Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51219

⸱

15 июня 2014 г.

 ,  , 
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Этот протокол описан новый механический способ измельчения, что позволяет расширение сферических нервных стволовых и клеток-предшественников агрегатов без диссоциации к суспензии отдельных клеток. Поддержание клеток / клеток контакт позволяет быстро и стабильный рост на протяжении более 40 пассажей.

Аннотация

Методика расширения ячейки, чтобы накопить большое количество клеток из одного образца для научных экспериментов и клинических испытаний значительно обогатило бы стволовых клеток сообщество. Многие методы текущие расширения являются трудоемкими и дорогостоящими, и тех, которые связаны полной диссоциации может вызвать несколько стволовые и клеток-предшественников типы пройти дифференциации или рано старение. Для преодоления этих проблем, мы разработали автоматизированную механическую метод пассажей называют "рубить", что является простым и недорогим. Этот метод позволяет избежать химической или ферментативной диссоциации на отдельные клетки и вместо этого позволяет масштабного расширения взвешенных, сфероидных культур, которые поддерживают постоянный контакт клеток / клеток. Способ измельчения имеет в основном были использованы для мозга плода, полученных нейронных клеток-предшественников или нейросферах, и недавно был опубликован для использования с нервных стволовых клеток, полученных из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Процедура увлеченностиэс посева нейросферы на культуре ткани чашки Петри, а затем передавая резкий, стерильный нож через клетки эффективно автоматизировать утомительный процесс вручную механически диссоциации каждую сферу. Приостановка клеток в культуре создает благоприятную соотношении между площадью поверхности к объему; как более 500000 клетки могут быть выращены в пределах одного нейросфера менее 0,5 мм в диаметре. В одном T175 колбу, более 50 миллионов клетки могут расти в суспензионных культур по сравнению с только 15 миллионов в прикрепленных культур. Важно отметить, что рубить процедура использовалась в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ), что позволяет массовое производство количество продуктов клинико-класса клеток.

Введение

Существует долгая история расширения грызунов нервные стволовые клетки в культуре или как монослоя 1-3 или совокупных нейросферы 4-7. Кроме того, человека нервные клетки-предшественники (hNPCs), выделенные из различных регионов развивающегося центральной нервной системы 8-17 были расширены в пробирке. Эти клетки являются би-мощным, способны дифференцироваться в обоих астроцитов и нейронов и были очень полезный инструмент в изучении развития нервной системы 18,19 и болезни механизм 20,21. hNPCs также пересадить в различных животных моделях заболеваний центральной нервной системы с различными уровнями интеграции, выживание и функциональных эффектов 22-24.

Традиционно, грызун или фетальных НПС человека подвергаются воздействию факторов роста - часто эпидермальный фактор роста (EGF) и / или фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) 25-28 - и как липкое, так и 29 три-Мерные системы сферические, как правило, пассировать с помощью ферментативной диссоциации в одной клеточной суспензии 30-34. Стандартный метод расширить клетки для исследований или клинического применения является как приверженец монослоя из-за легкого манипулирования. Тем не менее, мы показали, что пассажи однослойные и нейросфера hNPCs с ферментативных или химических растворов привело в начале старения 35. Кроме того, ферментативной диссоциации может привести к повышению уровня дифференцировки и кариотипа аномалий на основе данных продемонстрированы с эмбриональными стволовыми клетками 36-38. Хотя стандартный метод пассажей hNPCs выпустил текущий надлежащей производственной практики (цГМФ) класса продуктов, которые прошли в фазе 1 клинических испытаний (стволовые клетки Inc, Neuralstem Инк), метод разрешается только несколько раундов амплификации клетки, ограничивая банковские потенциал.

Очевидно, что крупные научно-исследовательские эксперименты и будущие клинические испытания могут воспользоваться возможностьюраспространяются клеток в натуральном и с задержкой старения, способствующих росту масштабную и сотовый банкинга. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали новый и автоматизированный способ механически пассажей неповрежденных нейросферы по "рубить" их в малых кластеров поддерживать клетки к клетке контакт. Этот метод значительно увеличить их срок службы 39 и суспензионной культуры позволяет более эффективно использовать пространство инкубатора по сравнению с однослойных культур, как видно с альтернативным методом 3D биореактор культуры 40. При условии, протокол измельчения позволяет для производства крупномасштабных банков от одного плода образца больше, чем канал 10, маловероятного подвиг, используя стандартные методы пассажей. Хотя этот метод для пассажи hNPCs является нетрадиционным, она растет в популярности, и был недавно, опубликованные с другими типами клеток, таких как нервные стволовые клетки, полученные из человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что позволяет крупномасштабных расширение для различных приложений, включая возможность в версииИтро моделирование болезнь 41-46. Важно отметить, что цГМФ-класс hNPC банк клеток уже производится с помощью метода разделочную, демонстрируя, что метод может быть применен к будущим клинического применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Этические себе и безопасность

  1. Эта процедура включает в себя использование продуктов клеточных культур, полученных от человека или животных. Все полученные ткани должны быть утверждены до использования соответствующей Institutional Review Board (ы) и / или уходу и использованию животных комитета (ов) Институциональная.
  2. Все био-опасные отходы должны быть утилизированы в соответствии с правилами техники безопасности принято на соответствующего учреждения. Знать и следовать всем уместным правил техники безопасности и утилизации всей этой процедуры.

