Измерения воздействия бактерий на C. Элеганс Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение

Summary

Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным методом для количественной яйцекладки поведения. Изменения в откладки яиц может быть поведенческая реакция модельного организма Caenorhabditis Элеганс Потенциально вредных экологических веществ, таких как произведенные патогенных бактерий.

Abstract

C. Элеганс яйцекладка поведение влияют сигналы окружающей среды, такие как осмолярность ¹ и вибрации ^2. При полном отсутствии питания C. Элеганс также прекратить яйцекладка и сохранять оплодотворенные яйца в матке ^3. Тем не менее, влияние различных источников пищи, особенно патогенных бактерий и, в частности Enterococcus фекальный, на яйцекладка поведение не хорошо описана. Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным инструментом для количественной оценки влияния различных видов бактерий, в данном случае Е. фекальный, на яйцекладка поведения.

ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс ^4. Анализ ЕНИ включает отбеливание поставил, беременной взрослого C. Элеганс для удаления кутикулы и отделите сохранил яйца от животного. До отбеливания, червей подвергаются воздействию бактерий (или любой другой тип экологических кий) В течение фиксированного периода времени. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц, сохранил в матку червей. В этом анализе количественного увеличения яйцо удержание после E. фекальный воздействие может быть легко измерено. Анализ EIW поведенческие анализа, которые могут быть использованы для скрининга потенциально патогенных бактерий или наличие токсинов окружающей среды. Кроме того, анализ EIW может быть инструментом для скрининга препаратов, которые влияют на нейротрансмиттер сигнализации с яйцекладки поведение модулируется нейротрансмиттеров, таких как серотонин и ацетилхолин ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis Элеганс, микроскопический, свободной жизни аскариды, является модельным организмом традиционно используется для изучения и развития клеточных сигнальных процессах из-за его прозрачной анатомии, хорошо характеризуется, С-геномом, последовательность, короткая поколение времени, и генетической гомологии для человека . Совсем недавно С. Элеганс стала модель организма в области экологической токсикологии и врожденный иммунитет ^{10, 11.}

Эти самооплодотворяющимися гермафродиты черви становятся половозрелыми в течение двух-трех дней вылупления из яйца. Во время его жизненного цикла, C. Элеганс проходит через четыре личиночной стадии (L1-L4), до достижения совершеннолетия. Один изолированный гермафродитом может производить, в среднем, 300 потомство в течение трех дней пик плодовитости. В зрелом репродуктивном C. Элеганс гермафродиты, оплодотворенные яйца задерживаются в матке в течение нескольких часов перед укладкой.Нормальное количество яиц, хранившихся в матке в любой момент времени (во время пика плодовитости) составляет от десяти до пятнадцати ^12. Число яиц в матке является функцией как скорость производства яиц и скорость откладки яиц. Оплодотворенные яйцеклетки изгоняется из полости матки на сокращения вульвы шестнадцать мышц, расположенных вокруг открытия вульвы ^13. Гермафродит конкретных двигательных нейронов (HSN), и VC синапсов мотонейронов на вульвы мышц, влияющих сокращение мышц и, следовательно, яйценоскость поведения ^5,7,13,14. Высылка яйца из матки происходит за счет скоординированной деятельности нейронов и мышц.

Лаборатория культур C. Элеганс, как правило, поднял на диете из непатогенных кишечная палочка OP50. В природной среде, C. Элеганс вступают в контакт с различных пищевых источников, таких как патогенные бактерии, которые могут быть потенциально вредными. Под воздействием вредных веществ вокружающей среде, C. Элеганс сохранить яйца, пока окружающая среда не станет более благоприятной. Предположительно это яйцо удержания усилия, чтобы защитить их потомство.

В этом яйцо в червя (ЕНИ) анализа, C. Элеганс подвергаются воздействию потенциально патогенных бактерий, Enterococcus фекальный, который находится в окружающей среде. Воздействие патогенных форм E. фекальный может привести к постоянной кишечной инфекции и даже смерти в C. Элеганс ^15. Воздействие других форм патогенных бактерий, как было показано, влияют на яйцо удержание ^16,17, однако эффект не был количественно. Кроме того, эффект мягко патогенных штаммов E. фекальный, штаммы, которые не сразу смертельным, на яйцекладка поведении не было изучено.

ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс ^4. Хотя C. Элеганспрозрачны, яйца накапливается в матке может быть трудно определить количественно в интактного животного. Анализ ЕНИ включает отбеливание беременной взрослого C. Элеганс, которые подвергались воздействию бактерий в течение фиксированного периода времени. Раствор отбеливателя растворяет кутикулу внешней оставляя за яйца. Яйца преломления к воздействию отбеливатель в связи с наличием защитного скорлупы. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц выпустили из матки червей на отбеливание.

Анализ, описанный простой, недорогой и быстрый метод для количественного определения количества яиц в матке в одно время, и, таким образом количественной оценки последствий E. фекальный на яйцо удержания. Этот анализ может быть использован для количественной оценки влияния других видов бактерий, токсины окружающей среды или препаратов на яйцо удержания. Этот анализ также имеет потенциал для использования в качестве экрана для бактериальной патогенности.

Protocol

1) Получение медиа Нематоды роста (НГО)

1. Чтобы 50 пластин, добавьте 1,5 г NaCl, 8,5 г Ultrapure агар и 1,25 г пептона до 1 Lflask.
2. Добавить 487,5 мл дН ₂ O в колбу. Вихревой осторожно перемешать и охватывают открытие колбе с куском алюминиевой фольги.
3. Стерилизовать раствор в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° C, 20 мин).
4. Дайте раствору остыть до 45 ° С на водяной бане.
5. К раствору, добавьте следующую по порядку: 500 мкл холестерина из 5 мг / мл маточного раствора (растворяют в этаноле), 500 мкл 1 М CaCl _2, 500 мкл 1 М MgSO ₄ и 12,5 мл КПО ₄ буфера (54,15 г KH ₂ PO ₄ и 17,8 г К ₂ НРО ₄ в 500 мл дН ₂ O), как описано в ^18.
6. Использование стерильной пипеткой, добавляют 10 мл раствора агара, чтобы каждые 60 мм чашки Петри полистирола. Разрешить СМИ укрепить при комнатной температуре OvernIGHT.

2) Получение B Бульон E. Медиа палочка

1. Чтобы пяти культур 100 мл, добавить 5,0 г бактотриптон, 2,5 г дрожжевого экстракта, 5,0 г NaCl в стакан.
2. Добавить стерильной дистиллированной водой до конечного объема 500 мл. Раствор нагревают на горячей плите, при помешивании до растворенные вещества не растворятся.
3. Залить 100 мл бульона B на пять стеклянных бутылках (по крайней мере 200 мл объема).
4. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
5. Разрешить B бульон охлаждают до комнатной температуры перед использованием.

3) Сеялки C. Плиты Элеганс обслуживание

1. После того как NGM пластин высохнуть при комнатной температуре в течение по крайней мере одной недели, один прививку 100 мл культурального бульона B с помощью нескольких колоний E. палочка (OP50).
2. Расти E. кишечной культивирования при 37 ° С в течение ночи.
3. Пипетка одну-две капли (около 10081; л) из OP50 культуры на центр каждой пластины NGM. Пластины обычно сложены крышки вверх. Когда пипетки (посев), начинают с помощью пипетки культуры на тарелку в нижней части стопки. Работа ваш путь каждого стека. Попытка не для перемещения пластин после посева, поскольку важно, чтобы культура не слишком близко к краю пластины.
4. Разрешить семенами пластин высохнуть при комнатной температуре в течение не менее одной недели, прежде чем использовать.
5. Отобранные пластины хранятся (перевернутого) в запечатанных пластиковых контейнерах при комнатной температуре.

4) поддержание C. Штаммы Элеганс

1. Для поддержания сытых C. Элеганс акции, использовать червя выбрать, чтобы переместить три L4S или беременной взрослых на новый, отобранный NGM пластины каждые 3-4 дня.
2. Магазин пластин (перевернутый), предпочтительно внутри инкубатор при 15 - 22 ° С. Культуры в анализах, описанных хранили при 20 ° С. Элеганс развития зависит от температуры. Как Maintenaсть повышение температуры, время между стадиями развития уменьшается.

5) Подготовка триптической соевый агар (TSA) E. фекальный Культура СМИ

1. Чтобы 50 пластин, измерения 500 мл стерильной дистиллированной водой в колбу и довести до кипения, помешивая, на плите.
2. Добавить 20 г агара порошкообразных TSA в колбу и позволить, чтобы растворить.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Дайте раствору остыть до 45 ° С на водяной бане.
5. Использование стерильной пипеткой, добавляют 10 мл раствора агара, чтобы каждые 60 мм чашки Петри полистирола. Разрешить СМИ затвердевать при комнатной температуре на ночь.

6) подготовка триптической соевый бульон (TSB) E. фекальный Культура СМИ

1. Чтобы 250 трубы культуры, измерения 500 мл стерильной дистиллированной воды в колбу и теплой на плите при перемешивании.
2. Добавьте 15 г порошка агар TSB в колбу и позволить порошку до растворения.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Разрешить раствор охлаждают до комнатной температуры, затем пипеткой 2 мл в стерильные 5 мл пробирок.

7) подготовка сердечно-мозговым вливания (BHI) СМИ, стрептомицин, для E. фекальный культуры

1. Измерьте 500 мл стерильной дистиллированной водой в колбу и довести до кипения, помешивая, на плите.
2. Добавить 26 г среды BHI в колбу и позволить, чтобы растворить.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Разрешить раствор охлаждают до 45 ° С на водяной бане.
5. С использованием стерильной техники, добавляют 0,5 мл 10 мг / мл маточного раствора стрептомицина и вихрем перемешать.
6. Добавить 10 мл раствора в каждую 60 мм чашку Петри полистирола.
7. Разрешить СМИ затвердевать при комнатной температуре на ночь. Магазин пластин (перевернутого) при 4 ° С вплоть до нескольких часов перед использованием.

8) поддержание E. Штаммы фекальный

1. Для поддержания E. фекальный акции, использовать стерильную петлю, чтобы подряд отдельных колоний на отдельные триптическому соевый агар (TSA) пластин.
2. Grow культур при 37 ° С в течение ночи. Магазин пластин (перевернутая) в запечатанном пакете или коробке при комнатной температуре в течение нескольких недель.

9) подготовка E. фекальный Пластины для анализа ЕНИ

1. Инокулируйте 2 мл TSB культуры с колонии E. фекальный и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
2. Внесите 20 мкл E. фекальный культуры на центр подготовленных BHI-стрептомицин пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.

10) Подготовка E. Пластины для кишечной ЕНИ анализа (управления пластины)

1. Привить 100 мл B-Broй культуры с колонии E. кишечной OP50 и инкубируют в течение ночи при 37 ° C
2. Пипеткой 20 мкл OP50 культуры на центр затравки NGM пластины и позволить семенами пластин высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.

11) Яйцо в Пробирной Worm

1. Возьмите 15 - 20-L4 поставил C. Элеганс (рис. 1) на центр газон бактерий на подготовленную BHI-Стрептококковое-E. фекальный пластины. Будьте осторожны, чтобы не передавать много OP50 к пластине BHI. Выбор такого же количества L4S для управления NGM-OP50 пластины.
2. Планшеты инкубируют в течение 40 ч при 20 ° С.
3. Подготовить 20% раствором хлорной извести. Смешайте коммерческих отбеливателем (6,0% гипохлорита натрия) с соответствующим объемом дистиллированной воды.
4. Добавить 10 мкл капли раствора отбеливателя до десяти различных местах на пластиковой крышкой (червя или бактериальной табличку).
5. Использование червей выбор, передачи одного червя в каждой отбеливателя капли. Аккуратно водоворот кончикПика в капли отбеливателя, чтобы убедиться, червь смыла конце выбор (подтвердить, просмотрев капли при вскрытии микроскопом).
6. Разрешить кутикулы распустить в течение примерно 10 минут или пока черви не распахнулась, изгнав яйца (рис. 2). Будьте осторожны, чтобы не передавать яйца от пластины.
7. Использование рассекает микроскопом, подсчитать яйца в каждую каплю отбеливателя.

Results

Этот анализ позволяет количественно количество яиц сохранены в C. Элеганс после воздействия E. фекальный. L4 постановке черви (характеризуется прозрачной открытое пространство над их вульвы, рисунок 1), подвергают воздействию E. фекальный до зрелого возраста. После сорока часов воздействия E. фекальный, отбеливание проводилось. Как кутикулы распалась в капли отбеливателя, яйца стали более очевидными (рис. 2). Количество удержанных яиц легко количестве...

Discussion

Наиболее важных шагов в успешного проведения этого анализа: 1) с помощью сытых запасов C. Элеганс, 2) культивирование одного типа бактерий на планшет для анализа, 3) точно идентифицировать постановке L4 червей для воздействия E. фекальный, 4) сохранение Выдержка Е. фекальный последовательным во всех испытаниях и 5) отбеливание время не должно превышать десяти минут, чтобы предотвратить распад яйцо.

Для этого анализа важно выбрать здоровые, сытые червей. Материнское...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Агар, сверхчистый	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion обезвоженная среда	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 штамм	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Холестерин	Альфа Аесар А11470
Культуральные планшеты для C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Культуральные планшеты для штаммов
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis			Все изоляты были подтверждены как энтерококки<
все штаммы выросли на 44,5 º С и были каталазоотрицательными и гидролизованными эскулинами. Упрощенный  (арабиноза, маннитол, метил-&альфа;-D-глукопиранозид (МГП), рибоза, сорбоза и сорбит) разрешены; и сорбоза отрицательная и сорбит, маннит и рибоза положительные). Все предполагаемые штаммы Efs  подтверждено с помощью системы API 20 STREP (Biomerieux).
Микроскоп	Motic	SMZ 168B	любой микроскоп с пропускаемым освещением и 50-кратным увеличением должен быть достаточным
Стрептомицина сульфат	Fisher BioReagents	BP910-50
Триптик Соевый агар (соя-казеиновый Digest Агаровая среда), Difco	Becton Dickinson	236950
Триптиказ соевый бульон (соево-казеиновая среда для расщепления), BBL	Becton Dickinson	211768
дрожжевой экстракт	Acros	61180-1000