Методическая статья

Тестирование

15.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51241

⸱

12 июня 2014 г.

 ,  , 
1Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-6265 CNRS, 2Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-1324 INRA, 3Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, Université de Bourgogne

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем тест выбор, чтобы выявить влияние пахучих веществ на Drosophila поведения с помощью Y-лабиринт анализа.

Аннотация

Обнаружение сигналов из окружающей среды имеет важное значение для животных, чтобы обеспечить их выживание. С этой целью они используют экологические сигналы, такие как видение, mechanoreception, слуха и chemoperception через вкус, через прямой контакт или через обоняния, который представляет ответ на летучих молекулы действующего на большей дальности. Летучие химические молекулы очень важные сигналы для большинства животных в обнаружении опасности, источник питания, или для обмена данными между физическими лицами. Дрозофилы является одним из наиболее распространенных биологических моделей для ученых, чтобы исследовать клеточные и молекулярные основы обоняния. Чтобы подчеркнуть обонятельные способности этого маленького насекомого, мы описываем модифицированный выбор протокол, основанный на тесте на Y-лабиринт классически используется с мышами. Данные, полученные с Y-лабиринты дать ценную информацию, чтобы лучше понять, как животные иметь дело с их постоянно меняющихся условиях. Введем протокол шаг за шагом изучатьВоздействие пахучих веществ на лету разведочного ответ, используя эту Y-лабиринт анализа.

Введение

Хеморецепция через вкуса или обоняния является ключевым сенсорные модальности для выживания животных. Это дает жизненные сигналы, необходимые для обнаружения опасности или источников питания, а также для социальных взаимодействий. Он также помогает животным, чтобы найти партнера необходимую секс для их воспроизводства. На протяжении более 20 лет, интенсивные исследования, в том числе лауреат Нобелевской премии работы Ричард Аксель и Линда Бак в 2004 году "за открытия, одоранта рецепторов и организации обонятельной системы", была проведена выявить молекулярные и клеточные основы обоняние 1,2.

Один из любимых животных моделях для ученых рассекать обонятельный восприятие является Д. MELANOGASTER. Это насекомое похожая клеточной и молекулярной запах кодирования стратегию с млекопитающих. Научное сообщество использует различные поведенческие парадигмы, чтобы изучить роль отдушек в этой плодовой мухи. Эти тесты включают мультимодальные анализы, такие как courtshiр Тесты, где различные сенсорные модальности, в том числе обоняния, которые важны для выявления мужского ухаживания 3. Другие анализы также были разработаны для решения роль одорантов более конкретно; к ним относятся Т-лабиринты, Y-лабиринты, ловушки анализы, четыре полевых арен и аэродинамических трубах 4,5,6,7,8.

В этой статье мы приведем простой модифицированный Y-лабиринт анализа, которая обеспечивает надежные обонятельные ответы с помощью D. MELANOGASTER. Наш набор использует конечных советы в отличие от ранее описанного метода 9. Таким образом, наше Y-лабиринт имеет два преимущества. Во-первых, он позволяет избежать возвращения в системе после того, как муха сделала свой выбор. Во-вторых, это ограничивает обмен пахучих веществ во всех областях Y-образном лабиринте. Этот последний преимуществом является важным, поскольку Drosophila очень чувствительны к воздушным потоком, которая часто используется, чтобы избежать одоранта насыщенность. Для регулировки экспериментальной установки с воздушным потоком будет время и стоимость трудоемким. Таким образом, наша Y-лабиринт анализ представляет собой эффициента и быстрый способ проверить обонятельный производительность дрозофилы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Перед началом

  1. Используйте isogenized опорный запас подшипник в стабильных и надежных поведенческих фенотипов. Там не существует общего правила для выбора этого запаса, поскольку все потенциальные управления может нести неоднородного фона аллели.
  2. Используйте этот штамм управления для обратного скрещивания все остальные акции, необходимые для более поздних стадий. Этот шаг возвратное скрещивание обычно представляется, по крайней мере 5 последовательных скрещиваний одной девственной самки (чтобы можно кроссинговер между гомологичными хромосомами) до 2-3 изогенных справочных мужчин 5. Этот шаг важен для гомогенизации генетический фон между различными акциями лету.
  3. Поддержание Drosophila запасов на стандартную кукурузной муки (9%), дрожжи (10%), а также агаровой среде (1,5%), дополненной антибиотиками (0,4% метил пара-гидрокси-бензоат) в 12-час цикле свет / темнота в 25 ° C.
  4. Достижение хемосенсорных экспериментов в контролируемой температурой комнаты (25 ° C) под дальнего красного света(Для устранения вклад визуальные подсказки, и сосредоточиться на хемосенсорных сигналов). Регулярно обновить воздух в помещении, чтобы проветрить помещение между каждого эксперимента.

2. Обонятельная отклика с помощью Y-лабиринт Пробирной

  1. Голодать в течение 16-18 мух ч при 25 ° С в стеклянных трубках, содержащих влажное бумажное полотенце перед испытанием.
  2. Присоединяйтесь разъем Y-образный для двух стеклянных флаконах и в меньшей пластической флакона (загрузка флаконе). Используйте 1 мл пипетки советы, которые проходят через пены пробками связать разъем с тремя флаконах, и получить плотно закрытой Y-лабиринт. Обрежьте узкие концы двух наконечников пипеток (~ диаметр 2 мм, чтобы избежать любого возвращение лету, когда он сделал свое решение) с образованием двух "ловушки" флаконов, и большой конец одного наконечника пипетки, чтобы сформировать "загрузка" Трубка (фиг. 1A).
  3. Просто перед подключением «ловушка» ампул (Рисунок 1б), поместите одну ~ 6 мм Диаметр фильтровальную бумагу вкаждый флакон. Добавить 40 мкл одоранта решения на одном фильтровальной бумаги, и 40 мкл соответствующий растворитель на втором фильтровальную бумагу.
  4. Представьте десяти от 4 до 9 однодневных мух в "загрузки" флаконе. Не используйте CO 2 анестезии во время этого переноса, так как он оказывает сильное влияние на поведение 10. Скорее использовать краткое охлаждении на льду. Правильное манипулирование анестезированных мух важно ограничить нагрузку на субъектов, насколько это возможно.
    1. Выполните серию Y-лабиринт испытаний при 25 ° С под дальним красным светом (с использованием светодиодных ламп, чтобы ограничить возможный источник отопления), чтобы избежать визуальных стимулов как можно больше. Будьте осторожны, чтобы чередовать ориентацию на Y-лабиринты (одоранта, содержащий труб слева, или справа, и загрузочной трубы в передней или в задней части; Рисунок 1C).
    2. Разрешить несколько часов для мух, чтобы войти в ловушки флакон, содержащий одоранта или растворитель. Всего мух после 24 часов, чтобы увеличить participatiна до более чем 80% и обеспечить максимальную обонятельный значение индекса (Симонне, личное сообщение).
    3. Рассчитайте результате обонятельный индекс по следующей формуле: (количество в запаха трубки - число в трубке растворителя) / общее количество загруженных мух.
  5. Вымойте Y-лабиринт настройки следующим образом: смочите демонтированы настройку в RBS 35 MD ночь. Тщательно промыть проточной водой. Наконец промыть деионизированной водой и дайте высохнуть.

3. Статистический анализ данных

  1. Выполните т-тест, односторонний ANOVA или двусторонний ANOVA в зависимости от данных и переменных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1D показывает два представительства ответы с помощью этой Y-лабиринт анализа. Canton-S самцы сильно избежать 10% уксусной кислоты, разбавленного дистиллированной водой, в то время как они существенно не избежать 10% фенилуксусной кислоты. Эти анализы основаны на 10 мужчинах в репликации, помещенных вместе в загрузочном флаконах. Этот протокол может иногда привести к большой стандартной ошибки среднего. Если необходимо, то можно уменьшить этот недостаток при помощи 20 мужчин на повторах вместо вс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наш протокол Y-лабиринт основан на описанной выше протоколом 9. Тем не менее, мы вводим два основных отличия. Во-первых, мы используем узкие наконечники для предотвращения мух от возвращения, как только они решили вступить в пробирку, содержащую растворитель или растворитель плюс одоранта. Эти узкие советы также полезны для ограничения одоранта диффузии в Y-образном лабиринте. Во-вторых, мы используем меньший загрузки флакон, чтобы заставить мух, чтобы войти в Y-образном лабиринте. Важно иметь высокую участие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим 4 анонимных рецензентов за их работу, чтобы улучшить рукопись. Мы благодарим Национальный центр Научных Исследований за финансовую поддержку в МБГ и Ю.Г. и Университет Бургундии и французское министерство исследований в MMS. Исследования в лаборатории Ю. Г. финансируется Европейского исследовательского совета (ERC Начиная Грант, GliSFCo-311403), Национальное агентство по де-ла-Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), в Conseil Régional Бургундии (Faber), и CNRS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубка из полистирола для дрозофилыVWR европа734-225530 x 25 мм 
Y-maze
Дрозофила боросиликатная трубкаDijon verre95 X 25 мм
Y-maze
Пенопластовая пробкаDutscher999038
Y-образный лабиринт
Y-образный соединительEuroprix11020605
Y-maze
100-1,000 µ l наконечники для пипетокCorning4868Соедините следующие наконечники для пипеток с Y-образным разъемом. Отрежьте 2 наконечника пипетки на расстоянии 65 мм от широкого конца и соедините узкий конец (с помощью ∼ 2 мм открытия) до 2 тестовых флаконов. Эти отверстия ограничивают развороты, как только мухи попадут в трубки, содержащие запахи. Отрежьте 1 наконечник пипетки на расстоянии 35 мм от широкого конца, и подсоедините его к загрузочному флакону.
Y-maze
Дальняя красная светодиодная лампаRubin-Lacaque0RB180238625-630 нм
Уксусная кислотаSigma-Aldrich45725
Фенилуксусная кислотаSigma-AldrichP16621
Дрожжичувствительные ароматизаторы Страсбург1018880464
кукурузной мукиeurogermFarine de maï s
Agar KalysHP-697-25
Метилгидрокси-4 бензоатVWR международный25605293

Ссылки

  1. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  2. Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
  3. Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
  4. Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
  5. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
  6. Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
  7. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  8. Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
  9. Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
  10. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
  11. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
  12. Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи