Методическая статья

Снизу вверх и дробовик протеомики для идентификации Комплексную Cochlear Proteome

DOI:

10.3791/51186

⸱

7 марта 2014 г.

 , 
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеом анализ кохлеарного сенсорного эпителия может оказаться непростой задачей из-за его небольшого размера и потому мембранные белки трудно выделить и идентифицировать. Оба мембрана и растворимые белки могут быть идентифицированы путем объединения нескольких препаративных методов и методик разделения вместе с масс-спектрометрии высокого разрешения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомика является широко используемым подход, который может дать ответ на сложных биологических систем. Кохлеарный чувствующий эпителий содержит рецепторы, которые преобразовывают механическую энергию звука в электро-химической энергии, обработанного периферической и центральной нервной систем. Несколько протеомические методы были разработаны для изучения кохлеарный внутреннее ухо, например, двухмерным электрофорезом в геле (разница 2D-ПГЛП), антител микрочипов, и масс-спектрометрии (МС). MS является наиболее полным и универсальным инструментом в протеомики и в сочетании с методами разделения может обеспечить углубленный протеома биологических образцов. Методов разделения в сочетании с МС имеет возможность обогатить образцов белка, обнаруживать низкую молекулярную массу и гидрофобных белков, и определить низкие обильные белки путем уменьшения динамического диапазона протеома. Различные стратегии пищеварения могут быть применены ко всей лизата или фракционированного лизата белка для повышения пептид и белокохват последовательность. Использование различных методов разделения, в том числе сильного катионного обмена (SCX), обращенно-фазовой (RP), а также гель-электрофореза элюировали жидкой фракции улавливающего (GELFrEE) могут быть применены для уменьшения сложности образца перед анализом MS для идентификации белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомика является изучение сложных биологических систем на основе анализа экспрессии белка, функции, модификации и взаимодействия 1. Некоторые методы были использованы для протеомного анализа внутреннего уха, в том числе антител микрочипов 2, двухмерным электрофорезом в геле 3-5 и Dige 6. Тем не менее, только ограниченное число белков были идентифицированы и охарактеризованы 2,7-10, по сравнению с более чем 10000 генов и выраженных тегов последовательности (ЭБТ), определенных во внутреннем ухе 11,12, MS является наиболее распространенным и всеобъемлющим техника в протеомики для белка характеристики. Анализ сложных протеомических образцов, таких как улитки, может быть сложной задачей. Тем не менее, сочетание нескольких методов разделения с МС позволяет идентифицировать большее количество пептидов и белков, из-за повышенного диапазона динамического концентрации и пиковой мощности 13. Многомерные хроматограPHY уменьшает весьма сложные белковые смеси, позволяя использование различных механизмов адсорбции. Есть два широко используемых MS подходы анализа протеома, дробовик и снизу вверх протеомика. В дробовика протеомики, смесь интактных белков ферментативно переваривается и разделены с использованием многомерного хроматографии с сильной катионообменной хроматографии (SCX), а затем обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (ОФЖХ) 14,15. Отделенные пептиды подвергают тандемной MS и поиска в базе данных 15. Основным преимуществом этого метода является то, что тысячи белков могут быть определены в одном анализе и метод лучше подходит для мембранных белков.

В снизу вверх, смесь белок отделяется, как правило, одно-или двухмерного электрофореза, а отдельные полосы белка или пятна вырезали и переваривают с ферментом, таким как трипсин, как правило, в результате чего несколько пептидов. Тем не менее, другой более поздниелы разработан электрофоретическую подход, используемый в восходящих протеомики, является GELFrEE. Этот метод фракционируют образцов белка в жидкой фазе и делает их менее сложными до анализа. Этот метод воспроизводимым, предлагает высокое извлечение белка и уменьшает распределение высоких обильных белков в сложных белковых образцов 16. Пептиды, в результате, разделенных белков, анализируются с помощью МС, с помощью пептидной массовой дактилоскопии или тандем MS (MS / MS), для создания тегов последовательности для поиска в базе данных 17-19. Некоторые из основных преимуществ использования подхода снизу вверх являются возможность получения разделения с высоким разрешением и всеобъемлющий охват белка. Восходящие протеомика является наиболее широко используемым методом в протеомики 20, следовательно, несколько биоинформатики инструменты доступны. Кроме того, белки могут быть разделены в сложной смеси перед пищеварения, так что есть большая вероятность идентификации.