2. Подготовка оборудования, материалов, реагентов и наблюдения

  1. Подготовка
    1. Получить стеклянную чашку Петри, 8,5 см фильтровальной бумаги круги и дважды края подготовительные лезвия.
    2. Поместите кусочек фильтровальной бумаги в чашку Петри и передавать несколько обнаженные лезвия на фильтровальную бумагу в чашке Петри.
    3. Неоднократно слой фильтровальной бумаги и лезвия до чашки Петри примерно на 75%, крышка остроумиеч Петри крышка и автоклав. Храните в стерильной или замкнутом пространстве, чтобы сохранить стерильность.
    4. Автоклав 18 см щипцы и автоклавируемый орех водитель в сумке стерилизации. Для цГМФ производства, автоклав несколько из нержавеющей стали регулировочные диски в мешочки стерилизации. Для получения дополнительной информации относительно прокладки диска, см. шаг 3.5.
    5. Санировать биологической безопасности кабинета (BSC) с 70% изопропилового спирта (IPA).
    6. Все процедуры должны быть выполнены в BSC для поддержания стерильности. Консерванта передать следующее в BSC:
      1. McIlwain ткани Чоппер (измельчитель). Протрите все поверхности с 70% IPA, особенно измельчителя руки (рис. 1В). Весь прерыватель могут быть дезактивированы с использованием этиленоксида, если это необходимо.
      2. Один автоклавного орех водитель или гайка-ключ (входит в вертолете, рис 1I), один 18 см щипцы, один набор стандартных micropipettors размера (20 мкл-1, 000 мкл), один pipetaid и трубчатые стойки.
      3. Стерильные одноразовые серологические пипетки, советы барьер пипеткой, 15 мл конические пробирки, 60 мм чашки Петри, дважды края подготовительные ножи и соответствующим размером T колбы. ВНИМАНИЕ: Только обрабатывать острые лезвия с пинцетом.
  2. Реагенты
    1. Развернуть hNPCs на техобслуживание СМИ (ММ), состоящие из нейронных стволовых клеток расширения Средний, EGF при 100 нг / мл и фактор ингибирования лейкоза (LIF) в концентрации 10 нг / мл. Перенесите реагентов и фильтрации устройство (а), необходимые для подготовки носителя в BSC.
    2. Повторное приостановить лиофилизированный EGF с помощью нейронной стволовых клеток расширения Средний и подготовить аликвоты при 100 мкг / мл для хранения при температуре -80 ° С в течение до 1 года. LIF хранится как приобрести при 4 ° С в течение до 6 месяцев или истечения срока годности, указанного изготовителем.
    3. Трансфер MM реагенты в BSC. Смешайте все реагенты в соответствующего размера устройства фильтрации и фильтра с помощью вакуумного аппарата. Хранить при температуре 4 ° С в течение до 3 недель.
    4. hNPC Наблюдения
      1. Два наиболее важных факторов, чтобы адрес перед измельчения является сфера диаметром и кондиционирования СМИ или цвет. Условный СМИ (СМ) определяется как носитель, который был усвоен hNPCs в культуре в условиях инкубатора (37 ° C, 5% СО 2, 95% влажности). Как клетки усваивать СМИ красный компонент фенола будет перейти от розового до желтого цвета означающее более кислую среду (рис. 5D).
      2. Держите колбу (ы) hNPCs на свет, чтобы выступать в СМИ цвет (см. обсуждение для деталей).
      3. Сканирование через колбу с помощью микроскопа наблюдать клетки. Используйте сетку для изучения сферы размер. Если многие сферы имеют диаметр 300 мкм или более, продолжить процесс прерывания. Чоп клетки каждые 7-10 дней.
      4. Если отбивная не является оправданным, обмен 25-75% СМ с свежие среды каждые 3-4 дня в зависимости от того, как быстро клетки метаболизм СМИ. Противдолжают смены носителя до сферы не являются достаточно большими, чтобы проход.
      5. hNPCs, как правило, нарезанного в соотношении 1:02, от меньших к большим колб Эрленмейера. Используйте таблицу 1 в качестве справочного руководства для размера колбу и объем рекомендаций.
    Колба Объем всех средств массовой информации Предварительно Чоп → Сообщение-Чоп
    1 T12.5 5 мл 1 T12.5 → 1 T25
    1 T25 10 мл 1 T25 → 1 T75
    1 T75 20 мл 1 T75 → 1 T175
    1 T175 40 мл 1 T175 → 2 T175s
    2 T175s 80 мл 2 T175s * → 4 T175s
    * 2 T175s максимальное количество колб, которые могут быть нарезанных одновременно. Чоп в подходах по 2 T175s и обратитесь к пункту 7.

    Таблица 1. Расширение парадигмы hNPC. Описание типичной схеме расширения для hNPCs. Это стандартная расширить в два раза по объему каждые 7-10 дней.

    3. Измельчитель установки

    figure-protocol-1
    Рисунок 1. McIlwain ткани Chopper. А) Чоп толщина регулировки микрометра, Б) Chopper руки базу и придает руку, C) Крюк на держателе для чашки Петри, D) Таблица релиз ручка и лоток, Е) контроль лезвия сила ручка, F) Кнопка сброса, G) Держатель плиты, привязанность Н) Болт для лезвия, застежкой и гайки, я) Гайка ключ входит в вертолете, J) Blade / застежка орех, К) Клинок застежкой, L ) Автоматизированная регулятор скорости измельчения, М) вращающаяся ручка Руководство измельчения рука, N) Выключатель питания.

    1. Подключите вертолет к розетке в BSC и включите выключатель питания (рис. 1 н). Установите расстояние разделочную до 200 мкм (рис. 1А). Установите лезвие силу до 270 ° или 9:00 если ручка были часы (рис. 1E). Убедитесь, что автоматический регулятор скорости вращается против часовой стрелки, насколько это возможно. (Рис. 1 л).
    2. Перемещение релиз стол весь путь направо подтвердить держатель пластина устойчива (рис. 1D).
    3. Поверните Мануаль рука манипулятора по часовой стрелке, чтобы поднять руку до максимального уровня (рис. 1 М). Руководство рука манипулятора должны быть только вращается по часовой стрелке.
    4. В асептических передачи стерильный обоюдоострым лезвия для измельчения на измельчителя рычага болта с помощью пары щипцов (рис. 1H).
    5. Этот шаг только для цГМФ пассажей, как в одиночку чашку Петри достаточно для обработки научно-класса. Как отмечалось в пункте 2.1.4, регулировочные диски, помещенные внутри посудомоечной базы Петри необходимы для цГМФ. Прокладка диск предотвращает пластиковые черепки от включения в сферы во время процедуры прерывания. Для каждого планируемого отбивной, перевести одну прокладок диск в базе каждого блюда и крышки Петри.
    6. Консерванта разместить застежку (рис. 1K) по лезвию, используя щипцы. Изогнутая часть застежки должна быть выше верхнего края кронштейна. Застежка не будет оставаться на руку, пока гайка не было надежно стиле. Используйте пинцет, чтобы удерживать классичеср на кожу рук и закрепите гайку (рис. 1J) на болт с стерильной ореха водителя. Оставьте гайку А ¼ оборота свободно.

    4. Процедура предварительного отбивная

    1. Трансфер предложенный объем ММ в новую колбу (ы) в соответствии с таблицей 2, колонка С.
    2. В асептических передавать клетки из инкубатора в BSC. Lean колбу (ы) на стойку трубы (рис. 2А) и позволяют сферы поселиться в колбе (ы).
    3. Заключенные аспирации до 12 мл надосадочной жидкости с 5 мл или 10 мл серологической пипеткой и промыть все свободно присоединенными сферы с поверхности колбы (ов). При необходимости повторите и поселиться сферы между полосканий.
    4. Передача предложенный объем см в новую колбу (ы) в соответствии с таблицей 2, колонка D. Пассажей Если два или более колбах Т175, см. шаг 7.1.
    5. Перевести все оставшееся см и сферы в новый 15 мл коническую трубку. Разрешить сферы к себеttle и выбросить использованную колбу (ы).
    6. Важнейший шаг: Медленно перенести сферы от 15 мл коническую трубку на 60 мм чашки Петри или прокладки диска в самой низкой возможной объема; 0,1-0,5 мл рекомендуется (рис. 2б). Держите оставшийся объем СМ как он будет использоваться для полоскания клетки от посудомоечной после отбивной. Постарайтесь свести к минимуму площадь поверхности освещались средствами массовой информации и сфер на блюдо (рис. 2С).

    figure-protocol-2
    Рисунок 2. Подготовка Сфера для измельчения. A) Lean колбу (ы) против стойку трубы или аналогичный пункт для урегулирования сферы в углу колбы. Б) перенос сферы как можно плотнее с конической трубе с Петри блюдо. C) Бассейн сферы из конической трубе в тон середине чашки Петри. D) Удалить столько супернатант как можно дальше от верхней части объединенных сфер. E) Spread сферы с использованием сторону пластиковым наконечником микропипетки. F) Аккуратно перенести сферы с одной стороны бассейна . G) Пример сферах, которые были перемещены в одну сторону бассейна, чтобы облегчить удаление медиа. H) Сгущенное сферы распространено на чашку Петри, готовый для измельчения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    1. Далее, сферы должны быть конденсированы с удалением супернатанта передаваемых через на шаге 4.6. Передача супернатант обратно в 15 мл коническую трубку с аэрозольным барьером наконечником микропипетки (рис. 2D), избежать удаления сферах. Сначала удаление как можно больше средств массовой информации как можно дальше от верхней части медиа / клеток бассейна. Когда это не возможноудалить мультимедиа без сферах, перейдите к следующему шагу.
    Колонка Колонка B Колонка C Колонка D Колонка E Колонка F
    Предварительно Чоп Настой Размер → Сообщение-Чоп Настой (ы) Размер Предлагаемые объем ММ передать новую колбу (ы) предварительно отбивной Предлагаемые объем CM передать новую колбу (ы) предварительно отбивной Предлагаемые объем сфер / СМИ передать в новую колбу (ы) после отбивной Конечный объем Сеяные / Настой
    T12.5 → T25 5 мл 0 мл 5 мл 10 мл
    T25 → T75 10 мл 0 мл 10 мл 20 мл
    T75 → T175 20 мл 10 мл 10 мл 40 мл
    1 T175 → 2 T175s 20 мл на колбу 15 мл на колбу 5 мл на колбу 40 мл
    2 T75s → 4 T175s 20 мл на колбу 17.5 мл на колбу 2,5 мл на колбу 40 мл

    Таблица 2. Руководство медиаф до / после отбивная. Предлагаемые объемы использовать в процессе измельчения.

    1. Распространение бассейн с использованием сторону кончика пипетки для увеличения площади поверхности (рис. 2е).
    2. Важнейший шаг: Совет чашки Петри слегка на себя и использовать сторону кончика мягко сл пипеткиязь все сферы с одной стороны бассейна (фиг. 2F, G).
    3. Важнейший шаг: Когда все клетки были переселены, медленно чаевые чашке Петри в противоположном направлении. В процессе, одни СМИ утечет из сфер. Перевести средства массовой информации обратно в 15 мл коническую трубку. Минимальная удаление сфера является приемлемым.
    4. Используйте сторону кончика пипетки, чтобы аккуратно сдвиньте все сферы обратно в центр чашки Петри таким образом, бассейн имеет диаметр 0.5-2.4 см (рис. 2H). Важно, чтобы держать глубину сфера бассейна мелких. Если бассейн находится слишком глубоко, сферы будут просто оттеснили во измельчения. ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр сферы бассейна не может быть больше, чем 2,5 см или лезвие свяжется края чашки Петри, пропавших без вести клетки.

    5. Процедура Чоп

    1. Перенести чашку Петри на держателе (рис. 1G) и обеспечить блюдокрепится под йХвЪЮФХаЦРвХЫп крючков (рис. 1в).
    2. Фиксатор таблица имеет вырезы, где он будет вписываться в передаче. Используйте фиксатор стол скользить держатель пластины влево так лезвие ясно из сфер и заперли в механизм (рис. 1D).
    3. Важнейший шаг: Опустите вертолет руку, вращая ручной манипулятор ручку (Рисунок 1M) по часовой стрелке, пока лезвие не встанет плашмя на чашке Петри. Одной рукой надавите на кронштейн (рис. 1В) при затягивании гайки с Nutdriver.
    4. Нажмите кнопку сброса один раз (рис. 1F). Устойчивый чашки Петри с одной рукой, а повернув автоматический рука манипулятора ручку (рис. 1 л) по часовой стрелке в положение 90 ° или 12:00 если ручка были часы. ВНИМАНИЕ: Держите пальцы подальше от движущегося лезвия во все времена.
    5. Передайте лезвие полностью через бассейн сфер. Поверните держатель пластин90 °.
    6. Ослабьте болт и повторите шаг 5,3-5,5.
    7. Консерванта передать чашку Петри с держателя пластины на рабочем пространстве в BSC.

    6. Процедура пост-Чоп

    1. Премьер 10 мл серологические пипетки с КМ в конической трубе со стадии 4.6, а затем передать 1 мл на рубленых сферах. Аккуратно вновь приостановить и передать в новый 15 мл коническую трубку. Избегайте пузырей и повторить столько раз, сколько необходимо собрать нарезанные сферы.
      СОВЕТ: Свернуть выскабливание блюдо как пластиковые фрагменты могут отрываться. Это не имеет значения, если с помощью регулировочных дисков из нержавеющей стали. Осторожно клеток, присущие внутри пластикового серологической пипетки. Если это происходит, аспирата пузырьки с перерывами через массовой информации в пипетку, чтобы отделить клетки.
    2. Измерьте объем CM и нарезанные сферы. Добавить соответствующий объем мм до достижения объема, перечисленных в таблице 2, столбец E.
    3. Растираютсферы 2-3x, чтобы разрушить любые свободно слитые сферы.
    4. Важнейший шаг: Алиготе сферы суспензии в каждой новой колбе. Только передать сферу суспензии в одной колбе в то время, и вновь приостановить сферы между переводов. Аликвоты несколько колб в то время, приводит к непропорционально большое число сфер в каждой колбе. Конечный объем в каждой колбе должен быть равен объемы в таблице 2, колонка F. См. шаг 7,2 при посеве больше, чем два колбах Т175.
    5. Снимите гайку с ореховой водителя, а затем и застежкой с стерильным пинцетом. Дезактивации соответствующим 70% МПА или эквивалент. ВНИМАНИЕ: Извлеките использованный лезвия для измельчения только с пинцетом и откинуть на био-опасности контейнер для острых предметов.
    6. Обеззараживать все поверхности вертолета с 70% IPA.

    . 7 Процесс Вариации - Несколько Колбы

    Существуют некоторые различия, когда пассажи более двух T175s. Шагс приведенные ниже, являются изменения из ссылочного шагу.

    1. Ссылки на этап 4.4:
      1. Когда пассажей два T175s, объединить все средства массовой информации и сфер в один колбах Т175. Разрешить сферы урегулировать, а затем Алиготе соответствующий объем CM в каждой из новых колбах, как указано в таблице 2, Колонка D. Перейдите к шагу 4.5.
      2. Когда пассажей больше двух T175s, получить новый T175 колбу и этикетки как колбы CM. Полный шаг 7.1.1, но передать CM в колбу CM. Хранить колбу на стороне BSC, который будет использоваться для сбора см со всех колб, пока все колбы не были нарезанный. Затем CM будет одинаково аликвоты в каждой из новых колбах.
    2. Ссылка шаг 6.4 - Когда измельчения и тот же клеточной линии несколько раз, передать нарезанный сферы суспензии в новой T75 колбу меченые сферы пост-отбивной и запишите объем переданного. Продолжить объединить клетки в этоКолба после каждого измельчить и хранить колбу в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2, 95% влажности. После того как все отбивные были завершены, Аликвотировать сферы суспензии в объеме в каждой новой колбе. Перейдите к шагу 6.5.

    8. Криоконсервация

    Следующий протокол для криогенным сохранения hNPCs.

    1. Разморозить клеток замораживания среды в чистом водяной бане при 37 ° С и затем хранить на льду. Сотовый замораживания среда может быть аликвоты и хранили при -80 ˚ С в течение до 6 месяцев.
    2. Пожар польский стеклянные Пастера пипец, вращая открытие пипетки в пламени. Подготовьте по крайней мере, два больших и два малых огнестрельное полировкой пипец (рис. 3). Сферы будет диссоциировали переход от больших к малым пипец буровых.
    3. Наведите TrypLE Выберите в водяной бане при 37 ° С в течение 5 мин. Удалить и держать при комнатной температуре до готовности к использованию.

    figure-protocol-3
    Рисунок 3. Противопожарные полировки стекла Пастер пипец.) Держите пипетку в верхней части пламени и спина, чтобы равномерно по краям стеклянной пипетки. Б) пример большого диаметра пожарно-полированного стекла пипетки. С) Пример малокалиберной пожарно-полированного стекла пипетки.

    1. Консерванта передать нейросферы в BSC. Разрешить сферы урегулировать, опираясь колбу (ы) против стойку трубки и промыть дно колбы, чтобы удалить любые свободно присоединенными сферы. Разрешить сферы повторно осесть.
    2. Перевести все, кроме 5-10 мл CM в стерильный флакон и измерить общий объем. Положите оставшиеся сферы и средств массовой информации в конической трубе.
    3. После того как все клетки поселились, передать все, но небольшой мениска CM в бутылку и суммировать УВОумэ.
    4. Консерванта передачи 5-10 мл подогретой TrypLE Выберите в конической трубе и повторно приостанавливать осадок клеток. Перенести коническую трубку в C водяной бане в 37 ° в течение 15-20 мин. После 7,5-10 мин, осторожно встряхните коническую трубку перемешать.
    5. Используйте измеренный объем см от шага 8.5 и подготовить равный объем ММ. Объединить и фильтровать 50% CM и 50%-ный раствор мм (решение CM / ММ).
    6. Консерванта передать 40 мкм фильтр в 50 мл коническую трубку.
    7. Когда Инкубационный завершена, спина мл конические пробирки 15 на 15 сек при 100 х г.
    8. Тщательно аспирата и выбросьте TrypLE Выбрать и любой тягучий подложку. Оставьте небольшой мениск. Аккуратно добавить 2 - 4 мл CM / ММ разбавить оставшейся TrypLE Выберите в то время не нарушая гранул. Пусть любые сорванные клетки вновь поселиться, прежде чем выбросить стирки.
    9. Добавить 2-5 мл CM / MM решение сферах трубки. Диссоциируют сферы с 5 мл пипетки, растирая максимум в 10 раз. Пусть ООНдиссоциированные сферы урегулировать в течение 1-2 мин. Перенести диссоциированную клеточной суспензии на 40 мкм сито, чтобы удалить полностью недиссоциированной кластеров.
    10. Повторите шаг 8,12 с огнем полированные большого диаметра стеклянной пипетки, а затем стеклянной пипетки малокалиберной.
    11. Промойте фильтр с 2-5 мл раствора CM / ММ.
    12. Смешайте клеточной суспензии и удалить образцы для анализа жизнеспособности.
    13. Развести образцы с трипановым синим на соответствующий коэффициент разбавления и считать. Используйте стандартный уравнение ниже, чтобы вычислить среднюю концентрацию жизнеспособных клеток и расчета общего жизнеспособных клеток.
      figure-protocol-4
    14. Рассчитайте общий объем клеток замораживания средств массовой информации, необходимой для вновь приостановить клетки на 5,0 х 10 6 клеток / мл. 1 мл клеток будут посеяны в каждый криопробирку. Перенесите криопробирки в BSC.
    15. Центрифуга клеточной суспензии при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С в 15 мл конические трубки для лучшего урожая. Если 50 мл конические пробирки используют для крупномасштабного замораживания вниз, увеличить скорость и время 400 х г в течение 10 мин.
    16. Повторное приостановить осадок клеток, используя морозильной среду клеток в 5,0 х 10 6 клеток / мл. Алиготе 1 мл клеточной суспензии в каждый криопробирку. Для равномерного распределения, аспирации 6 мл подвески и аликвотные 5 криопробирки х 1 мл. Перенесите оставшиеся 1 мл суспензии обратно в бассейн клеток. Повторяйте, пока все пузырьки не будут заполнены.
    17. Консерванта запечатать все сеяных криопробирки и передавать их на лед в течение 5-10 мин.
    18. Используйте одно из следующих действий для стратегии криоконсервации сохранить hNPCs: изопропиловый спирт палата
      1. Заполните необходимое количество камеру (ы) со 100% IPA при комнатной температуре.
      2. Передача семенами криопробирок из льда в камеру (ы) и передать в камеру (ы) в -80 ° C морозильник на ночь. Клетки стабильны в течение до одной недели при -80 ° С, однакопредлагается передать флаконы для долгосрочного хранения в жидком азоте на следующий день.

      Регулируемой скоростью Морозильная камера

      1. Добавить соответствующую программу замерзания до программного обеспечения скорость морозильник контролируемого автора. Примером программы приведены в таблице 3. Рисунок 4 показывает типичную кривую замерзания для hNPCs. Однако точное программа будет варьироваться для каждой модели морозильника. Стандартный общий частота дискретизации должна быть близка к -1 ° С / мин до достижения -40 ° С, где скорость замораживания может быть существенно не возросло, по меньшей мере -80 ° C.
    Шаг Rate (° C) Конец температура (° С) Держите (мин сек) Триггер
    1 - - 5 мин 0 сек Камера
    2 - 1.3 - 5 - Образец
    3 - - 1 мин 0 сек Камера
    4 - 45 - 58 - Камера
    5 + 10 - 26 - Камера
    6 + 3 - 23 - Камера
    7 - 0,8 - 40 - Образец
    8 - 10 - 100 - Камера
    9 - 35 - 160 - Камера

    Таблица 3. Шаги для замораживания hNPCs в контролируемой гели с морозильной камерой. Предлагаемые программа для hNPC криоконсервации на контролируемой морозильник ставки.

    figure-protocol-5
    Рисунок 4. Кривая замерзания Пример. Типичный кривая замораживания hNPCs на контролируемой морозильник ставки.

      1. Перенесите криопробирки из льда в корзины, связанных с морозильной камерой скорости управления. Будьте уверены, чтобы загрузить один криопробирку только с сотового замораживания СМИ использовать для температуры образца зондом. Передача корзин в морозильную камеру и поместить пробоотборника во флакон зонда. Запустите программу.
      2. Когда протокол завершена, передачи флаконов в длительном хранении жидкого азота.

    9. Порядок Размораживание

    Следующий протокол для оттаивания криогенным рзащищены hNPCs.

    1. Перенесите криопробирки от хранения в жидком азоте сразу на сухом льду. ВНИМАНИЕ: Флаконы могут иметь трещины или свободные крышки, позволяющие жидкий азот, чтобы войти в пузырек. Когда удаляется из глубоких условиях замораживания, жидкость может закипеть, сразу взрывается флакон. Используйте соответствующее СИЗ при удалении флаконов.
    2. Подготовить все реагенты и расходные материалы ниже загодя. Как только процесс оттаивания начал, важно, чтобы выполнить эффективно.
      1. Трансфер Neural Stem Cell расширения Средний, мм, 15 мл коническую трубку, один 2 мл и один 10 мл серологические пипетки для каждого криопробирку в BSC.
      2. Минимум 9 мл нейронных стволовых клеток расширения Средний и 5 мл ММ требуется для каждого флакона. Подготовка более из каждого носителя, если это необходимо.
    3. Только таять один флакон hNPCs за один раз. Передача замороженные клетки из сухого льда в чистую 37 ° С на водяной бане и перемешивают в пузырек на водяной бане непрерывно. Контролировать объемлед, который растаял. Когда есть кусок льда примерно 0,5 см влево во флаконе, спрей и протрите с 70% изопропилового спирта и передать в BSC.
    4. Перенести содержимое криопробирку к 15 мл коническую трубку с 2 мл серологические пипетки. Добавьте 1 мл нервной стволовой клетки расширения среды к пустым криопробирку, а затем передать 8 мл нейронных стволовых клеток расширения Средний на размороженных клеток в медленно, по каплям манеру а осторожно встряхивая пробирку. Это сделано, чтобы уменьшить риск осмотического шока.
    5. Перенести полоскание от криопробирку к 9 мл клеточной суспензии. Перенести коническую трубку на лед и повторите шаги 9.4-9.5 для всех остальных флаконов.
    6. Центрифуга конические пробирки при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Во время центрифугирования, подготовить необходимое количество контейнеров для посева, основанных на таблице 4.
    # Флаконов Общий объем Посев (мл) Колба
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Сочетание контейнерах

    Таблица 4. Размеры колбу на основе количества криопробирки талых. Предлагаемые объем и размер колбу, чтобы отобрать hNPCs пост-оттепель.

    1. Повторное приостановить и объединить все пробирки в соответствующем объеме ММ на основе таблице 4. Тщательно перемешать и вновьпереместить образец для подсчета жизнеспособности. См. шаги 8.15-8.16 для подсчета деталей. Стандартный диапазон посев между 160,000-320,000 клеток / см 2.
    2. Смешайте клетки хорошо и Алиготе клетки в колбы. Перенесите колбы к 5% CO 2/37 ° С/95% инкубатор влажность. Смешайте колбу, осторожно встряхивая назад и вперед, чтобы равномерно распределить клетки.
    3. Клетки образуют сферы в течение 24-48 часов. Иногда клетки будут прилипать к пластиковой поверхности и образуют сот-как распределение колоний. Если это происходит, оставить клеток в течение 3 дней перед промывкой клеток свободно, помощь в формировании сферы. Промыть каждые 1-3 дня, пока нет прилипшие клетки. При необходимости передачи клетки в новую колбу.
    4. Обмен 25-75% средств массовой информации с ММ каждые 3-4 дня, пока клетки не готовы рубить, как правило, 7-14 дней после оттепели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 5. Представительства данных.) Прогнозируемые количества клеток из hNPCs замораживают при p19, затем оттаивают и расширена как приверженец монослоя с помощью ферментативной диссоциации по сравнению с нейросферы пассированных помощью метода прерывания. День 0 представляет, когда клетки оттаивали при p20. Б) представительства образ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

figure-discussion-1
Рисунок 6. Разделочные Схематическое. Расширение клетки сфероид стволовых / предшественники в культуре с использованием метода механической разделочную.

Критические шаги

Обзор расширительного измельчения парадигмы показано на рисунке 6. HNPC размер сфера является одним из важных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Soshana Свендсен для критического анализа и редактирования этого отчета. Эта работа была способствовало по NIH / NINDS 1U24NS078370-01 и CIRM DR2A-05320.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стакан, 50 млFisherbrandFB-100-50несколько производителей/поставщиков
Шкаф для биобезопасности, класс IIBakerSG-603A4 фута или 6 футов модель.  Рекомендуется модель 6 футов; несколько производителей/поставщиков
Лезвия, Двухлезвийная подготовкаPersonna74-0002несколько производителей/поставщиков.  ВНИМАНИЕ: Среда для
заморозкиSharp Cell Sigma-AldrichC6295-50MLDMSO, бессывороточная
центрифуга, качающееся ведро со вставками 15 млEppendorf5810 Rнескольких производителей/поставщиков
Конические пробирки, 15 млFisherbrandS50712несколько производителей/поставщиков
Конические пробирки, 50 млBD Falcon352074нескольких производителей/
поставщики МорозильныйрубанкKryo 750несколько производителей/поставщиков
Криовиалы, 2 млCorning430488нескольких производителей/поставщиков
Культурная колба, вентилируемая, T12.5BD Falcon353107нескольких производителей/поставщиков
Культурная колба, вентилируемая, T25BD Falcon353081нескольких производителей/поставщиков
Колба для культуры, вентилируемая, T175BD Falcon353045нескольких производителей/поставщиков
Колба для культуры, вентилируемая, T75 BD Falcon353110несколько производителей/поставщиков
Фильтр, 0.22 & микро; m, прилагаемая чашка, 1 лMilliporeSCGPU11REнескольких производителей/поставщиков
Фильтр, 0,22 & микро; m, прилагаемая чашка, 150 млMilliporeSCGVU01REнескольких производителей/поставщиков
Фильтр, 0,22 &; m, прилагаемая чашка, 500 млMilliporeSCGPU05REнескольких производителей/поставщиков
Фильтр, 0,22 &; m, прилагаемая чашка, 50 млMilliporeSCGP00525нескольких производителей/поставщиков
Фильтровальная бумага, круги 8,5 смВатман/GE1001-085
Щипцы, стандартный шаблон - зубчатый/изогнутый/18 смИнструменты для тонкой науки11001-18
Морозильная камера, изопропиловый спиртNalgene5100-0001Инкубатор"Mr. Frosty",
37 градусов; C/5% CO2Formaсерии 370несколько производителей/поставщиков
Гемацитометр, PhaseHausser Scientific1475несколько производителей/поставщиков
McIlwain Tissue ChopperLafayetteInstruments TC752-PD  Требуется модификация чашки Петри.    ВНИМАНИЕ:  Движущееся, острое лезвие.
Микропипеттор, 1-10 и мкм; lGilsonF144562несколькими производителями/поставщиками
Micropipettor, 100-1,000 μ l (стартовый набор)GilsonF167700несколькими производителями/поставщиками
Micropipettor, 2-20 μ l (стартовый набор)GilsonF167700нескольких производителей/поставщиков
Micropipettor, 20-200 μ l (стартовый набор)GilsonF167700нескольких производителей/поставщиков
Nutdriver, автоклавируемый, 5/16"Steritool10302
Pasteur Pipets, ватная заглушкаFisherbrand13-678-8Bнесколько производителей/поставщиков
Чашка Петри, стекло, автоклавируемыйCorning3160-100
Pipet AidDrummond4-000-101несколько производителей/поставщиков
Прокладочный дискMcMaster-CarrПЕРЕМЕННЫЙнесколько производителей/поставщиков
Стерильные барьерные наконечники для пипеток, 10 & мкм; lAvantGuardAV10R-Hнесколько производителей/поставщиков
Стерильные барьерные наконечники для пипеток, 1,000 μ lAvantGuardAV1000несколько производителей/поставщиков
Стерильные барьерные наконечники для пипеток, 20 μ lAvantGuardAV20-Hнесколько производителей/поставщиков
Стерильные барьерные наконечники для пипеток, 200 μ lAvantGuardAV200-Hнесколько производителей/поставщиков
Стерильные одноразовые пипетки, полностью пластиковая пленка, 10 млFisherbrand13-676-10Jнесколько производителей/поставщиков
Стерильные одноразовые пипетки, полностью пластиковая пленка, 2 млFisherbrand13-675-3Cнесколько производителей/поставщиков
Стерильные одноразовые пипетки, полностью пластиковая пленка, 25 млFisherbrand13-676-10Kнесколько производителей/поставщиков
Стерильные одноразовые пипетки, полностью пластиковая пленка, 5 млFisherbrand13-676-10Hнесколько производителей/поставщиков
Стерилизационные пакеты, 19 x 33 смCrosstexSCLнесколько производителей/поставщиков
Ситечко, 40 &; mBD Falcon352340
Чашки для культуры тканей, 60 ммBD Falcon351007
Штативы для пробирок, взаимосвязанные четырехсторонниеFisherbrand03-448-17
Водяная баняFisherbrandS52602Qнескольких производителей/поставщиков
Нейронный предшественник Клеточно-специфические обрабатывающие реагенты
Нейральные стволовые клетки Расширяющая среда (Stemline)Sigma-AldrichS3194-500MLВажно использовать бренд Stemline
Рекомбинантный фактор роста эпидермиса человека (EGF)MilliporeGF316несколько производителей/поставщиков
Рекомбинантный фактор ингибирования лейкемии человека (LIF)MilliporeLIF1010нескольких производителей/поставщиков
Trypan Blue (0.4%)Sigma-AldrichT8154-100MLнесколько производителей/поставщиков
TrypLE Select (1x)Life Technologies12563-011
с регулируемой скоростью

Ссылки

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

Теги

cGMP
ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.