нахождение максимального наклона.
    Примечание: Мы имел хороший успех с программного пакета с открытым исходным кодом grofit 14, которая проходит в среде R программирования Стоит отметить, что в то время темпы роста, рассчитанные по 96-а анализах пластины по сравнению с Shake-колбы (25 мл культуры). не обязательно то же самое (в связи как с различиями в физиологии и в приборном), мы наблюдали, что относительные темпы роста похожи (хотя это не всегда может быть и исключения).
TLE "> 5. Создать индуцибельные геномной аллелей

  1. Получить pMN10, в noncentromeric плазмиду с АТФ-отзывчивым промоутер от pMN8 слитого с KanMX (в противоположной ориентации).
  2. Ограничение переварить вектор костяк и экстракт гель как в разделе 2.
  3. Отжиг, фосфорилируют и перевязывать олигонуклеотиды, содержащие соответствующие сайты связывания, как описано в разделе 2.
  4. Последовательность проверки. Эта плазмида теперь будет служить в качестве ДНК-матрицы для создания индуцируемую аллель.
  5. Получите штамм дрожжей, выражающее соответствующую ATF интересов.
  6. ПЦР-амплификации кассету KanMX-промотор (~ 2 КБ) с использованием праймеров, из таблицы 6.
  7. Преобразование ПЦР-продукта в АТФ-экспрессирующих штамма по методу с ацетатом лити.
  8. Табличка на YPD и реплики пластину на YPD + G418 на следующий день.
  9. Подтверждение соответствующую вставку промотора с использованием прямого праймера (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') и обратного праймера внутренней йе ген, промотор был заменен. Обратный праймер обычно предназначены для между 200-300 п.о. ниже по потоку от первого ATG 15. Конечный ПЦР-продукт составляет ~ 1,2 кб.

Результаты

На рисунке 5 показано индукцию GFP по Z 3 EV, Z 4 EV, или GEV с течением времени. Обратите внимание на увеличение производства GFP в ответ на АССАЛХ содержащих nonyeast ДНК связывающих доменов. Недавно мы предположили, что это следует из этих факторов достижение одного гена специфичность в геноме дрожжей 1. Один GEV индукция приводит к активации / репрессии сотен генов, тогда как Z 3 EV и Z 4 EV только активировать экспрессию гена-мишени помещают ниже синтетического промотора, содержащего соответствующие сайты связывания (5'-GCGTGGGCG-3 'и 5'- GCGGCGGAGGAG-3 ', соответственно) 1. Рисунок 7 демонстрирует жесткое регулирование системы (не индуктор результатов в отсутствие обнаруживаемой GFP) и что все клетки получают индуцируется в ответ на индуктор Способность Z 3 EV индуцировать GFP по целому ряду β-эстрадиола концентрации показано на фиг.8.

ЛОР "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> figure-results-1
Рисунок 1. Искусственные факторы транскрипции взаимодействовать с Hsp90 в отсутствие β-эстрадиола. Когда β-эстрадиол связывается с АТФ, Hsp90 диссоциирует, позволяя АТФ, чтобы войти в ядро и активировать экспрессию из плазмиды репортера.

figure-results-2
Рисунок 2. Схема протокола для инженерных штаммов, содержащих искусственные транскрипционные факторы и строительство / тестирование родственные GFP журналистам.

load/51153/51153fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg "/>
Рисунок 3. ACT1pr-URA3-EV последовательность в штамме yMN15 на LEU2 локуса.

figure-results-3
Рисунок 4. Проектирование ПЦР-праймеров для амплификации ДНК-связывающий домен интерес с дополнительным гомологии последовательности, чтобы создать новый слитый белок когда успешно преобразован в yMN15.

figure-results-4
Рисунок 5. Индукция GFP с помощью трех различных пар ATF-промотора в ответ на 1 мкМ β-эстрадиола.

figure-results-5
Рисунок 6. Сценарий MATLAB для потока обработки цитометрии данных. Этот сценарий был адаптирован из http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .

figure-results-6
Рисунок 7. Индукция GFP по Z 3 EV в ответ на 0 μ M β-эстрадиола и 1 мкМ β-эстрадиола следующем 18 часов индукции. Флуоресценции также измеsured от клеток, не GFP, чтобы проиллюстрировать тесную регулирование EV системы Z 3. Эта цифра была создана с использованием код на рисунке 6.

figure-results-7
Рисунок 8. Отношения между концентрацией индуктора и выхода выражение оценивается с коэффициентом Хилла, равным ~ 1. (A) Распределение выражения GFP в зависимости от β-эстрадиола концентрации. (B) Среднее флуоресценции распределений из (а). Данные были пригодны к функции G (D) = G мин + (G макс-G мин) D н / (К п + D п), где D является β-эстрадиола доза, G мин и G макс минимальная и максимальные значения GFP, разрешениеpectively, н-коэффициент Хилла, и К-β-эстрадиол доза, которая дает ½ (G + G макс мин).

Oligonucleotide Последовательность Название
5'-TTGAAACCA
AACTCGCCTCT-3 ' 		DBD Проверьте Вперед
5'-tccagagac
ttcagggtgct-3 ' 		DBD Проверить Обратный

Таблица 1. Грунтовки для подтверждения правильного слияние DBD интереса к рецептора эстрогена. Прямой праймер гомологичен ACT1 промоутер и обратный праймер гомологичен с рецептором эстрогена. Для типичных DBDS (~ 300 б.п.), продукт ПЦР <1,5 кб.

Oligonucleotide Последовательность Название
5'-ggccgc ... DBD кайфа сайт ... т-3 ' Топ олиго
5'-ctaga ... связывающий ДНК-сайт обратный ... GC-3 ' Нижняя олиго
5'-GCC gcGTGGGCG Т GCGTGGGCG G G
CGTGGGCG Т GCGTGGGCG G GCGTG
GGCG Т GCGTGGGCG т-3 ' 		Сайты связывания Топ олиго + 6x Zif268
5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC
CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC
CACGCACGCCCACgc-3 ' 		Сайты связывания Нижняя олиго + 6x Zif268

Таблица 2. S tructure праймеров для создания двухцепочечной ДНК, содержащий сайты связывания интересов. Для создания Z 3 EV проблематику промотор, олигонуклеотиды Топ олиго + 6x Zif268 сайтов связывания и Нижняя олиго + 6x Zif268 переплета были использованы.Последовательности для создания правильных свесы ДНК находятся в нижнем регистре. Консенсус сайт связывания Zif268, GCGTGGGCG, указывается в верхнем олиго.

Реагент Количество
T4 полинуклеотидкиназой буфера 5 мкл
T4 полинуклеотидкиназой (@ 10000 единиц / мл) 1 мкл
Лучшие олиго (100 мкМ) 1,5 мкл
Нижняя олиго (100 мкМ) 1,5 мкл
Воды 41 мкл

Таблица 3. Фосфорилируют и отжига праймеров в амплификаторе использованием 50 мкл реакции, описанной выше. Существуют два шага амплификаторе. Шаг 1: 37 ° C 30 мин (фосфорилируют), и шаг 2: 95 ° С 30 сек (не уйти в отставку на 1 ° С каждые 30 сек, пока при 4 ° С; отжига).

Реагент Количество
XbaI 1 мкл
NotI-HF 1 мкл
ДНК плазмиды 5 мкл (1-2 мкг)
10x Вырезать Смарт буфера 5 мкл
Воды 38 мкл

Таблица 4. Ограничение дайджест плазмиды pMN8 с XbaI и NotI.

Реагент Количество
Т4 лигазы Bufфер 2 мкл
T4 лигазы 0,2 мкл
Магистраль @ 10 нг / мкл 1 мкл
Связывающие последовательности @ 5x молярной концентрации / мкл 1 мкл
Воды 15.8 мкл

Таблица 5. Лигируют сайты связывания в ДНК плазмиды.

Грунтовка Описание
~ 40 б.п. выше по течению от ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 ' Прямой праймер для усиления KanMX-промоутер
5'-обратной комплементарной (ГПТ + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 ' Реверс PRIМер для усиления KanMX-промоутер
5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa
ttaaatacaaataaaCGCAC
TTAACTTCGCATCTG-3 ' 		Прямой праймер для изготовления GCN4 промоутер своп.
5'-tggatttaaagcaaataaacttgg
ctgatattcggacatTATAGTT
TTTTCTCCTTGACG-3 ' 		Обратный праймер для изготовления GCN4 промоутер своп.

Таблица 6. ПЦР амплификации KanMX-промоутер для изготовления titratible аллель.

Обсуждение

Коммутаторы гормонов основе, описанные здесь, имеют бесчисленные приложения, от изучения родного биологию клеток к тестированию на способность ДНК-связывающего домена интереса к целевым последовательность ДНК в естественных условиях. Система не имеет много привлекательных особенностей, включая градуированной ответ на индуктора, быстрых действий и жесткое регулирование (т.е.. Никакого измеримого неплотности, см. рисунок 7). Однако, есть еще возможности для совершенствования и расширения.

Последние работы в синтетической биологии подчеркнул мультиплексирования синтетических систем и расширение репертуара хорошо охарактеризованных, программируемых частей ДНК 16. Независимая, условное выражение различных генов-мишеней требует как несколько индукторов и связывающие домены ДНК, которые не имеют перекрывающиеся специфику. Наличие разработаны и природных рецепторов предоставляет большой набор частей, с которыми по разработке новых факторов искусственного транскрипции. РасширениеРепертуар взаимно ортогональных переключателей был весьма способствуют направленной эволюции подходов 17,18. В настоящее время усилия перепрограммировать лигандсвязывающий специфику наших искусственных факторов транскрипции будут представлены в будущем.

Ранее фенотипические последствия делеции гена / избыточной экспрессии были широко изучены в дрожжах 19,20. Тем не менее, он не был простым для изучения влияния выражения на разных фенотипов по всему диапазону уровней экспрессии. Основной особенностью системы, представленной в настоящем документе, его градуированная природа (рис. 8). В то время как часто предполагается, отношения между экспрессии генов и фенотипов интерес не обязательно может быть монотонной. Искусственные факторы транскрипции, такие как Z 3 EV и Z 4 EV сделает задачу анализируя фенотипические ответов на изменения в экспрессии генов простой.

Наконец, протоколы обсужденияред в этой рукописи для инженерно-характеризующие искусственные транскрипционные факторы, которые отвечают на β-эстрадиола, однако, важной альтернативой химически реагирующих доменов является использование света проблематики доменов (например, PhyB/Pif3, LOV и Bluf), , деятельность которых обратимы без возмущают среду для роста культуры 21-23. Системы на основе света облегчить пространственно-временной контроль экспрессии генов, белок-белковых взаимодействий, ионный транспорт и ферментативную активность, которая уже проверенную мощный 21-26.

В заключение мы представили методы для быстрого строительства индуцибельных, искусственных факторов транскрипции в дрожжах. Этот протокол обеспечивает шаблон для их конструкции в сочетании с родственными GFP репортеров, а также методов анализа данных репортер с помощью проточной цитометрии и анализируя эффект активации АТФ на рост.

Раскрытие информации

McIsaac, Нойес и Ботстайн (с другими) представили часть этой системы в качестве Патентного раскрытия.

Благодарности

РСМ признает финансирование от NSF Высшей исследовательский грант. MBN признает финансирование от Льюиса-Sigler стипендий и наделенный даром Питера Льюиса. DB признает финансирование от NIH (GM046406) Национальный институт Генеральной медицинских наук Центра количественного биологии (GM071508). Мы признаем, Кристина DeCoste за помощь в проточной цитометрии экспериментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наименование реагентаНомер вкаталогеКомментарии 
Expand Высокоточная ПЦР-системаRoche11 732 650 001
T4 ДНК-лигазаNEBM0202S
Компетентный E. coliLife Technologies18258-012
ЭстрадиолTocris Biosciences2824
АмпициллинFisher ScientificBP1760-5
T4 ПолинуклеотидкиназаNEBM0201
PBSLife Technologies10010-23
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5
clonNATJena BioscienceAB-102L
XbaINEBR0145S
NotI-HFNEBR3189S
Буфер CutSmartNEBB7204S
ГлюкозаFisher ScientificD15-500
Бакто-пептонBD Biosciences211677
экстракт дрожжейBD Biosciences210929
АгарозаBD Biosciences214010
100% этанолDecon Laboratories04-355-222
G418Life Technologies11811-031
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
Дигидрат ацетата литияSigma-AldrichL-6883
Сперма лосося ДНКSigma-Aldrich93283
PEG 3350Sigma-AldrichP-3640
Плазмиды pMN8 и pMN10; штамм дрожжей yMN15Noyes или Botstein labs
Luria BrothSigma-AldrichL3397
ОБОРУДОВАНИЕ:
Проточный циометр LSRII  BD Biosciencesразличные модели
MATLAB или FlowJoMATLAB или FlowJoпрограммное обеспечение для анализа. Файлы FCS из экспериментов по проточной цитометрии
ROpen SourceДля анализа данных о скорости роста с планшетного ридера.
Falcon TubesBD Biosciences352052
1,7 мл Eppendorf  ПробиркиGeneMateC3262-1
250 мл Shake FlaskCorning4446-250
96-луночные, плоскодонные пластиныCostar3635
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)BioTekH1MG
Breathe-Easy МембраныSigma-AldrichZ380059-1PAK
Термоамплификаторразличных компанийРазличные модели
SC-Ura порошокMP Biomedicals114410622
5-FOAZymo ResearchF9001-1

Ссылки

  1. McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic acids res. 41, e57(2013).
  2. McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).
  3. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131, 129-134 (1993).
  4. Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).
  5. McIsaac, R. S., et al. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).
  6. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).
  7. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).
  8. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  9. Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).
  10. Hickman, M. J., et al. Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast. Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).
  11. Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron. Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).
  12. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. methods. 6, 917-922 (2009).
  13. Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  14. Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. grofit: Fitting Biological Growth Curves with R. J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).
  15. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).
  16. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150, 647-658 (2012).
  17. Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).
  18. McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold. Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).
  19. Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast. Science. 297, 395-400 (2002).
  20. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol. cell. 21, 319-330 (2006).
  21. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).
  22. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).
  23. Losi, A., Gartner, W. Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors. Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).
  24. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).

Перепечатки и разрешения

Теги

GFP
Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.