Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

27 января 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

В этой статье

Краткое содержание

Стойкая активация тормозных G-белком рецепторов приводит к сенсибилизации сигнализации циклазной аденилил. Чтобы определить основные молекулярные пути, nonbiased подходы необходимы, однако, эта стратегия требует разработки масштабируемого на основе клеток цАМФ сенсибилизации анализа. Здесь мы описываем сенсибилизации анализа для малых молекул и миРНК скрининга.

Аннотация

Повышение чувствительности аденилатциклазы (AC) сигнализации был вовлечен в различных нервно-психических и неврологических расстройств, включая токсикомании и болезни Паркинсона. Острая активация Gαi / вывода связаны рецепторов ингибирует активность АЦ, в то время упорной активации этих рецепторов приводит к гетерологического сенсибилизации переменного тока и повышению уровня внутриклеточного цАМФ. Предыдущие исследования показали, что это усиление переменного отзывчивость наблюдается как в лабораторных, а в естественных условиях после хронической активации нескольких типов Gαi / О-связанных рецепторов в том числе D 2 допамина и μ опиоидных рецепторов. Хотя гетерологичная сенсибилизация AC впервые сообщалось четыре десятилетия назад, механизм (ы), которые лежат в основе этого явления остаются в значительной степени неизвестными. Отсутствие механических данных предположительно отражает сложность, связанную с этим адаптивного ответа, предполагая, что nonbiased подходы могут помочь в идентификацииING молекулярные пути, участвующие в гетерологического сенсибилизации AC. Предыдущие исследования выявили участие киназы и сигнализации Gbγ как перекрывающиеся компоненты, которые регулируют гетерологичную сенсибилизации AC. Чтобы определить уникальные и дополнительные перекрывающиеся цели, связанные с сенсибилизации AC, разработка и утверждение масштабируемого цАМФ сенсибилизации анализа требуется для большей пропускной способности. Предыдущие подходы к изучению раздражение, как правило, громоздки участием постоянного обслуживания культуре клеток а также сложную методику измерений накопления цАМФ, использующая несколько шага промывания. Таким образом, разработка надежной клеточном анализе, который может использоваться для высокопроизводительного скрининга (HTS) в луночном формате 384 будет способствовать будущих исследований. Использование двух сотовых модели D 2 дофаминовых рецепторов (то есть. СНО-D 2L и HEK-АС6 / D 2L), мы перешли нашу 48-а анализ сенсибилизации (> 20 шагов 4-5 дней) до пяти-хТЭП, один день анализ в формате 384-а. Этот новый формат поддается скрининга малой молекулы, и мы показываем, что эта конструкция анализ может также быть легко использован для обратной трансфекции миРНК в ожидании целевого скрининга библиотеки миРНК.

Введение

Адаптивный аденилатциклаза (АС) сигнализации ответ известный как гетерологического-или супер-сенсибилизации был впервые обнаружен в лаборатории нобелевского лауреата, доктор Маршалл Ниренберг. Доктор Ниренберг предложил, что наблюдаемая активная реакция AC после хронического δ активации опиоидных рецепторов был механизм участвует в толерантности к опиатам и зависимости 1. В дополнение к хронической δ активации опиоидных рецепторов, это neuroadaptive реакция сигнализации переменного тока также происходит следующее упорной активации нескольких других Gαi / о-в сочетании рецепторов 2. Примечательно, что многие из этих рецепторов связаны с болью, психоневрологических и неврологических расстройств, и включают в себя μ / κ опиоидов, D 2/4 допамин, 5НТ 1А и М 2/4 мускариновых рецепторов 2. В дополнение к результатам доктора Ниренберга, большое количество доказательств, существует связь сенсибилизации сигнализации переменного тока к хронической опиоидной активации рецептора как в пробирке и в естественных 3-7. Сенсибилизация AC также было связано с различными заболеваниями с участием D 2-подобных рецепторов допамина в том числе шизофрении и болезни Паркинсона (для обзора см. ссылку 2). Несмотря на потенциальную важность сенсибилизации, точный механизм (ы), связанные с постоянной Gαi / активации рецептора о-в сочетании, что приводит к увеличению тока отзывчивость остается неизвестной.

Эти исследования дают обоснование для изучения механизмов сенсибилизации аденилатциклазы в качестве важного нейробиологической цели. Аналогичным образом, физиологическое значение переменного тока сигнализации 8 и важность, что отдельные изоформы AC удерживайте эту адаптивного ответа также следует признать 2,9,10. В контексте нашего исследования, общие особенности, связанные с гетерологического сенсибилизации рекомбинантных изоформ AC параллельно те характеристики деприписана для изучения эндогенных изоформ AC. В частности, предыдущие исследования обнаружили, что активация Gαi / O белков и последующий выброс / перегруппировки βγ субъединиц Важным требованием к рецептора индуцированной сенсибилизации всех изоформ переменного тока. Кроме того, несколько исследований показывают, что сигнализацию от протеинкиназ и Gβγ подразделений участвуют в сенсибилизации 2,11-13. Индивидуальные кондиционеры также представлены уникальные и разные паттерны сенсибилизации 12. Например, постоянные экспозиции D 2-рецепторов в агонистов связано с сенсибилизации AC1 и AC8 к Ca 2 + / кальмодулин стимуляции 14,15, в то время как тесно связаны AC3 не осведомлены 2. AC2, AC4, и AC7 тесно связаны, однако, только PKC-стимулированной активности AC2 надежно сенсибилизированные после длительного воздействия D 2 рецепторов агонистами 7,14,16,17. Кроме того, АС5 и АС6 показывают заметное степень гетерогенныхologous сенсибилизация к газо-и форсколином стимулировали накопления цАМФ следующее активации D 2-рецепторов 14,18-20, но, кажется, отличаются по своей потребности в Gβγ субъединицы-AC взаимодействиях 21. Хотя большинство исследований AC сенсибилизации использовали клеточные линии модели (например, клетки HEK293, выражающие отдельные изоформы AC), кажется, что эти данные перевести в родные нейронных моделей сотовых 4,22. Совсем недавно, эффекты AC изоформ селективных низкомолекулярные ингибиторы определенных в НЕК293, выражающих переменного тока изоформы также могут быть переведены на в естественных условиях поведенческих исследований 23.

Отсутствие идентифицированного молекулярного механизма для гетерологического сенсибилизации, вероятно, отражает сложность адаптивного ответа, а также уникальные нормативные свойства личности AC изоформ 12. Раскрытие такой сложности осложняется использованием громоздкой методологии тшляпа ограничил академических исследователей от использования беспристрастные подходы. Например, наши предыдущие механистические исследования включали использование постоянно культивируемых клеточных моделях с использованием 24 - и формат тканевой культуры 48-а 15. Культивируемые клетки были выращены, как правило, в течение 48 ч и затем подвергали агониста лекарственной терапии (2-18 ч), за которым следует ряд клеточных моет и инкубации (рис. 1). AC-изоформы конкретных цАМФ протоколы накопления были тогда заняты последующим измерением накопления цАМФ с использованием длительными и трудоемкими [3 H] цАМФ связывания методологии 15,24. Продолжительность от начала до конца для каждого анализа обычно требуется в общей сложности четыре-пять дней из клеток обшивки для анализа данных (рис. 1). Применение новых технологий и автоматизации привело к отмеченными усовершенствований для повышения чувствительности исследований в промышленной и HTS центральной обстановке. Например, группа сотрудничает с Национальным Центром Chemiкал геномики сообщил двухдневный HTS процедуры анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы μ-опиоидными рецепторами индуцированной сенсибилизации в формате 1536-а 25.

В данной статье описываются наши усилия по созданию ВТСП анализ для исследования гетерологического сенсибилизации с использованием технологий, которые доступны в большинстве академических научно-исследовательских институтов. Эта стратегия была достигнута путем включения использование криоконсервированных клеток из клеточных моделях гетерологично выражая допамина D 2 в сочетании с эндогенными или отдельных рекомбинантных изоформы аденилатциклазы (СНО-D 2L или НЕК-АС6 / D 2 L). Чтобы улучшить нашу пропускную мы переработан наш сенсибилизации анализа 48 а (ок.> 20 шагов за 4-5 дней), чтобы пятиступенчатой, один день пробирного в 384-а формате, который был по существу "смешивать и читать". Новый формат использует имеющийся в продаже однородной времени решен флуоресценции (HTRF) анализа для измерения цАМФ в соотвumulation в интактных клетках с считывающее режим пластины. Анализ является надежной и поддаются скрининга малой молекулы, и может эффективно применяться для скрининга ингибиторов гетерологичного сенсибилизации. Кроме того, мы предоставляем данные, что позволяет использование данного анализа с обратной трансфекции миРНК для целевого или Геном широкого скрининга библиотеки миРНК только с небольшим изменением к общему подходу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Расширение и Криоконсервация Анализ готовые клетки

  1. Культура СНО-К1-РРП 2L (СНО-D 2L) клетки по мобильному блюдо 15 см 2 культуры в F12 СМИ Хэма, дополненной 1,0 мкм L-глутамина, 800 мкг / мкл G418, 300 мкг / мкл гигромицин 100 ед / мкл пенициллина, 100 мкг / мкл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2, пока клетки не являются 90-95% сливной. Промывают клетки с 10 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), и сбора клеток путем добавления 3 мкл буфера для диссоциации клеток в течение 5 мин при 37 ° С Ресуспендируют клеток с использованием 12 мкл в культуральной среде и подсчета клеток с использованием трипанового синего.
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирации супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мкл замораживания средств массовой информации (10% диметилсульфоксид, 90% FБС). Развести клеточной суспензии, чтобы достичь желаемой концентрации клеток (например, 1-20 × 10 6 клеток / мкл).
  4. Алиготе 1,0 мкл клеточной решения каждой криопробирку. Инкубируйте криопробирки в морозильной контейнера клеток при температуре -80 ° С в течение ночи. Перенесите криопробирки до жидкого N 2 бака для длительного хранения.

2. Покрытие Assay готовые клетки (и обратного трансфекции вариант)

  1. Быстро разморозить замороженный криопробирку клеток в водяной бане при 37 °. Как только клетки размораживают, перенести клетки в 15 мкл коническую трубку с 9 мкл Opti-MEM, и взболтайте ее трубки 3-5x.
  2. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мкл Opti-MEM.
  3. Граф клеток с использованием трипанового синего, чтобы определить жизнеспособность клеток и разбавить жизнеспособных клеток по мере необходимости (например,. 3 х 10 5 клеток / мкл концентрация) вOpti-MEM. Пластина 10 мкл / лунку клеток в культуре ткани обрабатывают 384-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки.
  4. Сделать серийные разведения цАМФ в Opti-MEM для получения стандартной кривой для оценки производства цАМФ клетками (согласно производит рекомендации - см. раздел 7). Добавить 10 мкл / лунку стандартов цАМФ к пластине. Примечание: единый стандарт кривая может быть подготовлен на отдельной тарелке или пустых скважин на одном из аналитических планшетов.
  5. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 1 часа.

3. Реверс миРНК трансфекции вариант *

Этот раздел является необязательным и отношение к Рисунок 3.

  1. Приготовьте раствор миРНК в РНКазы DDH 2 O (например, 0,4 пмоль / мкл). Добавьте 5 мкл в отдельные лунки 384-луночный планшет, центрифуге и пластину при 100 х г в течение 15 SEC при комнатной температуре.
  2. Развести Lipofectamine 2000 в Opti-MEM с коэффициентом 0,006 (например добавить 6 мкл Lipofectamine 2000 до 1000 мкл Opti-MEM), и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Инкубируйте решение Липофектамин 2000/Opti-MEM течение 5 мин при комнатной температуре. Добавьте 5 мкл разбавленного раствора Липофектамин 2000/Opti-MEM индивидуальных скважин 384-луночный планшет, который уже содержит миРНК. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Планшете готовые клетки, как описано выше (раздел 2). Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре.
  6. Вернуться анализа пластину увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C (5% CO 2) в течение 48-96 часов, как это определено для целевого гена сбить (см. обсуждение).

4. Маленькая молекула Скрининг

  1. Развести препарат интереса (ингибиторы например. Небольшие молекулы) в Opti-MEM до 6x желаемых конечных концентраций. Серийные разведения может быть завершена с помощью ручного пипетки или жидкий обработки станцию.
  2. Добавить 2,5 мкл / лунку тестируемого соединения или буфера, содержащего транспортное средство (например, в ДМСО) в сторону скважин с использованием многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластину при 100 мкг в течение 15 сек при комнатной температуре (инкубационный является обязательным).

5. Стойкая Agonist Лечение

  1. Приготовьте 600 нм (т.е.. 6 раз желаемой конечной концентрации 100 нМ) раствору quinpirole в Opti-MEM.
  2. Добавить 2,5 мкл / лунку в 600 нм quinpirole решение в сторону лунки с помощью многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 2 часов.

6. Стимуляция цАМФ накопления

  1. Во время 2 ч инкубации подготовить stimulatiна решения в Opti-MEM. Решение стимуляция состоит из 40 мкМ форсколина, 2 мкМ 3-изобутил-1-methyxanthine (IBMX) и 4 мкМ спиперон (все концентрации на этапе 6, 4x желаемой конечной концентрации).
  2. Добавьте 5 мкл / лунку стимуляции решение в сторону лунки с помощью многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

7. Закалка и оценка цАМФ накопления

  1. Производство цАМФ клетками измеряется с помощью динамического 2 комплекта цАМФ в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, восстановить против цАМФ-криптат и цАМФ-D2 в дистиллированной воде. Замораживание аликвоты при -20 ° С на короткий срок хранения.
  2. Развести одну аликвоту анти-цАМФ-криптата и одну аликвоту цАМФ-D2 отдельно в буфере для лизиса в соответствии с инструкциями производителя, чтобы сделать работу решений.
  3. дд 10 мкл / лунку рабочего раствора анти-цАМФ-криптат и 10 мкл / лунку из цАМФ-d2 рабочего раствора на 384-луночный планшет, используя многоканальную пипетку.
  4. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
  5. Читайте пластины в флуоресценции ридере (настройка автоматического масштабирования на чувствительность), используя возбуждение 337 нм, и измерять выбросы при 620 нм и 665 нм в инструкции производителя.
  6. Применить логометрические анализ для оценки цАМФ стандартная кривая за инструкции производителя. Используя полученные значения, экстраполировать стоимости накопление цАМФ в тестовых скважин с использованием программного обеспечения для анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Часть I. Разработка 384 хорошо гетерологичную сенсибилизации анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы с использованием коммерчески доступного модель клетки.

Для изучения гетерологичную сенсибилизации в модели клеток, мы сделали ряд улучшений, которые позволили нам оптимизировать анализа в формат "Mix и читать". Некоторые из ключевых модификаций, изложены ниже и описаны более подробно в обсуждении. Первый ключевой шаг был изменив нашу культуру клеток от по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В целях облегчения исследований гетерологического сенсибилизации, мы значительно изменена наш предыдущий метод достижение обтекаемый "микс и читать" формат, который исправимо для высокопроизводительного скрининга и механизма экспертизы действий. Основными модификации нашего протокола можно резюмировать следующим образом: 1) использование криоконсервированных клеток как «анализа-готов» реагентов, 2) миниатюризации анализа в формате 384-а и 3) использования измерения HTRF из цАМФ.

Пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность г-на Ричарда Zink и Тодд Wiernicki для методологической подготовки и анализа руководством. Мы также благодарим Иоанна Павла Спенс за внимательное чтение и редакционных предложений. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения МЗ 060397, мозг и поведение Research Foundation, и Эли Лилли энд компани рамках Программы Lilly Research Award (LRAP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CHO-K1-DRD2L элементыDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 mediaVWRSH30026fs
Фетальная бычья сывороткаVWRSH3007003
G418SigmaA1720
ГигромицинФишера50-230-5556
Пенициллин/стрептомицинLife Technologies15070063
15 см посудаBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Буфер для диссоциации клетокLife Technologies13150016
Фосфатный буферный физиологический растворLife Technologies10010-049
КриовиалыFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC обработанные 384-луночные планшетыPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-изобутил-1-метилксантинSigmaI5879
(±)КвинпиролSigmaQ111
СпайперонSigmaS7395
КлозапинSigmaC6305
ГалоперидолSigmaH1512
S-(-)СульпиридSigmaS112
Липофектамин 2000 реагент для трансфекцииИнвитроген11668019
Трипан синийLife ТехнологииT10282
Вода, ДНКаза и РНКаза безМП биомедицинских 821739
Ga<суб>с миРНКДхармаконпользовательский миРНК
Нетаргетированный контроль миРНКDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

Ссылки

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

384HTRFD2
Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.