Здесь мы описываем процесс полного иммуноокрашивания антенн дрозофилы, что позволяет нам лучше понять молекулярные механизмы, участвующие в диверсификации нейронов обонятельных рецепторов (ORN).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пахучих молекул связываются с их целевыми рецепторами в точном и скоординированным образом. Каждый рецептор распознает специфический сигнал и передает эту информацию в мозг. Таким образом, определение того, как обонятельная информация передается в мозг, изменяя как восприятие и поведение, заслуживает изучения. Интересно, что появляется все больше доказательств, что сотовой трансдукции и транскрипционные факторы участвуют в диверсификации обонятельной нейрона рецептора. Здесь мы предлагаем надежные вся гора иммунологический способ маркировки для анализа в естественных условиях обонятельный организацию рецепторов нейронов. Используя этот метод, мы определили все обонятельные нейроны рецептора с анти-Elav антитела, известный пан-нейронной маркера и Or49a-mCD8 :: GFP, обонятельного рецептора нейрона специально выражается в НБА нейрона с использованием анти-GFP антитела.
Введение
Обонятельная система используется, чтобы различать между огромным разнообразием молекулами запаха и впоследствии отправить получаемую информацию на высших мозговых центров. Этот вход используется для точного контроля фундаментальные поведения животных, такие как кормление и спаривание 1-6. Поскольку каждый обонятельный Тип нейрон связан с определенным набором запахов, диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с является жизненно необходимым для обонятельной системы функции 7.
Drosophila генетика позволяет нам выполнять один расследование клеточном уровне с участием молекулярных механизмов, связанных с развитием ORN и физиологической функции 8-16. Вся гора иммуноокрашивание Drosophila антенн позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы, участвующие в диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с 7. При этом мы предоставляем всестороннее описание простой метод для переменного токаhieve это.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка яблочный пластину
- Смешайте 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H 2 O. Микроволновая смеси в течение от 1 до 2 минут и вылить на блюдо 3 см клеточной культуре. Хранить при температуре 4 ° C.
2. Генетическая крест
- Используйте следующую представительство генетический крест:
Or49a-mCD8 :: GFP / суо х Ш 1118
3. Протокол Вскрытие и окрашивание
- Обезболить муху, а затем вырезать летать голову вертикально, удерживая его с помощью пинцета.
- Аккуратно положите антенн, содержащий часть на яблоко пластины.
- Разрежьте третий сегмент антенны с использованием тонких ножниц рассечение.
- Поместите 90 мкл фиксирующего раствора (4% параформальдегида в 0,1% PBST (PBS с 0,1% Triton X-100)) в середине со стеклянным дном чашки для культивирования.
- Аккуратно передачи расчлененный Antennае с острой иглой непосредственно в фиксирующем растворе. При необходимости физически погрузить антенны в растворе с использованием иглы.
- Инкубировать в течение 40 минут при комнатной температуре (RT). Вымойте антенны в 0,4% PBST (PBS с 0,4% Triton X-100), 3x 10 минут в каждом, держа их в том же блюде. Используйте желтые советов, удалять и добавлять решение PBST. Используйте 90 мкл промывочного раствора каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не устанавливайте блюдо в шейкер во иммуногистохимии. Перед удалением или добавлением раствора в блюдо, принести все антенны в центр блюда, используя иглу и осторожно добавить или удалить решение от края тарелки. - Блок антенн с 90 мкл 5% нормальной лошадиной сыворотки в 0,1% PBST в течение 20 минут при комнатной температуре.
- После удаления блокирующего раствора, инкубировать антенн с 90 мкл первичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С в увлажненной контейнера, как описано ранее 8.
- Вымойте антенны 6x 10 минут в 0,4% PBST.
- Инкубируйте антенны с 90 мкл вторичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С. Вымойте 6х 10 минут с помощью 0,4% PBST.
- Для установки антенны, удалить PBST из культуральной чашке, насколько это возможно, и постепенно вводить двух разных концентраций глицерина к антеннам. Сначала добавьте 40% глицерина в чашке в течение от 1 до 2 минут; затем снимите это и добавить 80% глицерина.
- Осторожно извлечь усики (в том числе 80% глицерина) из культуральной блюдо, используя желтый наконечник и разместить их на слайд. Аккуратно поместите покровное на вершине и печать покровное края с лаком для ногтей. Усики готов для включения в образ с помощью флуоресцентной микроскопии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обеспечение соответствия рассечение и фиксация выполняются быстро является ключевым фактором в достижении успеха с этим протоколом. Использование тонких ножниц и щипцов также имеет решающее значение. После иммуноокрашивания, люминесцентные помечены антенны исследовали под конфокальной микроскопии. Мы обычно занимает 1 мкм разделы, используя 20x объектив. Мы помечены НБА 7 ORNs используя Or49a-mCD8 :: GFP и подсчитывали количество НБА ORNs в дикого типа антенны. MCD8-GFP репортер клеточная мембрана локализован...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рассечение антенны Drosophila мы описываем является простым и легким для выполнения в лабораторных условиях. Чтобы обеспечить успешное вскрытие, важно использовать тонкой краями ножниц. В то время как иммунного окрашивания рассеченные антенну, важно, чтобы инкубировать их в влаги заполненный контейнер, чтобы избежать испарения раствора антител. Расчлененный антенна имеет тенденцию всплывать в растворе. Использование 0,1% Triton в PBS в течение фиксации и блокировки шаги будут способствовать погружение антенны в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано МПКСНТ программы, поддерживаемой для исследовательского Фонда стратегической в частных университетах и JSPS молодых ученых B гранта на HT Мы хотели бы поблагодарить Ohtake Норихито редактировать видеоклипы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Stemi DV4 диссекционный микроскоп | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Стеклянные посуды для культуры на дне | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Ножницы для вскрытия | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Крысы против ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Разведение 1:200 |
| Мышиный анти-GFP | Invitrogen | A11122 | Разведение 1:400 |
| Donkey Anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Разведение 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Разведение 1:200 |
Ссылки
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