Одна из основных проблем,при помощи внутреннего уха для протеомного анализа является ее небольшой размер, ограничивается доступность и тип клеток разнообразие 21. Кроме того, ключевые белки, которые отличают его функциональность, такие как ионные каналы, перевозчиков и рецепторов, являются мембранные белки, которые могут быть трудно выделить 22. Таким образом, подготовка проб фильтр автоматизированного (ФАСП) является выгодным для протеомных анализа тканей, которые ограничены для извлечения белка и которые требуют моющие средства для растворения мембраны 23. Этот фильтр позволяет MS анализа мембраны и растворимых белков и на способность выделения пептидов от низкой молекулярной массой загрязняющих веществ 23,24.

Настоящий протокол описывает часто используемые протеомических подходы, которые объединяются и изменены, чтобы проанализировать как растворимые, так и мембранные белки и максимально увеличить количество идентификаторов белка от кохлеарного сенсорного эпителия. Мы опишем с помощью дробовика протеомики с ФАСП мульти-дайджестион, ионообменной хроматографии, с высоким разрешением МС, и анализ данных. Кроме того, мы опишем снизу вверх протеомики с GELFrEE, FASP мульти-пищеварения, высокое разрешение MS, и анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике

Эксперименты с использованием мышей ткани были утверждены Университета Южной Флориды Институциональная уходу и использованию животных комитета (Протоколы 3931R, 3482R), как изложено в соответствии с руководящими Национальных Институтов Здоровья.

1. Белок Добыча

  1. Изолировать кохлеарной сенсорного эпителия с 16 30-дневных (P30) CBA / J мышей и хранить при температуре -80 ° С
  2. В день эксперимента, мыть ткани с 500 мкл 1х забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Центрифуга течение 3 минут при 1000 х г и удалите супернатант. Повторите в общей сложности три раза.
  3. Разрушать ультразвуком ткань в течение 30 сек на льду в 100 мкл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 120 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 5 мМ ЭДТА, 500 мкг / мл AEBSF, 10 мкг / мл лейпептина, 100 мкг / мл пепстатина, 2 мкг / мл апротинина и 0,5 мкг / мл микроцистин с использованием звуковой dismembrator (модель 100; Thermo Fisher). Прохладный лизат на льдув течение 1 мин между каждым ультразвуком. Разрушать ультразвуком в общей сложности 3 раза.
  4. Центрифуга экстракта при 750 х г при 4 ° С в течение 2 мин и удалить супернатант в новую микропробирки. Экстракт осадок в 50 мкл буфера для лизиса путем обработки ультразвуком в течение 30 сек на льду. Центрифуга экстракта при 750 х г при 4 ° С в течение 2 мин. Объединить оба лизатов и центрифуги в 28 600 мкг при 4 ° С в течение 60 мин. Удалить супернатант в новую микропробирки и добавить 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,1% ASB-14 к осадку. Vortex в течение 1 мин и инкубировать в течение 60 мин при 4 ° С.
  5. Нагреть образец при 95 ° С в течение 5 мин, затем охлаждают при 4 ° С в течение 60 мин. Последующие с центрифугированием при 16000 х г при 25 ° С в течение 10 мин. Сбор супернатант и передачи в новую пробирку.
  6. Центрифуга суспензии при 16000 х г при 4 ° С в течение 5 мин и надосадочную жидкость сохраняют для пищеварения.

2. Двухместный триптический Белок Переваривание всей Lysate Использование FASP

  1. Добавить 30 μл аликвоты (≤ 400 мкг) кохлеарного белкового экстракта, содержащего 4% додецилсульфат натрия (SDS), 100 мМ Трис-HCl, рН 7,6 и 0,1 М дитиотреитола (DTT) непосредственно к спинового фильтра 30К и смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl. Центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  2. Развести концентрат с 200 мкл раствора 8 М мочевины и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  3. Добавить 10 мкл 10Х иодацетамида (IAA) в 8 М раствора мочевины к концентрату в фильтре и вихря в течение 1 мин. Инкубировать спиновый фильтр в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) в темноте с последующим центрифугированием при 14000 х г в течение 10 мин.
  4. Добавить 100 мкл раствора 8 М мочевины к концентрату на блоке фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 50 мМ бикарбоната аммония (ABC) раствора в блок фильтра и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
  5. Добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (вес / вес) фермента к-Белок отношение и инкубировать в течение ночи (O / N) при 37 ° С
  6. После инкубации добавить 40 мкл 50 мМ раствора ABC для фильтрации устройство и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтру спина и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют муравьиной кислоты (FA) до 1,0%, чтобы остановить пищеварение.
  8. Промыть фильтрующий блок с 40 мкл 8 М мочевины, и затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
  9. Промойте фильтрующий блок 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 37 ° С
  10. Элюции триптических пептидов из второго переварить добавлением 40 мкл раствора 50 мМ БКА к устройству фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl вБлок фильтра и центрифуги при 14000 мкг в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют FA до 1,0%.
  12. Образцы могут быть количественно с помощью микропланшет колориметрического анализа с использованием БСА в качестве стандарта.

3. Эндопротеиназой LysC и триптический Белок Переваривание всей Lysate Использование FASP

  1. Добавить 30 мкл аликвоты (≤ 400 мкг) кохлеарного белкового экстракта, содержащего 4% SDS, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,6 и 0,1 М DTT непосредственно к спинового фильтра 30К и смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl . Центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  2. Развести концентрат с 200 мкл раствора 8 М мочевины и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  3. Добавить 10 мкл 10Х IAA в 8 М раствора мочевины к концентрату в фильтре и вихря в течение 1 мин. Выдержите спин фильтр в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте затем центрифуги при 14000 мкг в течение 10 мин.
  4. Добавить 100 мкл 8 М мочевины зольution к концентрату на блоке фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 100 мМ ABC решения блока фильтров и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
  5. Добавить 0,1 мкг / мкл эндопротеиназой LysC в 1:50 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 30 ° С
  6. После инкубации добавляют 40 мкл 100 мМ БКА решения блока фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтру спина и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий пептиды LysC к новому микропробирки и подкисляют FA до 1,0%, чтобы остановить пищеварение.
  8. Промыть фильтрующий блок с 40 мкл 8 М мочевины, и затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
  9. Промойте фильтрующий блок 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 фермент-к-проСоотношение белок и инкубировать O / N при 37 ° С
  10. Элюции триптических пептидов путем добавления 40 мкл раствора 50 мМ БКА к устройству фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl в блок фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют 1,0% FA.
  12. Образец может быть определена количественно с помощью микропланшет колориметрического анализа с BSA в качестве стандарта.

4. Обессоливания Пептиды Использование Spin Columns

  1. Активация колонку с C 18 MacroSpin добавлением 500 мкл ацетонитрила (ACN) и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных после центрифугирования.
  2. Равновесие колонку с 500 мкл 0,1% ФА и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных и повторить этот шаг 1x.
  3. Добавьте до 500 мкл пептида переварить в колонну ANг центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Если объем образца превышает 500 мкл затем повторите этот шаг.
  4. Промыть колонку с 500 мкл 0,1% FA и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточные. Повторите этот шаг 1x.
  5. Добавить 250 мкл соотношении 90:10 АКС-вода в колонну и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Соберите элюент, содержащий обессоленной пептиды и трансфер в свежем микропробирку. Повторите этот шаг 1x.
  6. Высушите обессоленной образец пептида в вакуумной центрифуге и не позволить образец полного высыхания.

5. Ионообменная хроматография

  1. Введите 50-100 мкг переваренной образца белка на 200 х 2,1 мм, 5 SCX мкм колонке (полисульфоэтиловым A), чтобы отделить пептиды.
  2. Использование градиент 2-40% В в течение 50 мин с расходом 250 мкл / мин. Растворитель составляет 5 мМ формиата аммония, рН 3,0 в 25% ацетонитрила и 75% DDH 2 O. Растворитель В 500 мМ формиата аммония, рН6.0 в 25% ACN и 75% DDH 2 O.
  3. Монитор пептидных фракций при 280 нм и собирать фракций в 2-минутными интервалами, используя коллектор фракций.
  4. Сухие дроби в вакуумном концентраторе и ресуспендируют в 500 мкл 50% ацетонитрила в DDH 2 O, содержащей 5% FA, чтобы помочь с удалением соли.
  5. Redry фракции и хранить при температуре -80 ° С до готовности использовать для анализа нано LC-MS/MS.

6. Ацетон Осадки

До разделения GELFrEE кохлеарный супернатант белок должен быть обессоливали. Ацетон осадки могут быть использованы для обессоливания и концентрат белков.

  1. Добавить три тома ледяной ацетона кохлеарного супернатанта. Аккуратно вихрь и инкубировать при температуре -20 ° СО / Н.
  2. Центрифуга образца смеси при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и удалить супернатант.
  3. Промыть 3 раза белка гранул с охлажденным ацетоном и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин при 4° C.
  4. Высушите осадок и растворяют в 112 мкл 18 МОм воды.
  5. Определить концентрацию белка с помощью микропланшет колориметрического анализа.

