Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51192

⸱

16 мая 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

DNabT клетки редки среди периферийных Т-клеток; однако, они широко распространены в определенных нелимфоидных тканей. Сложность выделения DN Т-клеток от не-лимфоидной ткани препятствует их функционального анализа, несмотря на рост признал патофизиологического значение. Мы опишем протокол нового для изоляции высокоочищенных DN Т-клеток из мышиных почки.

Аннотация

Там в настоящее время нет стандартный протокол для выделения DN Т-клеток от не-лимфоидных тканях, несмотря на их более сообщил участия в различных иммунных реакций. DN Т-клетки являются уникальной иммунной тип клеток, который был вовлечен в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций и толерантность к аллотрансплантаты 1-6. DN Т-клетки, однако, редко встречается в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах), но являются основными жители здоровую почку. Очень мало известно об их патофизиологической функции 7 из-за их малочисленности на периферии. Мы недавно описал комплексную фенотипическую и функциональный анализ этой группы населения в почках 8 в стационарном состоянии и во время ишемии реперфузионного повреждения. Анализ функции DN Т-клеток будет значительно повышена путем разработки протокола для их изоляции от почки.

Здесь мы описываем новый протокол, позволяющий isolatioн высокочистых AB CD4 + CD8 + Т-клеток и DN Т-клеток от мышей почки. Вкратце, мы переварить ткань почки с помощью коллагеназы и изолировать почек одноядерные клетки (KMNC) по градиенту плотности. Далее следуют два этапа по обогащению гемопоэтических Т-клетки с 3% до 70% от KMNC. Первый шаг состоит из позитивной селекции кроветворных клеток с использованием CD45 + набор для выделения. На втором этапе, DN Т-клетки негативно выдел ют путем удалени не-желательных клеток с использованием CD4, CD8 и МНС класса II моноклональные антитела и CD1d α-GalCer тетрамер. Эта стратегия приводит к населением более 90% чистых DN Т-клеток. Поверхность окрашивание указанных выше антител с последующим анализом FACS используется для подтверждения чистоты.

Введение

Периферийное αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - дважды отрицательный (DN) Т-клетки делятся на различные подмножества, которые обладают различные фенотипы и функции 1-4. DN Т-клетки плохо изучены, но все чаще участвуют в патофизиологических иммунных реакций в различных моделях болезни 4-6.

DN Т-клетки представляют собой уникальный тип клеток иммунной что все чаще участвует в регуляции различных иммунных и аутоиммунных реакций и модуляции аллотрансплантата толерантности. 4-6, 9 Они редки в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах ). Тем не менее, они являются основными жителями нормальной почек и кишечника эпителия 10-12. Очень мало известно об их функции 7 в почках в стационарном состоянии и при патологических состояниях, таких как острого повреждения почек (AKI), связанные с почечной Transplмуравей.

Из-за сложных ролей различных иммунных клеток в регуляции иммунных реакций, включая alloresponses, определение роли каждого игрока имеет решающее значение в понимании alloresponses и разработке новых терапевтических средств. Учитывая значительное число DN Т-клеток, присутствующих в почках под физиологических и различных болезненных состояний, Д. Н. Т-клетки, вероятно, играют важную роль в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций у мышей и людей, и alloresponses в реципиентов. Накопление хотя все еще рассеянного доказательств подразумевает DN Т-клеток в обоих патогенных и иммуносупрессивных функций, но он плохо понимал, почему и как они проявляют определенную вредных или подавляющий функцию и, как окружающая среда влияет на них.

Из-за их низкой численности в почках, улучшенные методы выделения необходимы.

Там в настоящее время нет стандартный протокол для изоляции Ду Т-клеток из тон не-лимфоидных тканей. Наш протокол описывает новый способ для выделения DN Т-клеток из почки; Однако способ также может быть использован для различных нелимфоидных тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка инструментов, питательных сред и реактивов

  1. Инструменты: Подготовка реагентов в стерильных условиях и использовать под ламинаре.
  2. Подготовка 1 л RPMI тканевой культуральной среде, добавляют 5% фетальной бычьей сыворотки, 2,1 г бикарбоната, 10 мл глутамат 100x 10 мг HEPES, 1 мг пирувата натри и 10 мл 100x пенициллина / стрептомицина.
    Примечание: рекомендуется для культуры ткани средняя, ​​RPMI, взаимозаменяем с DMEM.
  3. Подготовка 5% раствором коллагеназы "D" (5 мл коллагеназы "D" в 9 мл тканевой культуральной среде).
  4. Сделать решение Перколла на трех различных концентрациях: 100%, 80% и 40%. Следующие концентрации рассчитаны на 1 выборку. Держите решения при комнатной температуре.
    1. Перколла решение: добавить 9 мл неразбавленного Перколла (от маточного раствора); добавить 1 мл PBS в 10 раз.
    2. Перколла решение: добавить 8 мл Перколла 100%; добавить 2 мл PBS 1x.
    3. Перколла решение:добавить 4 мл Перколла 80%; добавить 4 мл PBS 1X.
  5. Сделать 1 л флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) буфер; добавить 5 мл 10% BSA (0,1% BSA), 1 мл 10% азида натрия (0,1%), 2 мл ЭДТА агента, сделать до 1000 мл с 1x PBS.

2. Подготовка почек пищеварения

  1. Получив всю необходимую институциональную одобрение, жертвовать и обескровить мышей с использованием стандартных методов и следуя действующих правил и руководящих принципов по уходу за животными.
    1. Обезболить мышь с фенобарбиталом (0,07 мг / кг).
    2. Перейдите к обескровливания.
    3. Наведите в положении лежа на спине на хирургическом столе.
    4. Спрей области живота с 70% этанола.
  2. Добавьте 10 мл коллагеназы D раствора к чашке Петри.
  3. Снимите и decapsulate обе почки у каждой мыши.
    1. Откройте полость abdomimal, сделав срединный разрез через кожу живота и брюшины от грудины долобок.
    2. Проэкспонируйте левую почку, перемещая кишку в поперечном направлении в сторону.
    3. Аккуратно отделите левую капсулу с пинцетом.
      Примечание: Капсула выглядит как прозрачный слой, окружающий почку и частично покрываются за счет околопочечной жировой ткани.
    4. Снимите левую почку за счет сокращения ножки сосудов с использованием хирургического ножницы.
    5. Повторите ту же процедуру для правой почки.
      Примечание: Правая почка больше черепной и ближе к средней линии (стебельков короче).
  4. Поместите почку в чашке Петри.
  5. Разрежьте ткань почки на мелкие кусочки (1-2 мм в размерности) с помощью обычного ножа для обработки металла и поместить части в коллагеназы решение в течение 30-45 мин в инкубаторе при температуре 37 ° С (рис. 1).

3. Подготовка почек мононуклеарных клеток (KMNC) из почек пищеварения

  1. Получение суспензии клеток почкипищеварение путем механического разрушения ткани с использованием сетчатый фильтр (70 мкм) и ресуспендируют в 25 мл тканевой культуральной среде и перемешать.
  2. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения суспензии клеток.
  3. Повторное приостановить осадок в 4 мл 40% раствора перколла и осторожно наложить на 4 мл 80%-ного раствора перколла с передачей пластиковой пипетки, очень медленно и осторожно. Это приведет в два этапа четко разделенных полупрозрачного слоя. На вершине будет желтый слой, соответствующий липидов.
  4. Центрифуга при 1500 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре с центрифуги в тормоза отключена.
  5. Удалить стремлением желтый и толстый верхний слой (около 1-2 мл).
  6. Соберите только небольшое беловатый полупрозрачный слой с поверхности раздела двух фаз с пипетки. Очень осторожно перенести этот суспензии в 15 мл коническую пробирку, содержащую 2 мл культуральной среде, а затем добавить 13 мл среды, чтобы сделать общий объем15 мл.
  7. Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Ресуспендируют образцы в 1 мл среды.
  9. Подсчитайте количество KMNC использованием трипанового синего на гемоцитометре и выразить результаты в виде чисел KMNC в мл на почки.
  10. Промыть раз, как описано выше.

4. Выделение гемопоэтических (CD45 +) Клетки из KMNC (Этап I)

  1. Ресуспендируют клеток до 10 7 в 90 мкл рабочего буфера.
  2. Добавить 10 мкл CD45 микрошариков и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С.
  3. Добавить 1 мл подвижного буфера для остановки реакции. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 500 мкл рабочего буфера.
  4. Подготовка магнитную колонку, поместив в магните и промыть 3 мл рабочего буфера.
  5. Pass клеточной суспензии через магнитное колонку и собирают немеченого клетки, которые проходят через колонку.
  6. Промыть клетки три раза 3 мл РуннING буфер. Тогда собрать стоки.
  7. Удалите столбец из сепаратора и пипеткой 5 мл рабочего буфера на колонках и немедленно промыть меченого фракции. Эта фракция содержит CD45 + клеток. Граф клеток.
  8. Чтобы вычислить абсолютное количество различных Т-клетки подмножеств в почках умножить общее количество KMNC на процент положительных клеток, определенной с помощью проточной цитометрии (рис. 2).

5. Выделение DN Т-клеток из CD45 + Подготовка по негативной селекции (II этап)

  1. Добавить 2,5 мкл (0,5 мг / мл, 1,25 мкг) каждой из следующих биотинилированных антител: анти-CD4, анти-CD8, анти-Fc рецептор (CD16/32), анти-МНС класса II (IA б), анти- CD1d PBS-57 тетрамером на каждые 10 7 кроветворных клеток.
  2. Инкубируйте клетки в течение 30 мин в холодном помещении.
  3. Добавить 1 мл анти-биотин микрошарики.
  4. Выдержите в течение 30 мин в холодной комнате.
  5. Поместите пробирку в тон магнит и перейти к истощению.
  6. Подсчет жизнеспособных клеток, чтобы определить общее количество Т-клеток DN в отрицательном фракции с помощью гемоцитометра.
  7. Проверьте чистоту DN Т-клеток с проточной цитометрии следуя литниковой стратегии: первые ворота CD45 +, вторые ворота TCRαβ +. Исключить CD1d + клеток. Участок CD4 + по сравнению с CD8 +, чтобы определить DN Т-клетки (рис. 3).
  8. Умножьте общее количество на процент определяется в чистоте.
    Примечание: С помощью этой результатов протокола в популяции более 90% чистых DN Т-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Дикого типа C57BL / 6 (В6) почки содержит около 1,5-2,1 х 10 6 мононуклеаров на почки. Примерно менее 10% являются гемопоэтические клетки CD45 +. Для приготовления почек мононуклеарных клеток (KMNC), почки разрезают на маленькие кусочки, как показано на рисунке 1 с последующим расщеплением с использованием 5% коллагеназы.

За этим следует выполнения центрифугирования в градиенте плотности для сбора KMNC слой (рис. 2, слева). KMNC затем п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует растущий интерес к DN Т-клеток, так как они в настоящее время участвуют в различных патологических состояний, таких как аутоиммунные расстройства, рак, терпимости трансплантата и первичных заболеваний почек, включая острого повреждения почек (AKI), гломерулонефрит 8, 13. Таким образом, существует необходимость, чтобы лучше понять и охарактеризовать патофизиологических функций DN Т-клеток. Тем не менее, в настоящее время существует недостаток в понимании функции этих клеток по сравнению с CD4 и CD8 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH PBS (R21 AI095484). Мы благодарим NHI тетрамерное основной объект для CD1d тетрамере.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ламинарный колпак Baker Company, IncИли аналогичное оборудование 
ЦентрифугаBeckman CoulterИли аналогичное оборудование 
ГемоцитометрЭлектронная микроскопия Sciences63514-11
Инкубатор с контролируемой атмосферойFisher Scientific ( 37 ° C с 5% CO2)
Аналитический проточный цитометрLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Collagenase DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
Фетальная бычья сыворотка Corning Cellgro35-011-CV
0,1% азид натрия (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Буферный фосфатно-солевой буфер (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA buffer Колонны Sigma-AldrichE1161
LS MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ микрогранулыMiltenyiBiotec6.78E-51
Биотиновые микрогранулы MiltenyiBiotec130-090-485
анти-CD45 (клон: 30-F11)  PerCP eBioscienceG1397
анти-CD45 (клон: 30-F11)  APC-Cy7Biolegend103116
анти-TCR Pacific Blue  (ab-цепь, клон: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
анти-CD4 биотинилированный (GK1.5)BD553728
анти-CD8 биотинилированный  (клон 53-6.7)BD553029
анти-MHC класс II (I-A B) биотинилированныйBD553609
Рабочий буфер AutoMACS - Буфер для разделения MACS MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J мышиJackson Labs000664Почки - Лимфатические узлы
чашки Петри BD Biosciences356517
70 μ m filter 22363548Fisher Plunger
 Или аналогичное оборудование 
Пробирки GeneMate 50 млBioexpressC-3394-3Или аналогичное оборудование 
Пробирки GeneMate 15 млBioexpressC-3394-1или аналогичное оборудование 
CD1d α-гальцерный тетрамерNHI
Научный

Ссылки

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

Теги

Мононуклеарные клетки почекколлагеназное перевариваниецентрифугирование в градиенте плотностиположительная селекция CD45отрицательная селекцияпроточная цитометрияразделение с помощью магнитных частицобогащение популяции гемопоэтических клетоквыделение почек мыши
Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.