Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter

Краткое содержание

Эта технология 3D-микрофлюидной печати печатает массивы клеток на погруженных поверхностях. Мы описываем, как массивы ячеек доставляются микрофлюидно в 3D-проточных ячейках на погруженные поверхности. Путем печати на погружных поверхностях были получены клеточные микрочипы, которые позволяют проводить скрининг лекарств и оценку цитотоксичности во множестве областей.

Аннотация

Печать клеток для микрочипов сопряжена со значительными проблемами, включая проблему поддержания физиологически релевантного фенотипа клеток после печати, плохую организацию и распределение желаемых клеток, а также невозможность доставки лекарств и/или питательных веществ в целевые области массива. Наша технология 3D-микрофлюидной печати обладает уникальной способностью запечатывать и печатать массивы клеток на погруженных поверхностях в автоматическом и мультиплексированном режиме. Конструкция микрофлюидной матрицы ячеек (MFCA) 3D Fluidics позволяет опускать наконечник печатающей головки в заполненный жидкостью колодец или чашку и прижимать его к поверхности для образования уплотнения. Мягкий силиконовый наконечник печатающей головки ведет себя как прокладка и способен образовывать обратимое уплотнение при надавливании или отступлении. Другие технологии печати ячеек, такие как штыревые или струйные принтеры, не могут печатать в погружных приложениях. Погружная поверхностная печать необходима для поддержания фенотипов клеток и мониторинга этих клеток на поверхности без нарушения характеристик поверхности материала. Путем печати на погружных поверхностях создаются клеточные микрочипы, которые позволяют проводить скрининг лекарств и оценку цитотоксичности во многих областях, включая рак, диабет, воспаление, инфекции и сердечно-сосудистые заболевания.

Введение

Последние достижения в области фармацевтической промышленности, привели к увеличению интереса к помощи через сотовую микрочипов в процессе обнаружения наркотиков для скрининга лекарственных средств и cytotoxicological анализа ^1,2,3. Развитие в пробирке высокой пропускной анализов и методов скрининга с использованием клеточных микрочипов будет способствовать быстрому и экономически эффективное развитие лекарств-кандидатов, а также продвижение фундаментальное понимание клетки ^1,4. Традиционный подход к скрининга с клетками использует обычные платформы хорошо пластины; Однако этот подход ограничен из-за высокой стоимости, ограниченной пропускной способности, и ограниченной способности для количественной информации о функции клеток ^1,5. Из-за этих ограничений, исследования в сотовой микрочипов является растущей для молекулярно-биологической характеристике, тканевой инженерии, и наркотики ^1,6. Преимущества сотовых микрочипов включают меньшее использование выборки, минимальные эффектысотовой фенотип неоднородности маскировки информации, а главное возможность автоматизировать анализы для более высокой пропускной приложений ^1,7,8.

Фармацевтическая промышленность в настоящее время использует высокой пропускной клеток на основе скрининговых исследований с 2D клеточный монослой культур для скрининга лекарственных средств в луночных микротитровальных ^9. Мультиплексирования клетки в лунках микротитровальных планшетах предлагает потенциал для более высокой пропускной способности с уникальными вариантов экспериментирования. Кроме того, существующие технологии для сотовых микрочипов позволяют клеткам, чтобы высушить который может резко изменить фенотип клеток в естественных условиях от ^10,11. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, был разработан MFCA и показан на рисунке 1. Конструкция MFCA 3D струйной позволяет наконечник печатающей головки на рисунке 1, чтобы быть снижены в ванну и сжатый к поверхности, чтобы сформировать уплотнение. Мягкий силиконовый наконечник печатающей головки ведет себя какпрокладка и образует обратимые уплотнение. Технология MFCA однозначно подходит для взаимодействия с подводных поверхностей, где требуется как для клеточных культур и тканей срезов систем, и трудно или невозможно с большинством других подходов. Штыри или струйная печать не будет работать, и 2D микрожидкостных устройств не подходят для осаждения или взаимодействия с большими массивами дискретных пятен. Кроме того, по миниатюризации и локализации эксперимент - сотовый микрочипов - MFCA преодолевает основные проблемы, связанные с высокой пропускной основе клеток скрининга.

CFM использует 3D каналов сети для цикла образцов малого объема жидкости более микроскопических местах пятно на поверхности ^12,13. Печатая с потоком, биомолекулы, клетки, и другие реагенты ведутся в жидкой среде на протяжении всего процесса печати, что позволяет печатать чувствительных биомолекул и клеток без воздействия воздуха, что препятствует текущие методов печати клеток. Кроме того, можно печатать непосредственно из сырого материала, такого как гибридомы или супернатантов при наличии механизм захвата на поверхности массива. Цель этой рукописи подробно объяснить погруженную печать двух типов клеток на поверхности.

Протокол

1. Клеточные культуры Подготовительного

1. Храните запасы NIH/3T3 клеток в жидком азоте до готовности к использованию.
2. Подготовка полной среде для клеток с использованием NIH/3T3 Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES буфера, 50 единиц / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.
3. Оттепель клетки в течение 2-3 мин в встряхивании на водяной бане при 37 ° С
4. Ресуспендируют клеток в 5 мл полной среды и центрифуге при 1500 мкг в течение 3 мин.
5. Удалить супернатант клеток, не нарушая клеточный осадок.
6. Ресуспендируют клеток в 5 мл СМИ и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
   1. Удалить 10 мкл суспензии клеток и поместить в 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
   2. Добавить 10 мкл трипанового синего к клеточной суспензии и перемешивают с кончиком пипетки.
   3. Пипетка 10 мкл окрашенных клеток в камере гемоцитометра.
   4. Граф клеток в гемоцитометре в 10 разувеличение.
      1. Подсчитайте живые клетки (маленькие, белые шарики) для 4 из 9 больших площадей. Только подсчет живые клетки, которые не появляются темно-синий с трипановым синим пятном.
      2. Вычислить среднее число клеток на большой площади, в результате чего количества клеток × 10 ⁴ клеток / мл в исходной суспензии клеток.
      3. Семенной клетки при плотности 1 x10 ⁵ клеток / мл в общей сложности 5 мл в каждом T25 колбу.
   5. Культуры клеток в диапазоне от 70% и 80% слияния Перед началом экспериментов. Обновить СМИ каждые 2-3 дня или по мере необходимости.

2. Печать Подготовка поверхности

1. Марк прямоугольник с маркером на дне ткани-культуры обработанных полистирола (TCTPS) 12 хорошо пластины размером печатающей головки (7 мм х 19 мм).
2. 50 мкл фетальной бычьей сыворотки в прямоугольной области и распространить его по всей области с наконечником.
3. Оставьте чашку Петрив стерильной биобезопасности капот O / N, чтобы место сыворотки до полного высыхания. Эти пластины должны быть готовы не более 2 дней перед использованием.

3. Подводная Печать

1. Промыть печатающую головку с дистиллированной водой.
   1. Заполните 60 мм чашки Петри с дистиллированной водой и док печатающую головку на поверхность.
   2. Поток дистиллированную воду через каждой из линий течение 2 мин при 150 мкл / мин с использованием пневматического насоса.
   3. Откажитесь от воды из чашки Петри и заполните его чистой водой.
   4. Перемещение печатающую головку вверх и вниз в воду 3 раза.
2. Доку печатающей головки центр над тем местом, сыворотки покрытием в предварительно подготовленный 12-луночный планшет.
3. Премьер печатающей головки с предварительно подогретые полной среды, 300 мкл на канал.
4. Печать приостановлена ​​клетки в концентрации 50000 клеток / мл на поверхность и 60 мкл / мин, 100 мкл на канале.
5. Поместите печатающую головку, влево пристыкован противповерхность, а коллектор в инкубаторе для клеточных культур установлен в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 2 часов.
6. После 2 ч инкубации удалить печатающую головку и поместите крышку на блюдо культуры. Время, в которое печатающая головка удалена считается момент времени 0 грн.

4. Стандартный Культура клеток

1. Добавить 1 мл предварительно нагретого массовой информации к одному из TCTPS 12-луночный планшет в сыворотке пятнами, полученного на стадии 2.
2. Принимать по 1 мл оставшейся клеточной суспензии со стадии 2 и пипетки в одну лунку 12-луночного TCTPS пластины. Это даст культуру, содержащую 50000 клеток в блюдо.
3. Поместите культуральный планшет в инкубаторе при 37 ° С в течение 2 часов.
4. После того, как 2 часа инкубации начала отсчета времени; для согласованности между печатной и высева образцов, это считается момент времени 0 грн.

5. Культура Визуализация

1. После 0, 2, 24 и 48 ч взять клетки от каждого из двух методов гвневписанной выше и изображений с использованием стандартного инвертированного микроскопа.
   1. Пятно клетки с помощью пропидий йодида, красный флуоресцентный пятно, что только включены в ядре мертвых клеток.
      1. Осторожно промыть клетки 3 раза 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора с кальцием и магнием (PBS + +) для удаления мусора.
      2. Добавьте 1 мл подогретого PBS + + для каждого сосуда для культивирования.
      3. Добавить 1 мкл пропидий йодид исходного раствора (1 мг / мл) в каждую культуральную судна.
      4. Инкубируйте клетки окрашивали иодидом пропидия при 37 ° С в течение 10 мин.
   2. Изображение клетки с помощью инвертированного микроскопа в 10 раз и 40-кратном увеличении.
2. Откажитесь от клетки в соответствующем контейнер для биологически опасных.

Результаты

В фибробластов линии NIH/3T3 клетки были напечатаны или высевали на затопленной поверхности. Клетки выращивали до плотности 5 × 10 ⁴ клеток на мл. Клетки высевали с использованием традиционных методов культивирования клеток. Клетки были напечатаны с использованием большого формата, печатающая головка двенадцать потока клеток, где каналы крупнее (~ 500 мкм), чем CFM, используемого для белков и других биомолекул. Клетки были напечатаны или высевают на сыворотке покрытием поверхности. Процесс печати показано на ...

Обсуждение

3D микрофлюидных технология печати, описанный здесь, однозначно способны microfluidically печати массивов клеток в жидкости заполнены хорошо, то есть погруженный поверхность. К печати на подводных поверхностей, сотовые микрочипы могут быть получены, что поддержание физиологически соответствующую клеточную фенотип клеток, а также возможность мультиплексирования клетки в нижней части одной скважины рисунке 4. Результаты данного исследования показывают, что microfluidically печать клеток приводит ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроспоттер непрерывного действия	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 клетки	ATCC	CRL-1658
Модифицированная среда Eagle от Dubbleco	Invitrogen	11965-092	Базовая среда для клеток
HEPES буфер	Invitrogen	15630-080	Добавка к клеточной среде (контроль pH)
Пируват натрия	Invitrogen	11360-070	Аддитивная клеточная среда
Пенициллин-стрептомицин	Invitrogen		Клеточная медиадобавка
Трипан синий	Invitrogen	15250-061	Окрашивание клеток для подсчета
Гемоцитометр	Fisher	267110	Клеточная камера для подсчета клеток
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Используется для проверки на клетках
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Используется для сбора изображений
Фосфатно-солевой буфер (с кальцием и магнием)	Invitrogen	14040-133	Промывание клеток перед пассированием и перед окрашиванием с помощью PI
TrypLE Express	Инвитроген	А12177-01	Используется для удаления клеток с поверхности