Методическая статья

Мониторинг Ассамблею секретируемым бактериального вирулентности фактор Использование сайт-специфической сшивания

DOI:

10.3791/51217

⸱

17 декабря 2013 г.

 ,  , 
1Genetics and Biochemistry Branch of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья иллюстрирует использование радиомечения с погоней за пульсом в сочетании с сайт-специфичным фотокросслинкингом для мониторинга взаимодействий между интересующим белком и другими факторами у E. coli. В отличие от традиционных химических методов сшивания, этот подход позволяет получать «снимки» с высоким разрешением упорядоченного пути сборки в живой клетке.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод обнаружения и анализа динамических взаимодействий между интересующим белком и другими факторами in vivo. Наш метод основан на технологии подавления янтаря, которая была первоначально разработана Петером Шульцем и егоколлегами 1. Мутация янтаря сначала вводится в определенный кодон гена, кодирующего интересующий белок. Затем янтарный мутант экспрессируется в E. coli вместе с генами, кодирующими янтарную супрессорную тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазу, полученную из Methanococcus jannaschii. С помощью этой системы фотоактивируемый аналог аминокислоты-бензоилфенилаланин (Bpa) встраивается в янтарный кодон. Затем клетки облучают ультрафиолетовым светом, чтобы ковалентно связать остаток BpA с белками, расположенными в пределах 3-8 Å. Фотосшивание выполняется в сочетании с импульсным мечением и иммунопреципитацией интересующего белка с целью мониторинга изменений в белок-белковых взаимодействиях, происходящих в масштабе от нескольких секунд до минут. Мы оптимизировали процедуру для изучения сборки бактериального фактора вирулентности, который состоит из двух независимых доменов: домена, интегрированного во внешнюю мембрану, и домена, который транслоцируется во внеклеточное пространство, но этот метод может быть использован для изучения множества различных процессов сборки и биологических путей как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. В принципе, взаимодействующие факторы и даже специфические остатки взаимодействующих факторов, которые связываются с интересующим белком, могут быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Часто важно идентифицировать и охарактеризовать взаимодействия между интересующим белком и другими клеточными компонентами, чтобы определить его роль в биологическом пути, понять его сборку или выяснить механизм его действия. Для изучения белок-белковых взаимодействий обычно используется широкий спектр подходов, но все они имеют свои ограничения. Самым простым несмещенным методом идентификации белков, которые связываются с интересующим белком, является коочистка (или коиммунопреципитация), но этот подход требует, чтобы белковый комплекс оставался нетронутым во время процедуры очистки. Слабые или преходящие белковые взаимодействия могут быть стабилизированы с помощью химического сшивания, но этот метод обычно требует использования соединений, которые связывают белки через первичные амины, широко разбросанные в белковой последовательности. Могут быть получены сложные схемы сшивания, которые трудно интерпретировать, особенно когда представляющие интерес белки являются компонентами мультибелковых комплексов. Кроме того, поскольку плечи спейсеров химических сшивающих агентов обычно превышают 10 Å в длину, ковалентные связи могут образовываться с белками, которые расположены в непосредственной близости от представляющего интерес белка, но не взаимодействуют с ним напрямую. Такие методы, как аффинная хроматография и двухгибридный скрининг, также часто полезны для выявления белок-белковых взаимодействий. Первый подход, однако, требует воспроизведения условий, которые способствуют физиологически значимым взаимодействиям и не могут быть использованы для обнаружения слабых взаимодействий. Последний подход требует, чтобы связывающие взаимодействия могли воспроизводиться в организме хозяина и поддерживались, когда представляющий интерес белок и его партнеры по связыванию помещаются в контекст гибридного белка. Двухгибридные методы также имеют тенденцию давать ложноположительные результаты2. После того, как белок-белковое взаимодействие установлено, часто требуется значительная работа для картирования места взаимодействия. Возможно, самым существенным недостатком традиционных подходов является то, что они не дают никакой информации о временной последовательности межмолекулярных взаимодействий или кинетике связывания.

В этой статье описывается простой метод, который преодолевает некоторые ограничения других подходов, используемых для изучения белок-белковых взаимодействий. Первоначально в ген, кодирующий интересующий белок, вводится одна мутация янтаря. Затем янтарный мутант коэкспрессируется с янтарным супрессором тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазой, полученной из Methanococcus jannaschii, которые были сконструированы для включения фотоактивируемого аминокислотного аналога-бензоилфенилаланина (АДП) только в янтарных кодонах3. Облучение клеток длинноволновым ультрафиолетовым (УФ) светом (~365 нм) способствует образованию ковалентной связи между Bpa и белками, находящимися в пределах ~3-8 Å4,5. В некоторых экспериментальных контекстах также могут образовываться поперечные связи между активированным Bpa и небелковыми компонентами клеток, такими как липиды и нуклеиновые кислоты6. Молекулы, которые заканчиваются на янтарном кодоне, как правило, должны быть легко отличимы от полноразмерного белка на SDS-PAGE и не могут быть сшиты с другими белками. Подвергая клетки импульсному радиоактивному мечению перед сшивкой, а затем иммунопреципитации или сшиванию продуктов аффинного очищения, можно установить последовательность и продолжительность белок-белковых взаимодействий. Способность генерировать временную информацию о межмолекулярных взаимодействиях особенно ценна для изучения прогрессирования интересующего белка через любой упорядоченный многоступенчатый путь сборки, транспортировки или передачи сигналов, а также для идентификации промежуточных путей. Как и химическое сшивание, сайт-специфическое сшивание обнаруживает белок-белковые взаимодействия, которые происходят в физиологических условиях, но введение сшивающего агента в одном месте облегчает анализ взаимодействий между отдельными сегментами белка и другими факторами. Эта уникальная особенность сайт-специфичного кросслинкинга особенно выгодна, когда интересующий белок имеет несколько сегментов или доменов, которые потенциально могут взаимодействовать с различными партнерами по связыванию. Кроме того, сайт-специфическое сшивание может быть использовано в сочетании с такими методами, как масс-спектрометрия, для точного картирования остатков, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия. Несмотря на то, что этот метод оптимизирован для использования в E. coli, сообщалось о включении в белки фотоактивируемых аналогов аминокислот путем подавления янтаря в клетках микобактерий, дрожжей и млекопитающих7-11. Таким образом, в принципе наш метод может быть использован и в других системах.

Мы широко использовали этот метод для идентификации межмолекулярных взаимодействий, которые способствуют биогенезу EspP, фактора вирулентности E. coli O157:H7. EspP является членом суперсемейства белков, известных как «автотранспортеры», которые содержат большой N-концевой внеклеточный домен («пассажирский домен») и aC-концевой домен («b-домен»), который сворачивается в цилиндрическую структуру b-цилиндра и прикрепляет белок к внешней мембране (ОМ)12. Механизм, с помощью которого пассажирское пространство перемещается по ОМ, долгое время оставался загадкой. Как и все белки поверхности бактериальных клеток, EspP должен транспортироваться через внутреннюю мембрану, перемещаться через периплазму (пространство между внутренней и внешней мембранами) и направляться к ОМ в серии упорядоченных событий. После транслокации через ОМ пассажирский домен EspP также отделяется от b-домена протеолитическим расщеплением и освобождается от поверхности клетки. Комбинируя сайт-специфическое сшивание с пульсовым радиомечением, мы показали, что оба домена белка первоначально взаимодействуют с молекулярным шапероном Skp в периплазме6. Впоследствии дискретные сегменты b-домена стереоспецифическим образом взаимодействуют с компонентами гетероолигомера, называемого комплексом Bam, который катализирует интеграцию b-бочек в бактериальный OM по неизвестному механизму. Возможно, наиболее интересным является то, что мы обнаружили, что пассажирская область находится в контакте с одной из сложных субъединиц Bam (BamA), когда она пересекает OM13. Наши результаты позволили нам построить детальную модель сборки автотранспортера14 и вовлечь комплекс Бама в транспортировку пассажиров через ОМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструкция плазмид

  1. После клонирования гена, кодирующего представляющий интерес белок, в соответствующий вектор экспрессии, введите янтарные мутации в желаемых местах с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза.
    Примечание: Структурная информация и прогнозы поверхностного воздействия могут служить полезными ориентирами для определения положения мутаций. Поскольку эффективность подавления янтаря и сшивания может значительно варьироваться, мутации янтаря должны вводиться в нескольких позициях. Кроме того, поскольку Bpa является аналогом тирозина и фенилаланина, попытайтесь ввести мутации янтаря в позиции, которые обычно кодируют большие гидрофобные аминокислоты, чтобы свести к минимуму нарушения структуры и функции белка. Наконец, при выборе вектора экспрессии следует иметь в виду, что избыточная продукция белка, представляющего интерес, на очень высоком уровне может ограничить эффективность включения Bpa.

2. Подготовка культуры

  1. Используйте электропорацию для преобразования подходящего штамма E. coli с плазмидой, которая кодирует систему подавления янтаря (pDULE-p Bpa; см. рефренцию4), и совместимой плазмидой, которая кодирует интересующий белок с мутацией янтаря.
  2. Пластинчатые клетки на ЛБ-агаре, содержащие соответствующие антибиотики (используйте 5 мкг/мл тетрациклина для выбора pDULE-p АБА). Инкубируйте планшеты O/N при 37 °C.
  3. На следующий день начать бактериологическое исследование О/Н из отдельных колоний в 3-5 мл М9 среды14, содержащей 0,2% глицерина, все L-аминокислоты, кроме метионина и цистеина (40 г/мл) и антибиотики. Инкубировать при 37 °C.
  4. На следующий день центрифугируют культуры O/N при 2500 x g в течение 5 мин при RT в грануляционные клетки. Повторно суспендируйте клетки в 5 мл свежей среды M9 и повторите центрифугирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап промывки имеет решающее значение для поддержания плазмид, которые кодируют резистентность к ампициллину, потому что небольшие количества b-лактамазы, присутствующие в среде из культур O/N, разрушают только что добавленный ампициллин до того, как произойдет значительный рост клеток.
  5. Ресуспендируйте клетки в 2 мл свежей среды и измерьте концентрацию клеток на спектрофотометре (OD550).
  6. Добавьте клетки в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 50 мл среды М9 и антибиотики наружным диаметром550=0,03. Инкубируйте культуры при температуре 37 °C на водяной бане.

3. Инкорпорация и подготовка к фотосшивке

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный ниже, предназначен для примерного временного курса, который имеет три временные точки (0, 1 и 5 минут). Отрегулируйте громкость соответствующим образом, если требуется другое количество временных точек. Схема процедуры проиллюстрирована на рисунке 1.

  1. Пока культуры растут, приготовьте свежий 1 М (1000x) раствор Bpa в 1 М NaOH (27 мг Bpa в 100 мкл 1 М NaOH). Используйте трубку с темными стенками, чтобы раствор оставался в темноте.
  2. Когда культуры достигнут ранней и средней фазы логарифма (OD550 = 0,2), добавьте 50 мкл 1 М ПА в каждую культуру. Добавляйте Bpa по одной капле за раз, поворачивая колбу, чтобы избежать осадков. Затем добавьте все индукторы, которые необходимы для стимуляции экспрессии янтарного мутанта. Продолжайте инкубировать культуры при температуре 37 °C еще 30 минут.
  3. В течение 30-минутного индукционного периода наклейте этикетку на шесть одноразовых центрифужных пробирок объемом 15 мл с указанием времени (0 мин, 1 мин, 5 мин) и либо "+ UV", либо "- UV". Поместите трубки на лед.
  4. Наполните второе ведро со льдом льдом и положите на него планшет для культуры тканей на 6 лунок.
  5. Разморозьте с высокой удельной активностью (1000 мКи/ммоль) 35S-метионина и 35S-цистеина (или готовую смесь двух соединений) для импульсного мечения и приготовьте (или разморозьте) раствор нерадиоактивных L-цистеина и L-метионина (по 100 мМ каждый) для погони
    6. .
  6. Включите УФ-лампу за пять минут до начала радиоактивного мечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лампа должна быть отрегулирована таким образом, чтобы ее можно было расположить на расстоянии ~3-4 см от образцов в многолуночной пластине.
  7. Добавьте лед (~2 мл) в каждую пробирку с маркировкой "-UV" и в две лунки в многолуночном планшете><. ПРИМЕЧАНИЕ: Лед следует добавить в третью лунку непосредственно перед 5-минутным отсрочкой. Очень важно помещать лед непосредственно в трубки и лунки, чтобы немедленно останавливать внутриклеточные реакции в каждой временной точке и тем самым получать точные «снимки» конкретного биохимического пути.
  8. По истечении 30-минутного индукционного периода переложите 25 мл культуры в предварительно подогретую одноразовую колбу Эрленмейера объемом 125 мл. Поместите колбу на водяную баню с температурой 37 °C.

4. Импульсная маркировка и УФ-излучение

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол маркировки с погоней за пульсом и УФ-облучения состоит из множества шагов, которые должны быть выполнены своевременно и которые требуют значительной организации и предварительной подготовки. Все реагенты и пробирки должны быть легко доступны. Ниже представлен протокол эксперимента с временными точками 0, 1 и 5 минут.

  1. В момент 0:00 (мин:сек) перелейте 25 мл культуры в колбу объемом 125 мл.
  2. В момент 0:30 добавьте 30 μCi/мл радиоактивных аминокислот; быстро перемешайте. Поместите колбу на водяную баню с температурой 37 °C.
  3. Через 1:00 добавьте 250 мкл 100 мМ раствора метионина-цистеина; быстро перемешайте.
    1. Немедленно внесите пипеткой 4 мл культуры в одну из лунок охлажденного многолуночного планшета, который содержит лед. Нанесите пипеткой вторую аликвоту 4 мл в пробирку объемом 15 мл с надписью "0 min - UV". Верните колбу на водяную баню.
  4. В момент 2:00 пипеткой внесите 4 мл культуры во вторую лунку охлажденного многолуночного планшета, который содержит лед. Внесите пипеткой еще 4 мл аликвоты в пробирку объемом 15 мл с надписью "1 min - UV". Верните колбу на водяную баню.
  5. Во время 6:00 пипеткой внесите 4 мл культуры в третью лунку охлажденного многолуночного планшета, который содержит лед. Пипеткой введите еще 4 мл аликвоты в пробирку объемом 15 мл с надписью "5 min - UV".
  6. Поместите ведро со льдом с многолуночной пластиной под предварительно нагретую ультрафиолетовую лампу и облучайте каждый образец по отдельности в течение 4 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах, в которых временные точки находятся на расстоянии не менее 4 минут друг от друга, каждый образец должен быть облучен сразу после его пипетирования в многолуночный планшет.
  7. Переложите клетки в охлажденные пробирки объемом 15 мл с маркировкой «0 мин +УФ», 1 мин +УФ» и т. д.
  8. Центрифугируйте ячейки при давлении 2 500 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  9. Повторно суспендируйте каждый образец в среде M9 объемом 300 мкл или PBS и добавьте 33 мкл 100% холодной трихлоруксусной кислоты (ТСА) для осаждения белков. Центрифугируйте ТСА в осадок в микрофуге на максимальной скорости в течение 10 мин и удалите надосадочную жидкость. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 °C.

5. Иммунопреципитация и обнаружение сшивающих продуктов

  1. Добавить в каждый образец 50 мкл солюбилизационного буфера (15% глицерина, 200 мМ трисбаза, 15 мМ ЭДТА, 4% SDS, 2 мМ PMSF) и нагревать с перемешиванием при 95 °С в течение 5 мин для растворения осажденного белка.
  2. Добавьте 1 мл буфера для радиоиммунопреципитации (RIPA) (50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS) и проведите стандартную иммунопреципитацию15 с использованием от одной пятой до половины каждого образца><. ПРИМЕЧАНИЕ: Igepal CA-630 (октилфенил-полиэтиленгликоль) используется вместо NP-40, который больше не доступен на рынке. Эти два соединения химически неразличимы.
  3. Разрешите иммунопреципитированные белки с помощью SDS-PAGE. Окрашивайте, удаляйте пятна и сухие гели.
  4. Подвергайте гели воздействию O/N люминофорного экрана и обнаруживайте радиоактивные белки (включая продукты сшивки) с помощью фосфоримиджера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали сайт-специфичные фотокросслинкинги для идентификации белков, которые взаимодействуют с EspP во время его путешествия в ОМ. В экспериментах, которые здесь показаны, кодоны фенилаланина в остатках 1113 и 1214 были заменены янтарными кодонами. Обе позиции расположены в домене, который интегрируется в ОМ и служит мембранным якорем. Кристаллическая структура доменаEspPβ 16 показывает, что два остатка находятся на периплазматической стороне бочки b, но разделены на ~120° (см. структу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается метод, сочетающий сайт-специфичную фотосшивку с импульсной маркировкой для изучения динамики взаимодействий между интересующим белком и другими компонентами живой клетки. Метод особенно полезен для изучения многоступенчатых процессов, в которых белок последовательно взаимодействует с другими факторами. В отличие от традиционных подходов к химическому сшиванию, сайт-специфичный фотокросслинг предоставляет подробную информацию о состоянии отдельных сегментов или даже отдельных остатков белка, пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национального института диабета, болезней пищеварительной системы и почек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
QuikChange II Site-Directed Mutagenesis KitAgilent200521
BPA (H-p-bz-Phe-OH)BachemF-2800
TRAN35S-LABEL, реагент метаболического мечения (35S-L-метионин и 35S-L-цистеин, >1,000 Ки/ммоль)MP Biomedicals51006
Spectroline SB-100P УФ-лампа сверхвысокой интенсивности, 365 нмSpectronics CorporationSB-110P
Спектролиновая лампа для замены 100SSpectronics Corporation11-992-15
Falcon Tissue Culture Plate, 6-луночнаялабораторная посуда Becton Dickinson353046
одноразовая колба Эрленмейера 125 млCorning430421
Innova 3100 встряхивающая водяная баняНовый Brunswick Scientificn.a.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  2. von Mering, C., et al. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417, 399-403 (2002).
  3. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. PNAS. 99, 11020-11024 (2002).
  4. Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).
  5. Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning. Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).
  6. Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain. PNAS. 108, 383-391 (2011).
  7. Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 5, (2010).
  8. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae. J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).
  9. Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris. Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).
  10. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).
  11. Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells. Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).
  12. Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).
  13. Ieva, R., Bernstein, H. D. Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane. PNAS. 106, 19120-19125 (2009).
  14. Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion. PNAS. 110, (2013).
  15. Harlow, D., Lane, D. Using antibodies: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
  16. Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes. Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).
  17. Akiyama, Y., Ito, K. SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи