Оценка Морфин-индуцированной гипералгезии и обезболивающее толерантности в мышей с использованием тепловых и механических Ноцицептивная Механизмы

Опиоидной индуцированных гипералгезии (OIH) и толерантность анальгетик ограничить клиническую эффективность опиатов в животных и человека ^1-3. Участие провоспалительных ^4,5 или про-ноцицептивных (анти-опиоидных) ^6,7 систем в настоящее время изучены гипотез. Выяснение механизмов, лежащих OIH и терпимости требуется совместное использование в естественных условиях и в подходах пробирке, используя соответствующие животные модели, экспериментальные протоколы и молекулярных инструментов.

Поведенческая фармакология является доминирующей парадигмой для мониторинга и количественной обезболивающее и повышенной болевой состояния в лабораторных животных (крыс, мышей). Применение болевые раздражители (термических, механических или химических) в удобной части тела (заднюю лапу, хвост) животного приводит к nocifensive вывода, которые могут быть легко забили.

Мы предлагаем здесь методологический подход для стимулирования, учета и количественного OIH итолерантность в мышей дикого типа, используя хвост-погружения и хвост испытания давлением. Процедура позволяет легко, чувствительный и воспроизводимый определение тепловых и механических ноцицептивных значений отклика у мышей. Как показано в протоколе видео, C57BL / 6 мышей испытывают значительные гипералгезии после хронического введения морфина и поддерживать этот течение нескольких дней. Оба тепловые и механические ноцицептивных значения значительно уменьшается, по сравнению с исходными измерений на наивных животных. Кроме того, наша Экспериментальная установка позволяет контролировать, в дополнение к разработке OIH, упадка ответ обезболивающее к морфину (терпимости). Представленные данные подтверждают мнение, что гипералгезии и терпимость может привлечь общие клеточные и молекулярные механизмы ^8,9, хотя это оспаривается в литературе ^1,10-12. Наконец, этот протокол может быть аналогичным образом адаптированы к генетически модифицированных мышей, чтобы оценить роль отдельных генов в модуляцииния боли. Она также обеспечивает модельную систему для оценки эффективности потенциальных терапевтических агентов для улучшения опиатного обезболивающее действие.

Все эксперименты проводились в строгом соответствии с европейскими принципами для ухода за лабораторными животными (Директива Европейского Совета Сообщества 86/609/ECC) и этических принципов для расследования экспериментальной боли в сознании животных ^13. Мужской C57BL6 / N Tac мышей (10 недель, 25 - 30 г) были размещены в институциональной объекта животного с персоналом по уходу, отвечающий эксплуатации объекта в соответствии с экологическими стандартами. Животных содержали в группах (максимум пять мышей в клетке) при 12-часовом / 12 ч цикле свет / темнота при постоянной температуре (21 ± 1 ° С) со свободным доступом к пище и воде. Все эксперименты проводились в то же время суток (10:00 утра до 4:00 вечера), используя когорту 16 мышей. Конкретные материалы и оборудование указаны в таблице материалов.

Процедура пятиступенчатый контролировать индуцированной морфином-гипералгезию и терпимости

Протоколразделены на пять последовательных шагов (AE) в течение периода 15 дней рисунке 1.

. 1 Мыши Обработка (стадия а; г-7 для D-5)

1. Ручка мышей и приучить их свободно войти в фиксатор. Это предварительный шаг уменьшает стресс - тем самым сводя к минимуму не перепутать их с стресс-индуцированной анальгезии - и позволяет животным быть приучены к следователю, обработки и манипуляции в фиксатор мыши. Каждая мышь мягко обрабатываются в течение 5 мин каждый день.

. 2 базальной Ноцицептивная отклика (Стадия B, г-4 до Д-1)

1. Измерьте хвост отмены задержки с помощью хвоста испытание погружением (ТТИ):
   1. Установите термостат на 48 ° С.
   2. Аккуратно ввести мышь в фиксатор. Опустите выступающий 2/3 конец его хвоста в водяной бане и начать хронометр.
   3. Остановить хронометр, как только мышь отзывает свой хвост от горячей воды и запишите задержки времени (в сек). В гоэ отсутствие болевой реакции, 25 сек отсечки используется для предотвращения повреждения тканей.
   4. Заменить мышь в клетку и не проверить следующую до конца ряда.
   5. Повторные измерения ноцицептивного ответа еще два раза, проводя измерения от животных в том же порядке. Ноцицептивной задержки ответа (сек) для каждой мыши определяется как среднее значение для трех последовательных определений.
2. Измерьте механические ответы, используя тест Хвост давления (TPT)
   1. Аккуратно ввести мышь в фиксатор и установить свой хвост под конической оконечности analgesimeter.
   2. Нажмите ножной переключатель не применять равномерно все большее давление на проксимальной части хвоста до первого ноцицептивной реакции (борется, скрип) происходит. В настоящее время животное реагирует, записи текущего силы (в граммах), которое вызывает болевого ответа. В отсутствие какой-либо реакции, 600 г пороговое значение используется, чтобы избежать твыдавать ущерб.
   3. Повторите эту меру на срединных и дистальных отделах хвосте той же мыши. Интервал не менее 30 сек наблюдается между мерами на данном мыши, чтобы избежать адаптации или предвзятости стресс. Заменить мышь в клетку и не проверки следующей животное до конца ряда (т.е. все мыши проверено). Ноцицептивный значение (грамм) для каждой мыши берется как среднее значение для трех измерений (т.е. проксимальных, срединных и дистальных отделах хвосте каждого животного).
3. Повторите ноцицептивная тестирования (все процедуры, описанные в шаге 2) в последующие дни, D-3 до Д-1.

. 3 Измерение аналгезию морфином (Шаг C; d0)

1. Определите наилучшее сочетание животных, что позволяет выбор из двух групп (N = 8 на группу) мышей с устойчивыми и сопоставимых средних ноцицептивных ценностей, в зависимости от того ноцицептивная модальности (ТТИ или ТРТ) считается. Это значение будет рассматриваться как базальнойноцицептивная ответ отсчета для будущих "засоленных" и "Морфий" групп.
2. Измеряют вес тела каждого животного.
3. Готовят раствор морфина (0,5 мг морфина на мл) в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) для подкожного введения (5 мг морфина на кг массы тела животного).
4. Измерьте болевого задержки отклика (взято как момент времени 0) для каждой мыши обоих «Салин» и групп «Морфий» в ТТИ (все шаги в рамках 2,1 выше). Затем измерьте ноцицепцию в ТРТ (все шаги под 2,2 выше).
5. Введите подкожно морфин (обычно 0,25 мл 0,5 мг / мл морфина раствора на 25 г веса мыши) и солевым раствором (0,25 мл на 25 г веса мыши) к морфину '»и« солевых »групп, соответственно.
6. Измерьте ноцицептивные значения на ТТИ и ТРТ (все процедуры, изложенные выше в разделе шаги 2.1 и 2.2, соответственно) за время цикла (на 30 мин интерваламдр.) для оценки морфин (5 мг / кг)-индуцированной анальгезии:
   1. Через 30 мин после инъекции измеряют ноцицептивной реакции (один) определения для каждой мыши в физиологическом растворе '' и 'групп' морфина, используя на входе турбины то TPT.
   2. Затем измерьте ноцицептивные значения ответов (Тит и ТРТ) у всех мышей в моменты времени (в час): 1-1.5-2-2.5-3 и 3,5 после инъекции.

4 Хронический Морфин Лечение - Морфин-индуцированной Гипералгезию. (Стадия D; d1 до d6)

1. В День: d1
   1. Измерьте ноцицептивные значения реагирования на ТТИ и ТРТ, как описано выше (шаги 2.1 и 2.2). Тщательно комментировать отмены задержки и ограничения давления для каждого животного.
   2. Подготовка свежий раствор морфина, как указано в п. 3.2.
   3. Введите подкожно морфин (5 мг / кг веса тела) для всей группы "Морфий" и физиологический раствор (0,25 мл на одно 25 г веса мыши) к группе "засоленных '. Пусть йе животные не успокоится, пока на следующий день.
2. На днях: d2, d3, d4, d5 и d6 повторить операции, описанные в соответствии с разделом 4.1

. 5 Доказательства анальгезирующего терпимости (Шаг E; d7)

1. Оцените морфина-индуцированной анальгезии в соответствии с временем, конечно, парадигмы уже подробно в разделе 3.

6. Сбор данных и Статистический анализ

1. Оценка значений отклика базальной ноцицептивных (стадия В)
   1. Рассчитать для каждого дня (над г-4 до Д-1 период) среднее ± значений SEM (N = 8) для базальных ноцицептивных реакций, как, предоставляемых из ТТИ и ТРТ в рамках «Салин» и групп «Морфий».
   2. Участок средние исходные ноцицептивные значения, в зависимости от времени (день) для обеих групп Рисунок 2.
2. Анализ Морфин Обезболивание Time-курс в Days d0 (стадия C) и d7 (Стадия Е)
   1. Рассчитать, в каждый момент времени после морфинаинъекций, среднее ± SEM значений (N = 8) для ноцицептивных реакций, как, предоставляемых из входе турбины (в сек) и ТПТ (в г) в каждой группе.
   2. Земля означает ноцицептивные значения реагирования как функция времени для «Салин» и групп «Морфий» в день 0 рис. 3 и 7 день Рисунок 5.
3. Развитие Морфин-индуцированной гипералгезии (стадии D)
   1. Рассчитать для каждого дня (за период лечения d0-d7) среднее ± значений SEM (N = 8) для базальных ноцицептивных значений реагирования, предоставляемых из ТТИ и ТРТ в рамках "физиологический раствор» и «морфин-лечение" групп.
   2. Участок средние исходные ноцицептивные значения реагирования как функцию времени (день) для "Соленая обращению" и "Морфий обращению» группы Рисунок 4.
4. Доказательства анальгезирующего терпимости (Шаги С и Е)
   1. Определите от морфина время блюд еXperiment осуществляется на d0 рисунке 3 значения времени (или диапазона времени), необходимое для морфина, чтобы вызвать максимальный ответ обезболивающее.
   2. Возьмите это значение (обычно 30 мин), а начало отсчета времени для оценки на d7 рисунке 5 ноцицепция базовое значение (физиологический раствор обращению группа) и фактической ответ анальгетик (морфин-обработанная группа) к острой морфина.
   3. Ноцицептивные значения, принимаемые в момент времени 30 мин от морфина экспериментов времени, конечно, выполненных в D0 и D7 для вводят физиологический раствор и морфин обработанных групп, представлены в виде гистограммы Рисунок 6.
   4. Статистика: Анализ данных с помощью одностороннего повторными измерениями ANOVA. Факторы изменения были лечение (между субъектами) и время (в пределах субъекта). Для проверки различий отдельно в каждой группе, повторные измерения ANOVA проводили. Сравнения между двумя группами были проведены с использованием непарного т-тест или парного критерия Стьюдента в случае необходимости.
5. Уровень существенности Р <0,05. Все Статистический анализ осуществляются с помощью Statview Software.

Оценка базальной Ноцицептивная значений простых мышей (стадия В)

ТИТ и ТРТ последовательно применяется ко всей когорты мышей (п = 16), обеспечивая средние ноцицептивные значения реагирования. Наилучшее сочетание животных разрешено апостериорной определение две группы (N = 8) мышей, называют физиологическим раствором и морфин, которые показывают подобные стабильные и базальные ноцицептивных значения Рисунок 2. Эквивалентность обеих группах действует независимо от ноцицептивной тест ( ТИТ: 2А; ТРТ: Рисунок 2B), который был выбран.

Время-курс для аналгезию морфином в день 0 (стадия C)

Морфин обезболивание оценивали после однократной инъекции (SC) морфина (5 мг / кг) в наивных мышей с использованием как ТТИ Рисунок 3A и TPT рисунке 3b. В обоих тестах, статистического анализа с той повторных измерений ANOVA reveaл, что существует значительное взаимодействие между лечением и время для ТТИ (F (7, 98) = 72, р <0,001) и ТРТ (F (7, 98) = 31, р <0,001). TIT и данные ТПТ анализ с использованием повторных измерений ANOVA показывает, что нет эффект физиологического раствора (F (7, 49) = 0,49, р> 0,05) и F (7, 49) = 1,85, р> 0,05 соответственно для входе турбины и TPT Тесты), в то время как морфин впрыска индуцирует сильный обезболивание у мышей (F (7, 49) = 92,46, р <0,001) и F (7, 49) = 34,37, р <0,001 соответственно для ТТИ и испытаний ТРТ). Максимальный анальгетический эффект морфина была достигнута после 30 мин в входе турбины и после 60 мин в TPT как по сравнению с инъецированных физиологическим раствором управления (р <0,001, непарного т-тест).

Повторные Морфин Администрации Вызывает Гипералгезию у мышей (Стадия D)

Базальные ноцицептивные значения были измерены каждый деньдо физиологического или морфина администрации (см. протокол). Как показано на рисунке 4, один раз в день морфина администрации за период 6 дней лечения вызвало значительное и прогрессирующее снижение теплового (F (7, 56) = 11,6, р <0,001, повторные меры ANOVA; Рисунок 4а) и механический (F ( 7,56) = 15,55, р <0,001, повторил меры ANOVA; Рисунок 4б) базальные ноцицептивные значения. Гипералгезию быстро развивается, поскольку это начало быть значительными в один день в входе турбины (р <0,01, непарный т-тест, по сравнению с инъецированных физиологическим раствором управления) и на 2-й день в TPT (р <0,05, непарный т-тест, по сравнению с физиологическим раствором впрыском управления).

Время-курс для Морфий Анальгезии на 7-й день, после хронической Морфин лечения (стадии Е)

На 7-й день мышей, получавших ежедневно морфина или инъекции физиологического раствора в течение 7-дневного периода (d0, чтобы d6) были рассмотрены в TИТ Рисунок 5А и TPT рисунке 5б сначала для их базальных ноцицептивных значений, а затем для их обезболивающего ответ на острый морфина (5 мг / кг, подкожно.). В соответствии с развитием гипералгезии, показанном на фиг.4, базальный ноцицептивной значение (время 0) мышей, которые были хронически получавших морфина была значительно ниже, чем у инъецированных физиологическим раствором контрольных мышей (Р <0,001, непарный т-тест). После острого морфина, ноцицептивной реакции хронического морфина группе, получавшей значительно увеличилась, но незначительно превышает базальный ноцицептивной значение контрольных мышей, инъецированных физиологическим раствором, измеренную при 30 мин в входе турбины и ТРТ (р <0,01 и р <0,05, непарный т Тест, соответственно) и при температуре 60 мин в входе турбины (р <0,05; непарный т-тест). С 2 ч после обработки морфина до конца эксперимента, ноцицептивных реакций не вернулась к более низкими значениями, чем у контрольных мышей (р<0,001, непарный т-тест).

Сравнение максимальных анальгетик Ответы мышей к морфину до (день 0) и после Хронический Морфин Лечение (День 7).

Ноцицептивные пороговые значения, представленные на рисунке 6 взяты из ТТИ (а) и ТПТ (B) выполняется через 30 мин после солевого раствора или инъекции морфина, как показано на фиг.3 (день 0) и 5 (7 день). Сильное падение морфина обезболивания наблюдался у мышей после хронического лечения морфина в течение 7 дней по сравнению с их первоначальной реакции обезболивания в день 0 в обоих ноцицептивных испытаний (р <0,001 в паре т-тест). Эти данные показывают, что толерантность же развиваться в болевых сверхчувствительных животных.

Рисунок 1. Пятиступенчатый пропроцедура для мониторинга индуцированной морфином-гипералгезию и терпимости. Протокол делится на пять последовательных шагов (АЭ) по общей продолжительностью 15 дней.

. Рисунок 2 Определение базальных ноцицептивных значений отклика (стадия б; D-4 до Д-1). Хвост погружения (ТТИ) (А) и хвост давления (TPT) (B) Тесты применяются к целой серии животных для того, чтобы оценить их базальные ноцицептивные значения. После этого две группы мышей (n = 8), называют «физиологический раствор" и группы "морфин", определены так, что они демонстрируют устойчивые и сравнимые средние значения ноцицептивных, независимо от ноцицептивной модальность, которая считается.

Рисунок 3. Время-курс для морфина обезболивания в день 0 (Шаг C) в ТТИ (А) и ТРТ (B). Базальная ноцицептивная значение отклика мышей определяли каждые 30 мин после одного морфина (5 мг / кг, подкожно. ) или солевые инъекции. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001, непарный т-тест, по сравнению с контрольной группой.

. Рисунок 4 Развитие гипералгезии после неоднократного введения морфина (Шаг D; d1 на d6). Базальная ноцицептивная значение мышей определялась ТТИ (А) и ТПТ (B) один раз в день перед морфина (5 мг / кг,подкожно.) или введение физиологического раствора. Данные выражены в виде средних значений ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001 по непарного т-теста по сравнению с контрольной группы вводят физиологический раствор.

Рисунок 5. Времени курс для морфина анальгезии в хронической морфина мышей на 7-й день (стадия е) в входе турбины (А) и ТПТ (B). Мышей, которые были обработаны с хронически морфина (черные точки) или физиологический раствор (белые треугольники) с 0 до 6 дня, получил на 7-й день одну инъекцию морфина (5 мг / кг, подкожно.) или физиологический, соответственно. Ноцицептивной реакции мышей определяли каждые 30 мин после морфина или инъекции физиологического раствора. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р & #60; 0,01 помощью непарного т-теста по сравнению с контрольной группы вводят физиологический раствор. Планки погрешностей, которые не превышают размер символов скрыты.

Рисунок 6. Сравнение максимальных обезболивающих ответов мышей к морфину (5 мг / кг, подкожно.) До (день 0) и после лечения хронических морфин (7 дней). Значения, указанные здесь, взяты из экспериментов, показанных на рисунке 3 и рисунке 5. Ноцицептивные значения были измерены с помощью ТИТ (А) и TPT (B) через 30 мин после морфина или инъекции физиологического раствора. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. *** Р <0,001 по парного критерия Стьюдента.

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.