7. GELFrEE Фракционирование Cochlear сенсорного эпителия

  1. Добавить 30 мкл 5х буфера для образцов (0,25 М Трис-HCl рН 6,8, 10% (вес / объем) SDS, 50% глицерина, 0,5% (вес / объем) бромфеноловый синий) в обессоленной белка, суспендированного в 112 мкл 18 МОм вода.
  2. Добавить 8 мкл 1М DTT и нагревали при 95 ° С в течение 5 мин, чтобы уменьшить белка дисульфидных связей. После нагрева позволяют охлаждения до комнатной температуры.
  3. Добавить 8 мл рабочего буфера для анодного резервуара, 150 мкл рабочего буфера, чтобы пробовать сборную камеру и 6 мл рабочего буфера в катодную водохранилища.
  4. Удалите буфер, который, возможно, текла в образец-загрузочной камеры с помощью пипетки.
  5. Нагрузка 150 мкл (≤ 1 мг) кохлеарного белковой смеси, в выборки загрузочной камеры с использованием 8% Trявляется ацетат картридж с массовым диапазоне 3.5-150 кДа.
  6. Нижние электроды и закройте крышку прибора, чтобы начать бег.
  7. На первом паузы времени на приборе добавить 2 мл рабочего буфера в резервуар катода и возобновить бег.
  8. На каждом паузы интервала на инструменте, собирать пробы из забора пробы камеры с помощью пипетки и добавить свежей надписью микропробирку. Вымойте камеры для сбора 2x 150 мкл рабочего буфера и выбросить.
  9. Добавить 150 мкл свежей проточной буфера на сбор образец камеры и возобновить бег. Сбор белковых фракций в течение периода времени от 2,6 ч в общем объеме 150 мкл / фракции.

8. 1D гель-электрофореза из GELFrEE фракций

Гель-электрофорез 1D может быть использован для визуализации результатов GELFrEE фракционированием до ферментативного расщепления и анализа MS. GELFrEE белковые фракции могут быть разделены на 4-15% Трис-HCl геле.

  1. Смешайте 5 мкл аликвоты каждого GELFrEE фракции с 5 мкл образца разбавляющего буфера (350 мМ DTT в буфере для образцов).
  2. Тепло образцов при 95 ° С в течение 3 мин.
  3. Прохладный образцы до комнатной температуры.
  4. Нагрузка 10 мкл каждого GELFrEE фракции в отдельных полос геля и нагрузка 5 мкл стандарта молекулярного веса в последней неиспользованного пер.
  5. Запуск гель при 125 В в течение 1,5 часа или до передней краситель не достигнет дна геля.
  6. Осторожно снимите гель и окрашивают с серебряной пятна Plus визуализировать разделение белков.

9. Белок Переваривание GELFrEE фракции с использованием FASP

Модифицированная процедура ФАСП используется для удаления детергента и переваривания GELFrEE фракций.

  1. Добавить каждую отдельную фракцию непосредственно к фильтра блока 30К; смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl и центрифуге при 14000 х г в течение 25 мин.
  2. Развести концентрат с 200 мкл раствора мочевиныи центрифуги при 14000 мкг в течение 12 мин. Повторите этот шаг 1x.
  3. Добавить 10 мкл 10Х IAA в растворе мочевины к концентрату в каждом блоке фильтров, вихря в течение 1 мин, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  4. Добавить 100 мкл раствора мочевины к концентрату на фильтровальные установки и центрифуге при 14000 мкг в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 100 мМ ABC решения фильтрующих блоков и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
  5. Добавить 0,1 мкг / мкл LysC для 1:50 (м / м) соотношение фермент-на-белка фильтрующих блоков и инкубировать O / N при 30 ° С
  6. После инкубации добавляют 40 мкл 100 мМ БКА решения спиновых фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl в спиновых фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий пептиды LysC от каждого спинового фильтра к новому микропробирки и подкисляют trifluoroacуксусная кислота (TFA).
  8. Промыть спиновые фильтры с 40 мкл 8 М мочевины, затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
  9. Промыть спиновые фильтры 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 37 ° С
  10. Элюции триптических пептидов из каждого фильтра, добавляя 40 мкл 50 мМ раствора ABC и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтровальные установки и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов из каждого фильтра к новому микропробирки и подкисляют TFA.
  12. Высушите все дайджестов в вакуумной концентратора.

10. Подготовка образцов для LC-MS/MS

  1. Восстановить сушат LysC и триптического пептид переваривает фракции в 20 мкл 0,1% FA и вихря.
  2. Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 10мин и снимите верхнюю 95% образца в новый флакон образца.
  3. Введите 5 мкл каждой пептидной фракции на х 25 мм образца 100 мкм ловушку для удаления солей и загрязнителей и выполнять хроматографического разделения на 75 мкм × 10 см C 18 колонки.
  4. Использование градиент 2-40% В в течение 100 мин при скорости потока 200 л / мин. Растворитель 95% ddH2O и 5% ацетонитрила, содержащего 0,1% FA. Растворитель В составляет 80% ACN и 20% ddH2O, содержащего 0,1% FA.
  5. Соберите десять масс-спектры тандем для каждого MS сканировать на масс-спектрометре высокого разрешения. Масс-спектрометр LTQ Orbitrap был использован в этом эксперименте.

11. Белок Идентификация

  1. Определить белки с использованием базы данных UniProt мыши, содержащий прямом и обратном белковых последовательностей и общих загрязнений. MaxQuant программное обеспечение с MASCOT поисковой системы используется для поиск по базе данных белков.
  2. Параметры поиска, которые могут быть использованы, включают, фиксированный модификAtion из carbamidomethyl цистеина, переменная модификации окисления метионина, белка N-концевое ацетилирование, максимум 2 пропустил расщепление. Минимальная длина пептида, чтобы рассмотреть для идентификации является 6 аминокислот. Введите пептидный массовой концентрации погрешность ± 8 млн и фрагмент массового допуском 1,2 Da (масса ошибок зависит от масс-спектрометр используется).
  3. В программном обеспечении MaxQuant, используйте 1% ложных обнаружения (FDR) для пептидов и белков идентификации. Определение белка в списке с числом соответствующих пептидов, покрытия последовательности процентов белка и пептидных последовательностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы получить наиболее полный протеома кохлеарного сенсорного эпителия, быстро ткани рассечение требуется до извлечения белка и пробоподготовки. Два протеомные методы могут быть использованы, дробовика и снизу вверх протеомики. Для подготовки образцов для дробовика протеомики, ФАСП процедура пищеварение был использован, как показано на рисунке 1. Способ FASP позволяет концентрации белков, удаление моющих средств, и переваривания белков с использованием нескольких ферментов. Были две двойные процедуры, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевые шаги к максимизации идентификации белка от кохлеарного сенсорного эпителия являются: 1) использование нескольких endoproteinases для пищеварения, 2) использование нескольких методов разделения, и 3) использование масс-спектрометра с высоким разрешением. Применение нескольких ферментов увеличивает количество пептидов и улучшает покрытие последовательность белка, что приводит к повышению количества идентифицированных белков от кохлеарного ткани. Трипсин, наиболее часто используемый протеазы обеспечивает эфф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктора Кента Сили, директор Центра по борьбе с наркотиками открытий и инноваций (CDDI) протеомика основной комплекс в Университете Южной Флориды для использования этого объекта. Эта работа была поддержана NIH / NIDCD гранта R01 DC004295 чтобы BHAS

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Картридж с 8% трис-ацетатом Protein Discovery42103
АцетонSigma-Aldrich179124
АцетонитрилHoneywell015-1L
AEBSFCalbiochem101500
Формиат аммонияAC16861Fisher
АпротининCalbiochem616370
ASB-14 Calbiochem182750-5GM
Бычий сывороточный альбуминBioRad500-0112
C18 колонка Новый объективA2511275 μ м х 10 см 
Анализ белка DCBioRad500-0116Протокол анализа на микропланшетах
EDTASigma-AldrichE9884
Эндопротеиназа Lys-CSigma-AldrichP3428
FASP Набор для переваривания белкаProtein Discovery44250
Муравьиная кислота Fluka94318
GELFrEE Система фракционированиябелка Discovery42001GELFrEE 8100
ЛойпептинCalbiochem108975
MacroSpin КолонкаThe Nest GroupSMM SS18VSilica C18
MicrocystinCalbiochem475815
пепстатинSigma-AldrichP5318
Полисульфоэтил АКолонка Гнездовая группа202SE0503
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sonic Dismembrator Thermo Fisher15-338-53Модель 100
ТрипсинСигма-ОлдричT6567Протеомный класс
Научный

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
  2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
  3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
  4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
  5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
  6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
  7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
  8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
  9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
  10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
  11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
  12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
  13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
  14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
  15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
  16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
  17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
  18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
  20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
  21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
  22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
  23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
  24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
  25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
  26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи