Методическая статья

Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования

DOI:

10.3791/51164

⸱

19 мая 2014 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Faculty of Medicine, Laval University, 2CHU de Quebec Research Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем метод для анализа изменений в инициации мРНК перевода эукариотических клеток в ответ на стресс условия. Этот метод основан на разделении скорости на градиентах сахарозы на перевод рибосом из не-переводные рибосом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точный контроль трансляции мРНК имеет основополагающее значение для эукариотической гомеостаза клеток, особенно в ответ на физиологической и патологической стресса. Изменения этой программы может привести к росту поврежденных клеток, отличительной чертой развития рака, или к преждевременной смерти клеток, таких как видно на нейродегенеративных заболеваний. Многое из того, что известно о молекулярную основу для поступательного контроля была получена из полисом анализа с использованием градиентной системы фракционирования плотности. Этот метод основан на ультрацентрифугирования цитоплазматических экстрактов на линейном градиенте сахарозы. После того, как спин завершена, система позволяет фракционирование и количественное определение центрифугировали зон, соответствующих различным перевод рибосом популяции, в результате чего профиль полисом. Изменения в профиле полисом свидетельствуют о изменениях или дефектов в инициации трансляции, которые происходят в ответ на различные виды стресса. Этот метод также позволяет оценить тыс.е роль специфических белков на инициации трансляции, а также измерять поступательное активность специфических мРНК. Здесь мы опишем наш протокол для выполнения профили полисом для оценки инициацию трансляции эукариотических клеток и тканей под либо нормальных или стрессовых условиях роста.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эукариотические клетки постоянно встречаемся ряд вредных физиологических и экологических условиях стресса, которые требуют быстрого реагирования адаптивного клеток. Реакция на стресс сотовый включает в себя точный баланс между анти-выживания и про-выживания действующих факторов. Разрушение этого баланса может иметь необратимые последствия, ведущие развитие человеческих патологий, таких как рак и нейродегенеративные заболевания. Во время первой стадии реакции на стресс, клетки активируют пути про-выживания, которые включают скоординированное управление изменениями в экспрессии генов на уровне трансляции мРНК.

перевод мРНК у эукариот является сложным клеточный процесс, который включает в скоординированных взаимодействия между инициации трансляции факторов (EIFS), специфическая РНК-связывающих белков (RBDS) и молекул РНК 1. перевод мРНК делится на три этапа: инициирование, удлинение и прекращение. Хотя все три фазы могут быть регуlatory механизмы, трансляционные механизмы контроля нацелены в основном на этапе инициирования перевода, который, таким образом, представляет собой ограничивающую скорость стадию синтеза белка 2.

Инициация трансляции является весьма приказал процесс, который начинается с формирования eIF2a.GTP.Met-тРНК я встретил тройной комплекс и его последующее связывание с 40S рибосомы субъединицы, что приводит к образованию комплекса предварительно инициации. Следующим шагом является привлечение в преиниационного комплекса к мРНК, которая включает деятельность инициации трансляции таких факторов, как eIF4F и eIF3. 48S преиниационного комплекс таким образом подвергается конкретные конформационные изменения, которые позволяют эту технику, чтобы начать сканирование 5'-нетранслируемой области мРНК, пока он не признает инициирующий кодон августа Большинство факторов инициации трансляции затем освобожден и 60S субъединицы набираются сформировать 80S рибосом комплекс компетентным для перевода,т, который начинается синтез точка белка (рис. 1). Более одного 80S monosome можно переводить же мРНК в то время, производя так называемые полисомы (или полирибосомы). Плотность полисом на мРНК отражает инициирование, удлинение и прекращение ставки и, следовательно, является мерой переводимости определенного транскрипта. Однако полисом профиль используется в основном для оценки изменений в трансляции мРНК на стадии инициирования. Здесь мы использовали протеасомную ингибитор как ингибитора инициации трансляции. Лечение раковых клеток с этим препаратом вызывает реакцию на стресс, характеризующийся активации стресс-киназы имени HRI который фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2a 3. Фосфорилирование eIF2a является одним из основных событий, приведших к ингибирования инициации трансляции в клетках млекопитающих 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол следует руководству утвержден этической экспертизы Совета Лаваль.

1. Подготовка клеточных культур и мозг Манипуляция

  1. Млекопитающих и клетках дрозофилы
    1. Расти HeLa шейки раковые клетки и Шнайдер Drosophila эмбриональные клетки в соответствии с рекомендациями American Type Culture Collection. Работа с клетками при низкой прохода.
    2. Пластина клеток в целях достижения 80% слияния день эксперимента. Для получения наилучших результатов используйте ~ 12 х 10 6 клеток для каждой экспериментальной состоянии. До принятия экстракты для анализа полисом, стимулировать перевод, добавив свежий полной среды, по крайней мере 90 мин.
  2. Изоляция Мозг: Изолировать мозги от мышей в возрасте от 9 до 16 дней после рождения. Эвтаназия включает CO 2 ингаляции после анестезии и смещения шейных позвонков. После жертвоприношения, изолировать весь мозг и либо место, ят при -80 ° С или непосредственно перенести его в холодную PBS 1X к немедленному использованию.

2. Подготовка градиента плотности Фракционирование система

  1. Промыть систему труб с 0,1% SDS в течение 5 мин.
  2. Промыть систему труб с 70% этанолом в течение 5 мин, а затем с RNaseZAP раствор в течение 5 мин, после чего ее промывки смесью DEPC воды.
  3. Насос воздух для сушки систему труб устройства.

3. Получение градиентах сахарозы

  1. Сделать 15% и 55% растворы сахарозы в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1,25 мМ MgCl 2, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT.
  2. Генерировать линейная 15-55% сахарозы градиент используя Isco Модель 160 градиент бывший, в соответствии с инструкциями изготовителя. Тем не менее, важно также контролировать скорость насоса перистальтический TRIS, чтобы избежать создание пузырьков или завихрений в градиентах. Хранить градиенты при 4 ° С до использования.
  3. Во время, когда программа градиент производитель работает, охладить ультрацентрифугу до 4 ° С

4. Подготовка Cell и мозг мыши Экстракты

  1. Подготовка клеточных экстрактов
    1. Место пластина (ы) на льду и мыть клетки 3x холодной PBS 1X.
    2. Урожай клеток (~ 12 × 10 6) в 1 мл лизирующего буфера (20 мМ Tris-HCl при рН 7,4, 1,25 мМ MgCl 2, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1% Nonidet P40, 5 ед / мл ингибитора РНКазы, дополненной с полными мини ЭДТА без ингибитора протеазы коктейль таблеток), перенесите их в пробирку Эппендорф, и хорошо перемешать, передав им 15x через 1cc U100 инсулиновый шприц 28 G 1/2. Пусть клеточный лизат отдыхать на льду в течение 15 мин.
    3. Положите несколько капель клеточного лизата на слайд, чтобы оценить клеточный лизис, наблюдая при контрастном микроскопе фазы с использованием объектива 10X. Только ядра должны быть видны и никакие клеточные мембраны не должны быть видны свидетельствование для лизиса клеток. В качестве контроля наблюдатьunlysed клетки.
    4. Уточнение клеточного лизата центрифугированием при 11000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и держать растворимый лизат, содержащий полирибосомы.
  2. Подготовка мозга мыши экстрактов
    1. Однородный весь изолированный мозг (~ 500 мг) на 10 ударов в ледяной Даунса гомогенизаторе с 2 мл лизирующего буфера и уточнить гомогената центрифугированием при 11000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
    2. Загрузить полученного супернатанта на подушке 50% сахарозы и приступить к седиментации в течение 2 часов при 200 000 х г в использовании Ультрацентрифуга ротор TH-641 при 4 ° С.
    3. Ресуспендируют полупрозрачный осадка, содержащего полирибосомы в 1 мл буфера для лизиса и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Пусть подвески отдохнуть на льду в течение 30 мин перед загрузкой на градиентов.

5. Загрузка Экстракты на градиентах сахарозы и ультрацентрифугированием

  1. Измерьте концентрациюРНК, присутствующего в цитоплазматической экстракта с помощью спектрофотометра. Осторожно и медленно загрузить ~ 20 OD 260 единиц экстракта на 15% до 55% градиенте сахарозы. Убедитесь в том, что есть 2-3 мм свободного пространства на поверхности трубы, чтобы избежать переполнения трубки во время центрифугирования.
  2. Центрифуга градиенты с помощью ультра-центрифуги в течение 2 часов 30 мин при 230 000 мкг в использовании ультрацентрифуге ротор TH-641 при 4 ° С. По окончании центрифугирования, удаления труб и разместить их на льду осторожно, чтобы не потревожить градиенты.

6. Фракционирование цитоплазматических экстрактов для полисом профилирования

  1. Поместите градиентах сахарозы на автоматизированной системы плотности фракционирования и приступить к автоматизированной фракционирования и сбора фракций (0,5 мл каждого), как описано производителем.
  2. Соберите каждую фракцию (~ 500 мкл) на отдельные Эппендорф с непрерывным контролем поглощения при 254 нм. В parallэль градиента операции фракционирования, профиль polyribosomal будете редактировать на листе бумаги. Вместо этого можно использовать блок сбора данных, прикрепленный к самописца, чтобы иметь электронный приобретение профиля полисом.
  3. В конце каждого запуска, передавать собранные Eppendorfs на сухом льду. В это время, как магазин собранных фракций при -80 ° С или непосредственно осадок белок-РНК комплексов следующим образом.

7. Белок Добыча и анализ

  1. К каждой фракции, собранной из градиенте сахарозы, добавление 2 объемами 100% холодного этанола и пусть РНК-белковых комплексов осадок при -20 ° С в течение ночи.
  2. Центрифуга друг РНК-белок осадок при 11000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С, затем вымыть с 70% этанола. Сухая и ресуспендируют осадок в SDS-PAGE образца буфера перед выполнением вестерн-блоттинга с использованием специфических антител (см. рисунок 2).

8. Экстракция РНК инализ

  1. Осадок РНК-белковые комплексы, как в разделе 7.1. Ресуспендируют каждый РНК-белок осадок в буфере для лизиса, содержащего 0,1% SDS. Дайджест белкового компонента осадка с 2 мг / мл протеиназы К в течение 30 мин в водяной бане при 55 °.
  2. Извлечение РНК компоненты осадка добавлением 1 объема "фенол: хлороформ", 2 объемами хлороформа и 0,1 объема 2 М NaOAc рН 4 и центрифугированием при 10000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Осадок РНК из полученной водной фазы каждого образца в течение ночи при -20 ° С добавлением 1 объемом изопропанола и 0,2 мкг / мкл гликогена. Спин осадка в течение 1 часа при 10000 х г при 4 ° С. Вымойте РНК гранул с 70% холодного этанола.
  3. Ресуспендируют осадок РНК в небольшом объеме РНКазы свободной воды. Оцените количество и качество РНК с использованием спектрофотометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как упомянуто выше, полисом профиль позволяет анализ изменений инициации трансляции в условиях стресса. Рисунок 1 представляет собой упрощенную вид инициации трансляции, которая, как описано ранее, многоэтапный процесс, включающий упорядоченную сборку инициации трансляции комплексов. В нормальных условиях роста, инициации трансляции комплексы превращаются в полирибосом чьи обнаружение полисом профиля свидетельствуют для активного инициации трансляции (рис. 2; Необработанные). В условиях...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ полисом профиль на градиентах сахарозы позволяет измерять инициации трансляции на основе анализа плотности полисом, выделенных из клеток или тканей 9,11-14. Этот метод является лучшим (если не единственным) подход для измерения инициацию трансляции в естественных условиях. Он используется для контроля за поступательное статус выращивания клеток во время клеточного цикла 15, а также для оценки влияния различных видов стресса в том числе вирусных инфекций, гипоксии 13,16, р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПА является получателем стипендии "Пьер Дюран" факультет медицины Университета Лаваля. Эта работа была поддержана естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (СС-CG095386) в РМ полисом фракционатор была приобретена через Канадский фонд инновационного гранта (СС-GF091050) в RMR М проводит новую CIHR награду следователь зарплаты.

Мы благодарны д-ра. Е. Ханджян, И. Gallouzi, С. Ди-Марко и А. Cammas за полезные советы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки
HeLa рака шейки маткиАмериканская коллекция типовых культур (Манассас, Вирджиния; ATCC)CCL-2
Schneider Drosophila эмбриональные клеткиАмериканская коллекция типовых культур (Манассас, Вирджиния; ATCC)CRL-1963
Питательная среда и добавки
Schneider' s Drosophila MediumSigma-AldrichSO146-500ml 
ДМЭМЛайф технологии11995-073 
FBSFisher Ученый УченыйSH30396-03 
Пенициллин/стрептомицинLife technologies15140122
Растворы сахарозы
D-сахарозыFisher ScientistBP220-212 
ГлицеринSigma-Aldrich49767 
Бромофенол синийFisher ScientistB3925
Лизис буфер
Tris HClFisher ScientistBP153-500
MgCl2Sigma-AldrichM2670-100G
NaClTekniscience3624-05 
DTTSigma-AldrichD 9779 
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )MJS Biolynx19628 
Паспорт безопасностиTekniscience4095-02 
Ингибитор РНКазы (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)Life technologies10777-019 
Антипротеазы (полные, мини, без ЭДТА)Roche11,836,170,001 
Экстракция РНК
протеиназы KLife technologiesAM2542 
Фенол:хлороформFisher ScientistBP1754I-400 
ХлороформFisher ScientistC298-500 
Технологии GlycogenLife10814-010 
ИзопропанолAcros organics327270010 
Антитела
против FMRP антителаФурнье et al., Cancer Cell International, 2010 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
  2. Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
  3. Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
  4. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
  5. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  6. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
  7. Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
  8. Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  9. Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  10. Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
  11. Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
  12. Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
  13. Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
  14. Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
  15. Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
  16. Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
  17. Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
  18. Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
  19. Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
  20. Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
  21. Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
  22. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
  23. Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
  24. Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
  25. Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  27. Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи