Объединив родным и сшивания иммунопреципитацию хроматина с высоким разрешением масс-спектрометрии, ChroP подход позволяет препарировать композитный протеомный архитектуру модификаций гистонов, вариантов и не-histonic белков синергизма в функционально различных доменов хроматина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
ChroP подход сочетает в себе чип и масс-спектрометрии для Рассеките Локус-специфические протеомные Пейзажи хроматина
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов сделаны из ДНК и белков, который управляет различными процессами ДНК-зависимой. Структура хроматина и функции в конкретных регионах регулируется местного обогащения гистонов пост-трансляционных модификаций (hPTMs) и вариантов, хроматин-связывающих белков, в том числе факторов транскрипции, и метилирования ДНК. Протеомный характеристика хроматина композиции в различных функциональных областях был до сих пор препятствует отсутствие эффективных протоколов, чтобы обогатить таких доменов на соответствующем чистоты и количества для последующего углубленного анализа методом масс-спектрометрии (МС). Мы описываем здесь недавно разработанный стратегию хроматина протеомики, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics), в результате чего препарат иммунопреципитация хроматина используется для изоляции различных регионов хроматина, чьи черты лица, с точки зрения hPTMs, варианты и со-связанные не-histonic белки, являются анализируют методом МС. Проиллюстрируем онре создание ChroP для обогащения и анализа транскрипционно молчащих гетерохроматиновых районов, отмеченной присутствии три-метилирования лизина 9 гистона H3. Результаты, достигнутые продемонстрировать потенциал ChroP в тщательно характеризующий гетерохроматина протеома и доказать это в качестве мощного аналитического стратегии понимания того, как различные белковые детерминанты хроматина взаимодействовать и объединения усилий для установления структурных и функциональных конфигураций Локус-специфичные.
Введение
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов, который участвует в качестве основного шаблона для всех процессов ДНК-опосредованной. Нуклеосом является основным повторяется единицей хроматина и состоит из белкового октамерных ядра, содержащего две молекулы каждого канонического гистона H2A, H2B, H3 и H4, вокруг которого 147 п.о. из ДНК, обернутой 1,2. Все основные гистоны структуру шаровой области и гибкой N-терминальном "хвосте", которая выступает за нуклеосоме. Одним из основных механизмов для регулирования структуры хроматина и динамику основана на ковалентных пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы), котор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток
- Стандартный среда для родной ChIP
- Grow HeLa клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% глутамина, 1% Pen / Strep и 10 мМ HEPES рН 7,5.
- SILAC маркировки для сшивания ChIP
- Grow HeLa клетки в SILAC DMEM среде, обедненный из лизина и аргинина, с добавлением 10% диализованной FBS, 1% глутамина, 1% Pen / Strep, 10 мМ HEPES, рН 7,5 и либо легкой L-лизина (Lys 0) и L- аргинин (Арг 0) или их тяжелые коллеги, L-лизин (Lys 8) и L-аргинин (Арг 10) (Материалы Таблица), на конечных концентрациях 73 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Иммунопреципитации хроматина является мощным средством используется для профилирования локализацию белка или модификации гистонов вдоль генома. В протеомики эквиваленте, чип следует протеомики MS основе определить качественно и количественно в hPTMs, варианты гистонов и хроматина-связывающие белки, которые иммунопреципитировали вместе с модификацией или интерес белка, используемые в качестве "приманки". В подходе N-ChroP, изложенные на фиг.1А, родной чип, в котором хроматин, расщепленную MNase.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы недавно описал ChroP, количественную стратегию масштабного характеристики белковых компонентов хроматина. ChroP сочетает в себе два взаимодополняющих подходов, используемых в эпигенетической области, Чип и магистра, прибыль от их сильных и преодоления их соответствующие ограничения. ЧИП связан с глубокой последовательности (чип-Seq) позволяет генома отображение модификаций гистонов в разрешении нескольких нуклеосом 35. Хотя выгодно их чувствительности, анализы на основе антител ограничены в их способности .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Это исследование было впервые опубликована в Mol Cell протеомики. Soldi М. и Bonaldi Т. Протеомный Исследование хроматина функциональных областей показывает Novel синергизм среди Отдельное гетерохроматина Компоненты MCP. 2013; 12: 64-80. © Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Мы благодарим Роберта Noberini (Итальянский технологический институт и НОО, Италия) за критическое прочтение рукописи. Работа ТБ поддерживается грантами Armenise Гарвард-Foundation Программы Джованни Career Development, итальянской ассоциации по исследованию рака и Министерства здравоохранения Италии. MS Работа выполнена при поддержке стипендии FIRC.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Лизин 0 (12C6 14N2 L-лизин) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Аргинин 0 (12C6 14N4 L-аргинин) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Лизин 8 (13C6 15N2 L-лизин) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Аргинин 10 (13C6 15N4 L-аргинин) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| микрококковая нуклеаза | Roche | 10 107 921 001 | |
| Полный, не содержащий ЭДТА коктейль ингибиторов протеазы | Roche | 04 693 132 001 | |
| Диализная трубка Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, плоская ширина 18 мм, длина | 50 футовSpectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick Набор для очистки ПЦР | QIAGEN | 28104 | |
| Антигистон H3 триметилированный K9-ChIP класс | Abcam | ab8898 | |
| Гистон H3 пептид триметил K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Бис-Трис Гель | Набор для | ||
| gen | LC6025 | ||
| LDS Буфер для образцов | Invitrogen | NP0007 | |
| формальдейд | Sigma Aldrich | F8775 | |
| ангидрид ацети-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| [header] | |||
| Муравьиная кислота | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| ≥ 99% (ВЭЖХ), кристаллический | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-дитиотреитол | Sigma Aldrich | 43815 | |
| секвенирования модифицированный трипсин, замороженный 100 μ g (5 × 20 μ g) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μ m x ID 75μ m, советы ID 8 μ m без покрытия Pk 5 | Микроколонна Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &; М 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Диск для экстракции углерода, 47 мм | Agilent Technologies | 12145040 | |
| диск для экстракции катионом | Agilent Technologies | 66889-U |
Ссылки
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
