Стресс гранулы (SGS) являются цитоплазматические гранулы РНК, содержащие зашедших в тупик частицы рибонуклеопротеин (мяРНП), и важно в клеточного ответа на различных стрессов. Динамика ИК может следовать в живых клетках, визуализируя локализацию помеченной составляющей ИК в трансфектированных первичных клеток после стресса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация G3BP стресс Гранулы Dynamics в живых первичных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
SGs могут быть визуализированы в клетках иммунным окрашиванием конкретных белковых компонентов или полиА + мРНК. SGs очень динамичны и изучение их собраний и судьбы Важно понимать, клеточный ответ на стресс. Дефицит в ключевых факторов ПГ как G3BP (домен связывающий белок RasGAP SH3) приводит к дефектам развития у мышей и изменениями центральной нервной системы. Для изучения динамики ИК в клетках из организма, можно культуры первичных клеток и следуйте локализацию трансфицированной меткой компонента ПГ. Мы описываем покадровой эксперимент наблюдать G3BP1 содержащих ГХ в мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Этот метод также может быть использован для изучения G3BP содержащих ГХ в живых нейронов, что имеет решающее значение, как недавно было показано, что эти SGs формируются в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Этот подход может быть адаптирован к любым другим компонентом клеточного тела и гранулы белка, и выполняетсяс трансгенными животными, позволяя живой исследование динамики гранул, например, в отсутствие конкретного фактора этих гранул.
Введение
Стресс гранулы (SGS) не являются мембранные цитоплазматический очаги образуются в клеточном защитной реакции на воздействия окружающей среды, например, повышенной температуре, окислительный стресс, гипоксия, осмотического шока, УФ-облучения, лишение глюкозы или вирусной инфекции 1. Они могут быть индуцирован химически путем обработки соединений, таких как арсенита натрия, который вызывает окислительный стресс. SGs накапливаются тупик перевода арестован посыльного рибонуклеопротеин (mRNPs) комплексы 2, наложение ареста мРНК от трансляционного аппарата, и их сборка может быть вызвано фосфорилирования eIF2α (коэффициент эукариотической инициации 2 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животные процедуры в настоящем Протоколе в строгом соответствии с руководящими принципами Директивы Европейского сообщества Совета от 24 ноября 1986 (86-609/EEC). Дом мышей в группе, что позволяет пищу и воду без ограничений. Поддерживать их в контролируемой среде (22 ± 1 ° С, 55 ± 5% влажности) с 12 часов: 12 часов света: темно-цикла (свет на в 7:00).
1 Культура мышиный первичных элементов:. Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)
- Автоклав тонкие щипцы, а также изогнутые щипцы и рассекает ножницы. Хранить в стерильный контейнер. С помощью стерильного D-PBS (Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим растворо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Формирование Стресс гранула имеет важное значение в реакции клеток на стресс, позволяя сотовый адаптации с заблокированным перевода, пока стресс не освободится, связанные с предотвращением апоптоза. Разрешения на этом анализе для изучения ГХ в первичных клеток, следуя локализации ключевых компонентов SGS белка (рис. 1). G3BP, ключевым фактором SGS сборки, присутствует довольно диффузно в цитоплазме культивируемых MEFs или нейронов (рис. 2A а и с), и, очевидно, присутств.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важные шаги в протоколе озабоченностью трансфекции и более конкретно приобретений промежуток времени, которые должны быть тщательно проверены, чтобы снизить вниз цитотоксичность.
Культура первичных элементов не является трудной частью, пока стерильные условия поддерживаются и осторожность берется для того, чтобы предотвратить повреждение во время вскрытия и диссоциации клеток шагов. MEFs можно хранить в замороженном на ранних проходов. Neuron трансфекции с фосфатом кальция было пока.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность за Монпелье Рио томография (МРТ) платформу, где были проведены приобретения. Они благодарят Isabel Cristina Lopez Mejia, Александра Мец, Ирина Lassot, Соланж Desagher, Фабьен Loustalot и Виржини Жорже за помощь в разных частях протокола. Эта работа была поддержана Fondation Pour La Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-п ° DEQ20111223745).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Предварительный прогрев при 37 °deg; C |
| Пируват натрия | Gibco | 11360 | |
| Заменимые аминокислоты | Gibco | 11140 | |
| L-глутамин | Gibco | 25030 | |
| Трипсин | Gibco | 15096 | |
| Стеклянное дно B-35 | Greiner | 627860/627861 | Обработано или нет (лечится: увеличивает прикрепление адгезивных клеток) |
| Поли-L-лизин | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Предварительный прогрев при 37 °de; C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Нейробазальный | Gibco | 21103 | Разогрев при 37 °de; C |
| 2-меркаптоэтанол | Gibco | 31350 | |
| Щипцы | Biotek | DU-110-A | Очень тонкие, наконечники 0,1 мм (полезны для удаления мозговых оболочек) |
| Изогнутые щипцы | Biotek | P-110-BUF | Очень тонкие, кончики 0,1 мм |
| Маленькие ножницы | Biotek | CM-85-BS | Могут быть полезны для удаления гиппокампа |
| Polyplus трансфекцией Реагент JetPEI | Ozyme | 101-10 | MEFs трансфекция, по прямому протоколу |
| Инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | Leica | SP5 |
Ссылки
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
