Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Винтовая Организация свертывания крови фактора VIII на липидный нанотрубок

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51254

⸱

3 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Medical Branch, 3Sealy Center for Structural Biology and Molecular Biophysics, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии, липидов нанотехнологии и структурного анализа применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных FVIII формах: человека и свиньи. Методология, разработанная в нашей лаборатории, чтобы спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается.

Аннотация

Крио-электронной микроскопии (Крио-EM) 1 является мощным подход исследовать функциональную структуру белков и комплексов в гидратной государственной и мембранной среды 2.

Фактор свертывания крови VIII (фактора VIII) 3 многодоменный плазмы крови гликопротеин. Дефект или недостаток фактора VIII является причиной гемофилии типа А - тяжелое расстройство кровотечения. По протеолитической активации фактора VIII связывается с серинпротеазы Фактор IXa на отрицательно заряженной мембраны тромбоцитов, которая имеет решающее значение для нормального свертывания крови 4. Несмотря на ключевую роль фактора VIII играет в коагуляции, структурная информация для его мембраносвязанного государства является неполной 5. Рекомбинантный FVIII концентрат является наиболее эффективным средством против типа гемофилии А и коммерчески доступны FVIII может быть выражена как человека или свиньи, как при формировании функциональных комплексов с человеческим фактором IXa 6,7. "> В этом исследовании мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии (Крио-EM), липидов нанотехнологии и структурный анализ применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных форм фактора VIII:. Человеческий и свиной Методология, разработанная в нашей лаборатории на спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается. Представительные результаты показывают, что наш подход является достаточно чувствительным, чтобы определить различия в спиральной организации между ними высоко гомологичны в последовательности (идентичность последовательности 86% ) белки. Подробные протоколы для спиральной организации, Cryo-EM и электронной томографии (ET) сбора данных приведены. двумерной (2D) и трехмерной (3D) структурный анализ применяется для получения 3D-реконструкций человека и свиньи фактора VIII-LNT обсуждается. Представленные человека и свиньи структуры фактора VIII-LNT показать потенциал предлагаемой методологии для вычисэ функционал, связанный с мембраной организация свертывания крови фактора VIII с высоким разрешением.

Введение

Фактор свертывания крови VIII (FVIII) является большой гликопротеин 2332 аминокислот, организованных в шесть областей: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. После активации тромбин FVIII действует как кофактор к фактору IXa в связанной с мембраной Тэнасе комплекса. Связывание активированного фактора VIII (FVIIIa) в FIXa в мембранный-зависимости образом повышает FIXa эффективность указанных протеолитических более 10 5 раз, что имеет решающее значение для эффективного свертывания крови 4. Несмотря на важную роль фактора VIII играет в коагуляции и образования комплекса Тэнасе, функциональная мембраносвязанный структура фактора VIII до сих пор не решен.

Для решения этой проблемы, одиночные липидного бислоя нанотрубки (LNT), богатые фосфатидилсерином (PS), способные связываться FVIII с высоким сродством 8, 9 и напоминающие поверхности активированных тромбоцитов были разработаны 10. Последовательный винтовая организация фактора VIII обязаны LNT было доказано быть эффективнойве для структуры определения фактора VIII мембраносвязанного государства по Cryo-EM 5. Функционализированный LNT являются идеальной системой для изучения белок-белковых и белок-мембрана взаимодействия спирально организованных мембранных белков, ассоциированных с Cryo-EM 11, 12. Криогенная EM имеет преимущество по сравнению с традиционными структурных методов, таких как рентгеновской кристаллографии и ЯМР, как образец сохраняется в ближайший к физиологической среде (буфер, мембраны, Ph), без добавок и изотопов. В случае фактора VIII, изучая мембраносвязанное структуру с этой техникой еще более физиологически значимым, так как LNT сильно напоминают по размеру, форме и составу псевдоподий из активированных тромбоцитов, где Тэнасе комплексы собирают в естественных условиях.

Дефекты и дефицит фактора VIII причины гемофилии А, тяжелым расстройством кровотечения, влияющих 1 в 5000 самцов человеческой популяции 4, 6. Наиболее еffective терапия для гемофилии А является пожизненное администрация рекомбинантного человеческого фактора VIII (hFVIII). Значительное осложнение рекомбинантного фактора VIII Гемофилия А терапии является развитие ингибирующих антител к человеческой форме, влияющих около 30% больных гемофилией А 13. В этом случае свиной FVIII (pFVIII) концентрат используется, как свиньи FVIII отображает низкой перекрестной реактивностью с ингибирующих антител против человеческого фактора VIII и форм функциональные комплексы с человеческим FIXa 7. Установление мембраносвязанное организацию как свиньи и форм человеческих FVIII важно понимать структурную основу функции кофактора фактора VIII и последствия для гемостаза крови.

В этом исследовании мы описываем сочетание липидов нанотехнологии, Cryo-EM и структурного анализа разработан, чтобы решить мембраносвязанное организацию двух весьма гомологичных форм фактора VIII. Представленные данные Крио-EM и 3D структуры для спирально организованной Porciпе и человеческого фактора VIII на отрицательно заряженной LNT показать потенциал предлагаемой нанотехнологии как основы для структуры определения фактора VIII и связанных с мембраной факторов и комплексов в физиологической среде мембраны коагуляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образца

  1. Буфер обмена человеческого фактора VIII-BDD 14 и свиной FVIII-BDD 15 против HBS-Ca буфера (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2, рН = 7,4) и концентрируют до 1,2 мг / мл. Держите белкового раствора при температуре -80 ° С.
  2. Подготовка липидов нанотрубок (LNT) путем смешивания GalactosylCeramide (GC) и фосфатидилсерин (PS) в 1:04 в / в соотношении в хлороформом. Упаривают хлороформ в атмосфере аргона и солюбилизации липидов в HBS буфере до 1 мг / мл. Держите LNT решение при 4 ° С.

2. Крио-электронной микроскопии фактора VIII-LNT

  1. Крио-ЭМ Подготовка образцов
    1. Тлеющий разряд 300 сетка Quantifoil R2 / 2 медных сетей (побочные углерода до) в смеси O 2 и H 2 газа в течение 10 сек при 50 W.
    2. Смешайте растворы FVIII и LNT в HBS-буфере Ca в 1:01 вес / вес отношение и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Нанесите каплю 2,5 мклиз фактора VIII-LNT образца с гидрофильным электронной микроскопии сетки в Vitrobot Mark IV влажной камере (100% влажности).
    4. Клякса и флэш заморозить сетку (один пятно в течение 3,5 сек, промокните силу 1) в жидком C 2 H 6, охлаждается жидким N 2, чтобы получить аморфный лед.
    5. Храните сетки в ящики для хранения в жидком N 2 (LN2).
  2. Крио-ЭМ сбора данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: JEM2100-LaB6 (2010 год) оснащен операционной системой TEMCON, состоящей из компьютера, подключенного к электронным микроскопом, экраном с окнами чтения вакуумную систему, систему освещения, HT, объектив токи и так на и два панели: с обеих сторон, размещены по обе стороны колонны. Сдвиг луч X, Y ручки (SHIFT Y, SIFT Y) и многофункциональные (DEF / STIG) ручки находятся на обеих панелях. На левой панели находится регулятор освещения (BRIGTHNESS). На правой панели расположены: увеличение (МАГ / CAM длина) и фокусировки (Фокус) ручки и три Imaginг (MAG1, MAG2, LOWMAG) и дифракционной (DIFF) кнопки режимов. Мы приобретаем наши данные в MAG1 на альфа-2. Минимальная доза условия освещения (MDS), необходимые для сбора данных Крио-EM устанавливаются с F1 до F6 кнопок, верхнем ряду на правой панели. В этом протоколе используются общие настройки: F1 - поднять / опустить экран, F2 - режим поиска, F3 - режим фокусировки, F4 - Режим ФОТО, F5 - MDS OFF / ON и F6 - ЛУЧ ПУСТО, используются для защиты образца от радиации повредить, отклоняя луч.
    1. Поместите Крио-держатель в крио-станции и наполнять сосуд Дьюара держателя и крио-станции с LN2. Когда температура достигает -192 ° C, открытый затвор на кончике держателя, место ранее заморожены Крио-EM сетки в отведенном для этого месте и закрепите с кольцевой зажим.
    2. Вставьте крио-держатель в электронном микроскопе. Заполните Дьюара в крио-держателем и анти-загрязнитель камеры с LN2. Подождите, пока держатель для стабилизации в течение 30-60 мин. Нажмите F6, иповерните нить на. Когда нить насыщенный, нажмите F6 и откройте затвор на держатель, чтобы посмотреть в сетку.
    3. Пресс Низкий Mag / альфа-1 (установлен на уровне 200X MAG) и размещает места тонким льдом на сетке.
    4. Перейти к MAG 1/alpha 2 установить минимальную дозу режим (MDS) и получать данные Крио-EM при низких электронных дозах, не повреждая образца.
      1. Нажмите F2, чтобы установить режим поиска. Установите увеличение в 40000 х. Увеличить пучок с BRIGTNESS ручки к минимальной дозе электронного ~ 0,04 э - / A 2 · с. Пресс DIFF для переключения в режим дифракции. Установите длину камеры до 120 см с ручкой МАГ / CAM длина. Найдите области на сетке в пределах предварительно выбранных районов в LOWMAG которые имеют липидные нанотрубки в отверстия углеродной пленки.
      2. Нажмите F4, чтобы установить режим фото при 40000-кратном увеличении и установить освещение с яркостью ручки в дозах 16-25 е - / A 2 · с. Нажмите кнопку Стандартный фокус установить фокус условия регулировки Z-высотаобразца с Z вверх / вниз (панель П контроль). Установите расфокусировки от -1,5 до -2,5 мкм.
      3. Совместите ПОИСК и режим ФОТО рисуя квадрат в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры в режим поиска соответствующей области для включения в образ в режиме фотосъемки.
      4. Нажмите F3, чтобы установить режим фокусировки при 100000-кратном увеличении. Фокус освещение для покрытия чип CCD (~ 4 - 5 Радиус см) и от оси не облучать область, которая будет отображается в режиме PHOTO. Отрегулируйте расфокусировки до ~ -1.5 и -2.5 мкм с FOCUS ручкой и правильным для астигматизма изображения с DEF / Стиг ручек.
    5. Выберите фактора VIII-LNT для включения в образ в режим поиска путем приобретения изображения в реальном времени в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры. Сосредоточьте фактора VIII-LNT на площади нарисованного на окне Live View.
    6. Запись цифрового изображения на ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения и 0,5 воздействия сек за счет перехода в режим Фото и нажав обретенияE кнопку на цифровой микрофотографии мониторе фотокамеры. Условия получения изображения устанавливаются такие как луч заготовки (жалюзи) открытой только тогда, когда образ приобрел в режиме фотосъемки.
    7. Проверьте качество и расфокусировки полученного изображения, нажав CTRL-F для получения быстрого преобразования Фурье (БПФ).

3. 3D Реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа изображений используются для 2D и 3D анализа: EMAN2 и IHRSR находятся в свободном доступе. EMAN2 можно загрузить с http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Программное обеспечение IHRSR можно получить от профессора Egelman: egelman@virginia.edu. Окончательные уточнения IHRSR запускаются на Техас расширенный Computing Center кластер: http://www.tacc.utexas.edu/ в Университете Техаса, Остин. Алгоритм восстановления 3D показано на рисунке 1 состоит из двух основных этапов: Первый выбора гомогенной набор спиральных сегментов (частиц) с эталонным бесплатно alignme 2Dнт (RFA) алгоритмы реализованы в EMAN 2, второй достижения 3D-реконструкция на основе винтовых параметров и обратно алгоритмов проекционных включены в IHRSR. Первый шаг использует программы, разработанные для выбора однородных наборов частиц для 3D реконструкции с одиночной SPA частиц (алгоритмов), на которые EMAN2 был специально разрабатываются и распространяются: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Этот шаг был адаптирован к данным Крио-ЭМ. Второй шаг достигается с помощью алгоритма IHRSR, который специально предназначен для данного типа винтовых агрегатов, полученных с рекомбинантных форм фактора VIII. Этот алгоритм был документально по разным странам через научной литературе 12.

  1. Выполнить анализ 2D изображения с EMAN2 научной обработки изображений пакет: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16, чтобы выбрать однородную частицу (винтовая сегмент) Наборы для спиральной реконструкции.
    1. Выберите Крио-EM микрофотографии с straigHT и хорошо организованной спиральные трубки с цифровым программным обеспечением камеры и средств визуализации.
    2. Обратить, нормализуют и фильтр для рентгеновских пикселей в e2workflow.py GUI, реконструкции одной частицы опции (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Импорт перевернутые, нормированные и рентгеновской пикселей отфильтрованные изображения в e2helixboxer.py GUI. Выберите фактора VIII-LNT спиральные трубки и сегмент в 256 х 256 пикселей (2.9 A / PIX) с 90% перекрытием с помощью: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Оцените расфокусировки от оригинальных снимках и применять контрастный передаточную функцию (CTF) коррекции (только фаза коррекции) в спиральных сегментов из тех же снимках с e2ctf.py опции включены в e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Создать начальные частицы (спиральные сегменты) устанавливает в e2workflow.py GUI - SPR вариант: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Рассчитать средние 2D класса с алгоритм e2refine2d.py применения опорного бесплатно K-среднее классификацию, чтобы выбрать однородных наборов данных с тем же LNT диаметра и степени винтовой порядке (рис. 2), после сценария: 'e2refine2d.py - ИТЭР = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - путь = r2d_001 - вход = INPUT.hdf - NCLs = 51 - simcmp = точка - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = точка - classraligncmp = фаза - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = средняя - normproj-classkeepsig ', изменение NCLs значение соответственно.
      1. Оцените начальные установленные в 150 классов »NCLs = 151" более 8 итераций с "classkeep = 0,8 'данные, а это означает, что частицы с менее 80% сходства с в среднем классе, исключаются из данного класса. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Слияние частиц из средних классовс ярко выраженным спиральным дифракции в e2display.py создать промежуточный набор данных.
      3. Классифицировать промежуточные данные, установленные в 50 классов »NCLs = 51", чтобы дифференцировать классы с таким же диаметром и степени упорядоченности.
      4. Слияние частиц из классов с таким же диаметром и степени упорядоченности e2display.py создать окончательный набор данных для трехмерной реконструкции: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Выполните спиральную реконструкции с Итерационное Винтовая реальном пространстве Реконструкция (IHRSR) алгоритма, как описано в Egelman 17, 18.
    1. Оцените рост, DZ (а) спирали фактора VIII-LNT из объединенного преобразования Фурье из частиц в конечном наборе данных.
    2. Определите азимутальный угол ΔΦ (º), запустив параллельные уточнения IHRSR с постоянным Δz, увеличивая ΔΦ от 576; до 60 ° с шагом 5 °.
    3. Запустите 100 последовательных IHRSR циклов для каждого конечного набора данных с безликой цилиндра в качестве начального объема и начальных винтовых параметров Δz и ΔΦ, как определено в 3.2.1. и 3.2.2.
    4. Осмотрите окончательные объемы сходимости винтовых параметров и переписки между класса средних с 2D классификации окончательного набора данных и проекций от окончательного реконструкции IHRSR.
    5. Накладывают симметрию в конечные 3D реконструкции, соответствующие асимметричным распределением единичной наблюдаемого в конечных объемах асимметричных 3D: 4-кратный для человеческого фактора VIII-LNT и 5-кратное для свиного фактора VIII-LNT. Запустите еще 100 циклов уточнения для формирования окончательного симметризованное 3D-реконструкция.
    6. Рассчитайте корреляционная кривая Фурье Shell для обоих томов, сначала отделяя соответствующие установленные в четные и нечетные данные: 'e2proc2d.py - сплит = 2 '. Затем запустите 100 IHRSR уточнения последовательных, как описано в пункте 3.2.3. Рассчитайте FSC из 3D томах, созданных из четных и нечетных наборов данных: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. Визуализация и сегмент объемы фактора VIII-LNT в UCSF химеры.
    1. Откройте окончательные объемы, начиная с шага 3.2.5. в UCSF Химеры и установить уровень контура до 0,005 в Инструменты> объем данных> параметр программы просмотра VOLUME.
    2. В Сервис> объем данных> СЕГМЕНТ MAP, выберите объем в закладке отображения сегмента и нажмите сегмента к сегменту громкости.
    3. Сегменты Группа, соответствующая одной элементарной ячейки, выбрав с CTRL + SHIFT и нажав группы.
    4. Цвет сегменты по элементарной ячейки и спирали с Действия> цветной вариант, чтобы подчеркнуть особенности строения.

4. Электронной томографии

  1. Отрицательно Витражи фактора VIII-LNT Подготовка образцов
      <литий> Подготовка образцов фактора VIII-LNT как для экспериментов Крио-ЭМ.
    1. Тлеющего разряда углерода покрытием 300-сетки медную сетку (со стороны углерода вверх) в смеси O 2 и H 2 газа в течение 10 сек при 50 Вт, как для Крио-ЭМ экспериментов.
    2. Нанесите каплю 2,5 мкл фактора VIII-LNT подвески с 6-нм коллоидных наночастиц золота в сетке, промокните излишки жидкости и отрицательно пятно с применением 5 мкл 1% уранилацетатом решение в течение 2 мин. Промокните лишнюю жидкость и воздух сухой сетку.
  2. Электронной томографии Сбор данных
    1. Трансфер сетку в одиночный держатель наклона.
    2. Передача держатель в электронном микроскопе.
    3. Сбор наклона серии автоматически с программным обеспечением SerialEM 19 на 2 ° с шагом в угловом диапазоне от -60 ° до 60 ° и записи изображений с ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения, -6 до -10 мкм расфокусировки и электронной дозе 150 - 170 элементctrons / A 2 · с на томограмме.
  3. Электронной томографии Реконструкция фактора VIII-LNT
    Примечание: Реконструировать наклонена серию pFVIII-LNT и hFVIII-LNT приобретенные в 4.2. с возможностью ETomo программного обеспечения УПМ следующем уроке: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Использование окно терминала, открыть томограмму в 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin томограмма на 4 с УПМ BINVOL команду, чтобы уменьшить размер томограммы.
    3. Выберите правильный угол, чтобы повернуть липидов нанотрубки вдоль оси Y. в Binned томограммы, используя команду УПМ ROTATEVOL.
    4. Поверните полный томограмму с помощью команды УПМ ROTATEVOL.
    5. Обрезка выбранного липидный нанотрубки ориентированы вдоль оси ординат с помощью команды CLIP ИЗМЕНИТЬ РАЗМЕР УПМ.
    6. Откройте обрезанной суб-томограмму с 3DMOD.
    7. Нажмите на томограмме визуализировать расположение молекул фактора VIII вместеломтики в Z-оси и вдоль оси ординат в объеме суб-томограммы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рекомбинантный человеческий и свиной фактора VIII были успешно организованы по спирали на отрицательно заряженные одного двухслойную LNT, напоминающие поверхности активированных тромбоцитов. Спиральная организация человеческого и свиного фактора VIII-LNT был последователен через собранных цифровых снимках (рис. 2). Контроль LNT и человека и свиньи фактора VIII-LNT спиральные трубки были отобраны и сегментирован с e2helixboxer.py GUI и начальных наборов данных, созданных с помощью e2work...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе методика представлена ​​различать два мембраносвязанных организаций высоко гомологичных белков: человеческий и свиной FVIII самоорганизующихся на липидных нанотрубок в условиях, встречающихся в организме человека.

В описанной процедуры, человеческий и свиной фактора VIII успешно организован по спирали на липидных нанотрубок, который является наиболее важным шагом. Следующим важнейшим шагом является сохранение образца в тонкой аморфного льда с помощью...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовый интерес и с ними можно связаться напрямую отношении любых процедур, опубликованных в этой рукописи.

Благодарности

Эта работа поддержана грантом Национального Ученый развития от American Heart Association: 10SDG3500034 и UTMB-NCB запуска средства для SSM. Авторы признают, средства Крио-EM и высокопроизводительные вычисления в Сили Центра структурной биологии UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), а также д-ра. Стив Ludtke и Эд Egelman за помощь в спиральных алгоритмов реконструкции 2D и 3D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
JEM2100 с LaB6JEOL Ltd.JEM-2100работал на напряжении 200 кВ
с программным обеспечением TEMCONJEOL Ltd.
Gatan626 КриодержательGatan, Inc.626.DHохлажден до -175 °°; C
с блоком термостатированияGatan, Inc.
ПЗС-камера Gatan 4K x 4KUS40004,096 x 4,096 пикселей при 15 μ м/пиксель физическое разрешение
плазменного очистителя Solarus Model 950Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IVFEI
Углеродное покрытие 300 меш 3 мм медная сеткаTed Pella01821плазменная очистка за 10 сек на высокой мощности
Quantifoil R2/2 300 мешЭлектронная микроскопия SciencesQ225-CR2Углеродное покрытие 300 меш Cu сетки с диаметром 2 мм отверстия 
Дигидрат уранилацетатаTed Pella194811% раствор, фильтрованный
керамид галактозилаAvanti Polar Lipids Inc.
Диолеоил-<эм>сн-глицерофосфо-L-серинAvanti Polar Lipids Inc.
программное обеспечение EM Digital MicrographGatan, Inc.http://www.gatan.com/DM/
EM программное обеспечение EMANбесплатно скачатьhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM программное обеспечение Паукскачать бесплатноhttp://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM программное обеспечение IHRSRскачать бесплатноПрограммы, доступные у Эдварда Х. Эгельмана http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)скачать бесплатноhttp://bio3d.colorado.edu/imod/  Программное обеспечение
EM (SerialEM)бесплатно скачатьftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimeraбесплатно скачатьhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
860546840035

Ссылки

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FVIII3D
Винтовая Организация свертывания крови фактора VIII на липидный нанотрубок
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.