Method Article

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опишем планирование эксперимента подхода, который может использоваться, чтобы определить и смоделировать влияние регуляторных элементов трансгенных, рост и развитие растений, параметров и условий инкубации на временной экспрессии моноклональных антител и репортерных белков в растениях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения обеспечивают множество преимуществ для производства биофармацевтических препаратов, включая низкие затраты, масштабируемость и безопасность. Кратковременная экспрессия предлагает дополнительное преимущество короткого развития и производства раз, но уровни экспрессии могут существенно различаться между партиями таким образом, послуживших основанием для регуляторных проблем в контексте надлежащей производственной практики. Мы использовали дизайн эксперименты (DOE) подхода для определения влияния основных факторов, таких как регуляторных элементов в конструкции экспрессии, рост растений и параметров развития, а также условия инкубации в течение выражения, по изменчивости экспрессии между партиями. Мы протестировали растения, выражающие модель анти-ВИЧ моноклональное антитело (2G12) и флуоресцентный маркер белок (DsRed). Обсуждается обоснование выбора определенных свойств модели и выявить его потенциальные ограничения. Общий подход может быть легко переведены в другие проблемы, поскольку принципы модели Авновь широко применимы: основанной на знаниях выбор параметров, снижение сложности путем разделения исходную задачу на более мелкие модули, программное обеспечение наведением установки оптимальных комбинаций эксперимента и поэтапного проектирования увеличения. Таким образом, методология не только полезно для характеристики экспрессии белка в растениях, но и для исследования других сложных систем, не имеющих механистический описание. Прогнозные уравнения, описывающие взаимосвязь между параметрами можно использовать для установления механистические модели для других сложных систем.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство биофармацевтических белков в растениях является выгодным, поскольку растения являются недорогими расти, платформа может быть расширен только путем выращивания больше растений, и патогены человека не в состоянии воспроизвести 1,2. Переходные стратегии экспрессии на основе, например, на инфильтрацией листьев с Agrobacterium tumefaciens обеспечивает дополнительные преимущества, так как время между точкой доставки ДНК и доставки очищенного продукта снижается с нескольких лет до менее чем за 2 месяца 3. Переходный выражение используется также для функционального анализа, например, для тестирования генов для их способнос....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Планирование стратегии DoE

  1. Определите соответствующие факторы и ответы для включения в проект.
    1. Определите один или несколько ответов для измерения. Здесь были использованы уровни экспрессии 2G12 и DsRed (мкг / мл), в том числе минимальном допустимом разницы рассматривается как соответствующие (10 и 20 мкг / мл, соответственно) и приблизительное значение для предполагаемого стандартного отклонения системы (4 и 8 мкг / мл, соответственно) на основе предыдущих экспериментов.
    2. Используйте имеющуюся литературу, данные из предыдущих экспериментов или специализированных конструкций скрининга (например, факторного плана, см. введение)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описательная модель для накопления DsRed во временной экспрессии с использованием различных промоутеров и 5'UTRs

DsRed флуоресценции в экстрактах листьев используется для указания уровня экспрессии рекомбинантного белка и, таким образом, был использован в качестве ответа в стратегии Доу. Минимальная определяемая разница мы рассматривали отношение было 20 мкг / мл и оценивается стандартное отклонение системы было 8 мкг / мл на основе первоначальных экспериментов. Факторы, вкл.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каждый эксперимент требует тщательного планирования, поскольку ресурсы часто дефицитным и дорогим. Это особенно верно для стратегий Доу, так как ошибки на этапе планирования (например, выбора базовой модели, которая не покрывает все значимые взаимодействия факторов) может существенно уменьшить предсказательной силой получаемых моделей и тем самым обесценить весь эксперимент. Тем не менее, эти ошибки можно легко избежать путем следующих основных процедур.

Соображения при планировании Do.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пошлина за публикацию частично спонсируется компаниями Statease, Inc (США) и Statcon (Германия), которые не были вовлечены в участие в подготовке рукописи или ответственность за его содержание.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны д-р Томас Радемахер для обеспечения растений вектор экспрессии PPAM и Ибрахима аль Amedi для выращивания табачные растения, используемые в данном исследовании. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Ричарда М. Twyman за его помощь в редактировании рукописи. Эта работа была частично финансируется Европейским исследовательским советом Расширенный Грант "Future-Фарма", число предложений 269110 и Фраунгофера Zukunftsstiftung (Fraunhofer Будущее Фонд).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Эксперт по дизайну 8Stat-Ease, Inc.н.а.Программноеобеспечение DoE
ТриптонCarl Roth GmbH8952.2Медиакомпонент
Дрожжевой экстрактCarl Roth GmbH2363.2Медиакомпонент
Хлорид натрияCarl Roth GmbHP029.2Медиакомпонент
ампициллинCarl Roth GmbHK029.2Антибиотик
агар-агарCarl Roth GmbH5210.2Медиакомпонент
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Микроорганизм
pPAMGenBankAY027531Клонирование/экспрессия вектора;  
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Набор для выделения плазмидной ДНК
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Набор для очистки плазмидной ДНК
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193Lрестрикционная эндонуклеаза
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101Lрестрикционная эндонуклеаза
AscIНовая Англия Биолабс Инк.R0558LРестрикционенунуклеаза
NEB 4Новая Англия Биолабс Инк.B7004SРестрикционный эндонуклеазный буфер
TRISCarl Roth GmbH4855.3Медиакомпонент
динатрия тетраборатCarl Roth GmbH4403.3Медиакомпонент
ЭДТАCarl Roth GmbH8040.2
Медиакомпонент агарозаCarl Roth GmbH6352.4Медиакомпонент
бромофенол синийCarl Roth GmbHA512.1Индикатор цвета
КсилолцианолCarl RothGmbH A513.1Индикатор цвета
ГлицеринCarl Roth GmbH7530.2Компонент среды
Мини-субэлемент GT CellBioRad170-4406Камера для электрофореза в геле
Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101:pMP90RKDSMZ12365Микроорганизм
Электропоратор 2510Eppendorf4307000.658Электропоратор
Говяжий экстрактCarl Roth GmbHX975.2Медиа
компонент PeptoneCarl Roth GmbH2365.2Медиа компонент
СахарозаCarl Roth GmbH4621.2Медиа компонент
Сульфат магнияCarl Roth GmbH0261.3Медиа компонент
КарбенициллинCarl Roth GmbH6344.2Антибиотик
канамицинCarl Roth GmbHT832.3Антибиотик
рифампицинCarl Roth GmbH4163.2
Антибиотик FWD праймерEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV праймерEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 ТермоамплификаторApplied Biosystems4359659Термоамплификатор
RNAfold webserverUniversity ofn.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Удобрение
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 смGrodann.a.Rockwoolblock
Greenhousen.a.n.a.Длявыращивания растений
ФитотронIlka Zelln.a.Длявыращивания растений
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Шприц
Мурашиге и соли СкугаDuchefaM 0222.0010Медиа компонент
ГлюкозаCarl Roth GmbH6780.2Медиа компонент
АцетосирингонSigma-AldrichD134406-5GАналог
фитогормона  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Фотометр
Osram холодный белый 36 ВтOsram4930440Источник света
ДинатрийфосфатCarl Roth GmbH4984.3Медиакомпонент
Центрифуга 5415DEppendorf5424 000.410Центрифуга
Forma -86C ULT морозильная камераThermoFisher88400Морозильная камера
Synergy HTBioTekSIAFRTСчитыватель флуоресцентных планшетов
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRустройство
Protein ALife Technologies10-1006Антителосвязывающий белок
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Медиакомпонент
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Медиакомпонент
2G12 антителоPolymunAB002Референсное антитело
Vienna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles