Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Краткое содержание

В этой статье описывается рабочего протокола к фото дендритных шипиков от нейронов гиппокампа в пробирке с использованием структурированного подсветки микроскопия (SIM). Супер-разрешение микроскопии с использованием SIM предоставляет разрешение изображения существенно за световой дифракционного предела во всех трех пространственных измерениях, позволяя визуализацию отдельных дендритных шипиков с улучшенной подробно.

Аннотация

Дендритные шипы выступы, возникшие в результате дендрита нейрона и представляют собой первичные постсинаптические целей возбуждающим сигналам в головном мозге. Технологические достижения определили эти структуры в качестве ключевых элементов в связи нейронов и синаптической пластичности. Количественный анализ позвоночника морфологии с использованием световой микроскопии остается существенной проблемой из-за технических ограничений, связанных с внутренней предела рефракции света. Дендритные шипы могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Однако измерение тонкие изменения в форме и размеру шипами трудно, потому что позвоночник размеры, отличные от длины, как правило, меньше, чем при обычном оптическом разрешении, установленного теоретического предела разрешения световой микроскопии в 200 нм.

Несколько современные методы суперразрешением были использованы для изображения клеточных структур, меньших 200 нм, в том числе дендритных шипиков. ТHESE методы основаны на классических операций дальнего поля и, следовательно, позволяют использовать существующие методы подготовки образца и имиджу за пределами поверхности образца. Описанный здесь является рабочим протокол применять суперразрешения структурированы освещения микроскопии (SIM) в визуализации дендритных шипиков в первичных гиппокампа культур нейронных. Возможные применения SIM пересекаются с конфокальной микроскопии. Тем не менее, две технологии представляют различные применения. SIM предлагает более высокую эффективную боковую разрешение, в то время как конфокальной микроскопии, в связи с использованием физического обскуры, приводит к усовершенствованию разрешения за счет удаления вне фокуса света. В этом протоколе, первичные нейроны культивировали на покровных стеклах с использованием стандартного протокола, трансфицированных ДНК-плазмиды, кодирующие флуоресцентные белки и отображаемого использованием SIM. Весь протокол, описанный здесь занимает около 2 недель, потому дендритных шипиков изображаются после 16-17 дней в пробирке, когдадендритных развития является оптимальным. После завершения протокола, дендритных шипиков может быть восстановлена ​​в 3D от серии SIM стеки использованием специализированного программного обеспечения.

Введение

Дендритных позвоночника небольшой выступ мембраны нейрона. Эта характеристика структура специализируется на обычно получают входной сигнал от одного синапса и представляет собой физическую площадь контакта между двумя нейронами. Большинство функционально зрелые дендритные шипики состоят из шарового наконечника, называемая головой и тонкой шеей, которая соединяет головку с дендритных вала. Тем не менее, шипы не являются статичными и активно двигаться и изменить свою морфологию непрерывно даже во взрослом мозге ^2. В течение 2-недельного периода времени, крысы первичных культурах гиппокампа нейронов, полученные с конца эмбриона или раннем послеродовом время разработки сложных дендритных беседки с многочисленными мембранных выступов, которые развиваются с начала filipodia чтобы шиповидных структур ^3. На основе этого динамического поведения и других характеристик, дендритных шипиков, как полагают, обеспечивают анатомическую субстрат для хранения памяти и синаптической ^4,5 передачи.

Учитывая йэ важная роль, что дендритные размер позвоночника и форма уже в синаптической функции, важно измерять их параметры точно. Шипы варьировать от около 200 до 2000 нанометров в длину и могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, позвоночника размеры, отличные от длины, как правило, ниже разрешение обычных оптических систем ", теоретически, установленного дифракции около 200 нанометров ^6. Эти разрешающей способности недостаточны для работы с изображениями тонкости, такие как ширина позвоночника шеи и головы. Большая работа была посвящена решить эту проблему и многие относительно новые методы микроскопии сверхвысокого разрешения предоставили существенный прогресс. В частности, можно добиться разрешения за пределы классического предела, не отказываясь любой свет выбросов с помощью боков структурированный освещения микроскопии (SIM) в широкоэкранном поля, не-конфокальной микроскопии ^7-10. Используя эту технику в сочетании с не-Lineaметоды микроскопии г, теоретически можно улучшить боковую разрешение оптического микроскопа неограниченным коэффициентом ^11. Тем не менее, в большинстве экспериментальных условиях, SIM позволяет превзойти предел разрешения в двух ^1. Другие супер-разрешением методы оптической микроскопии, такие как Вынужденное истощение выбросов (STED) микроскопии ¹² и фото-активации локализации микроскопии (PALM) ¹² были применены к визуализации дендритных шипиков. Локализация на основе методов, таких как PALM требуют очень большого количества необработанных изображений для достижения супер-разрешения и поэтому ограничены в скорости. С другой стороны, STED может достичь высокую скорость обработки изображений, хотя при относительно низких фотоотсчетов и небольших полей зрения, которые не могут быть в случае SIM ^13.

В этой статье цель заключается в предоставлении рабочего протокола для изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в пробирке , используя SIM-карту. Протокол состоит из двух различимых этапов: начальная одного состоящий из создания, развития, трансфекции и иммуногистохимии крысы первичных гиппокампа культур нейронных и поздней фазе, посвященной попробовать изображений.

Протокол

Все экспериментальные процедуры с участием животных были оптимизированы, чтобы уменьшить страдания животных и были одобрены Комиссией по экспериментов на животных, Университет Амстердама, DEC протокола # DED204 и DED250.

1. Покровные Подготовка

1. Сокращенный покровные до размера 15 мм х 15 мм с использованием карбида или алмаз палочки так, чтобы они соответствовали в лунки 12-луночного планшета.
2. Во время работы в вытяжном шкафу, начать покровное покрытие, полностью погружая покровные в концентрированном растворе азотной кислоты (70% вес / вес) в стеклянной таре. Для обеспечения равномерной сотрясения, то инкубировать в течение минимум 4 часов. Это можно повторно использовать концентрированный раствор азотной кислоты в течение приблизительно 2 раза, но он может потерять цвет при воздействии света.
3. Извлеките концентрированного раствора азотной кислоты и мыть покровные четыре раза в дистиллированной воде в течение 30 мин, осторожно встр хиванием после каждой промывки.
4. С осторожностью удалитьвода.
   Примечание: следующие три этапы выполняются в стерильной камере с ламинарным потоком.
5. Замочите покровные в 96% этанола. Удалить покровные из раствора этанола и дайте им высохнуть.
6. Пламя покровные и положить их в стеклянную емкость. Используйте тонкий пинцет для обработки покровные (Дюмон стиль no.5 Пинцет для примера).
7. Накройте емкость с алюминиевой фольгой и запекать в сухожаровой духовке в течение 12-16 часов при 180 ° С Запеченные покровные можно хранить при комнатной температуре в течение до 1 месяца, если покрыт плотно.

2. Покровные Покрытие

Процедура покровное покрытие способствует нейронов привязанность к поверхности стекла и дендритов ^14.

1. В стерильной ламинарным укрытием, использовать стерильные небольшие щипцы разместить отдельные покровные в единичных скважинах 12-луночный планшет.
2. Добавить 500 мкл поли-L-лизин раствора (или достаточное количество, чтобы погрузить покровные).
3. Оберните тон пластины в алюминиевую фольгу для предотвращения испарения и оставить его на ночь при комнатной температуре.
4. Перед началом культуры, аспирации поли-L-лизин раствор осторожно в стерильном ламинарном шкафу.
5. Вымойте каждую лунку с 1 мл стерильной воды в два раза, в то время не давая им высыхать.
6. Аспирируйте вода полностью, добавить 1 мл посева среду и не оставляют покровные в культуре ткани инкубаторе до готовности пластины клеток. Рекомендуется пластины клеток в течение 24 часов.

3. Удаление Мозги от E16-E19 Rat эмбрионов

1. Стерилизовать хирургических инструментов путем нагревания их в сухом стерилизатора на ночь или мыть их с 70% этанола. Тщательно высушите если этанол используется.
2. Подготовьте несколько 30 мм блюда с 1x HBSS буфера и держать их на льду.
3. Эвтаназии крысы плотины с внутрибрюшинной инъекцией Euthasol (160 мг / кг Euthasol в объеме ± 0,4 мл).
4. Проверьте отсутствие рефлексов.
5. Спрей живот плотины с 70% этанола.
6. Сделайте надрез вдоль живота и удалению матки.
7. Удалить эмбрионов из матки и поместите их в 100 мм диаметром Петри.
8. Удалите головы эмбрионов с большими ножницами и поместить головы в новом чашку Петри, содержащую холодный буфер 1x HBSS.
   Примечание: отсюда к шагу 7.1 процедура проводится в стерильных условиях в шкафу с ламинарным потоком.
9. Удерживая головы по бокам с большими щипцами.
10. С маленькими ножницами, сделать сагиттальной разрез в коже на верхней части головы, затем с боков очистить кожу вниз с большой щипцами.
11. Используйте тот же подход, что и в шаге 3.10, чтобы удалить череп. Сделать сагиттальный разрез, начиная с хвостового конца; мягко вскрытия черепной коробки, не повреждая ткани мозга. Сложите две половинки черепа в боковом направлении, разоблачающих мозг.
12. С тупым шпателем, выкопайте мозг и поместить его в свежей холодной 1x HBSS.

4. Рассечение гиппокампов

Это очень важно, что рассечение делается как можно быстрее в стерильных условиях, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Держите образцы холодного на льду.

1. Снимите и выбросьте мозжечок с прекрасными ножницами.
2. Отделите два полушария мозга, сделав сагиттальный разрез по средней линии.
3. Возьмите каждую полушарие и поместить как в новой 30 мм блюдо с пресной холодной 1x HBSS.
4. Место каждого полушария, так что височная стоит дно тарелки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отсюда, рекомендуется использовать рассекает микроскопом.
5. Придерживая средний мозг с помощью небольшого пинцета и удалить средний мозг с другой парой щипцов. Оставьте оставшуюся часть полушария нетронутыми, содержащий кору и гиппокамп.
6. Переверните ткани, так что гиппокамп в настоящее время стоит дно тарелки.
7. Придерживая полушарие в ркружева с тонким пинцетом. С помощью еще тонкий пинцет, тщательно и аккуратно удалить мозговых оболочек. Легче начать в обонятельной луковице. Будьте осторожны, чтобы не повредить гиппокамп.
8. Расположите ткань так, что гиппокамп теперь вверх. Гиппокамп теперь можно увидеть на его характерной С-образной структуры.
9. Используя тонкий пинцет, рассекать из гиппокамп. Соберите его в новом 30 мм блюдо с пресной холодной 1x HBSS.

5. Для диссоциации клеток и покрытия

1. Подсчитать общее количество гиппокампе, а затем вырезать их на мелкие кусочки.
2. Соберите части в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 3 мл 1x HBSS.
3. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант.
4. Добавить 6 мкл трипсина на гиппокампе.
5. Выдержите в течение макс 20 мин при 37 ° С Вихревой через 3 мин.
6. Вымойте два раза с 5 мл свежей холодной 1x ССРХ и отбросить супернатант.
7. После СЕКОй мыть, добавить 1,5 мл обшивки среде, предварительно нагревают до 37 ° С Сыворотка в электролитической среде инактивирует активности трипсина.
8. Медленно растирают 30x с огневой полировкой пипетки Пастера, пока все кусочки ткани не однородно рассеяны на отдельные клетки. Избегайте пузырьков.
9. Добавить 5 мл покрытие среднего предварительно нагревают до 37 ° С
10. Граф клеток с использованием голубой жизненно окрашивание трипанового.
11. Seed 50000 клеток на лунку 12-луночного планшета в 1 мл обшивки среду, подготовленные в разделе 2 (общий объем 2 мл).
12. Осторожно покачайте пластину, чтобы равномерно распределить клетки.
13. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО _2. После 2-3 дней, замените половина обшивки среде (0,5 мл) с культуральной среде, содержащей 10 мкМ ФУДР.
    Примечание: дендритных изображений позвоночника выполняется 16-17 дней после посева (16-17 дней в пробирке, DIV).

6. Гиппокампа крысы Первичная Нейрон Трансфекцию помощью Lipofectamine

На DIV 14-15 нейроны трансфецировали используя следующий протокол:

1. Подготовка плазмидной ДНК, экспрессирующих GFP и инкубационной среде (10 мл Neurobasal среде с 100 мкл глютамаксом).
2. Предварительно теплой инкубационный среднего до 37 ° С
3. Подготовьте смесь ДНК (Tube A). Для каждого покровное добавить 1 мкг ДНК в 100 мкл простой Neurobasal среды. Аккуратно перемешать.
4. Подготовка Lipofectamine смеси (Tube B). Для каждого покровное добавить 2 мкл Lipofectamine в 100 мкл простой Neurobasal среды. Аккуратно перемешать.
5. Добавить смесь Lipofectamine по каплям смеси ДНК.
6. Инкубировать в ламинарном боксе в течение 30 мин при комнатной температуре.
7. Добавьте 1 мл подогретого среду инкубации к пластине 1.
8. Магазин пластина 2 в течение 5 мин при 37 ° С, 5% СО _2.
9. Аккуратно добавить по каплям 200 мкл ДНК / Lipofectamine смешать в каждую лунку и инкубировать в течение 45 мин при 37 ° С, 5% СО _2.
10. С использование небольших щипцов поднять coversliпс, содержащий нейроны и ополосните их, опуская их в 3-см чашку, содержащую свежий теплый Neurobasal среды и переместить их к пластине 2.
11. Выдержите трансфектированных нейронов при 37 ° С, 5% СО ₂ в течение 48 часов.
12. Проверьте эффективность трансфекции через 24 часа после трансфекции.

7. Иммуноокрашивание и Монтаж гиппокампа крысы первичных нейронов

Для улучшения интенсивности флуоресценции в трансфицированных клеток, выполнить протокол Иммуноокрашивание улучшения обнаружения GFP 48 часа после трансфекции.

1. Подготовка 4% PFA и 0,05 М TBS.
2. Нагрейте 4% раствор PFA до 37 ° С.
3. Осторожно аспирации среды из лунок, содержащих покровные.
4. Добавить 500 мкл теплой 4% PFA тщательно, чтобы предотвратить повреждения дендритов.
5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
6. Промыть 1x HBSS 3 раза в течение 5 мин.
   Примечание: в этой точке образцы можно хранить до 3 недель при 4 ° Сили иммуноокрашивание можно начинать сразу.
7. Если образцы хранили, промывают 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
8. Блок с TBS-BSA (1%) раствору при комнатной температуре в течение 30 мин.
9. Промыть 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
10. Добавить первичное антитело разбавленный в инкубационном смеси.
11. Инкубируйте пластин в течение 1 часа при комнатной температуре.
12. Кроме того, инкубировать в течение ночи при 4 ° С при осторожном встряхивании.
13. Удалить первичное антитело.
14. Промыть 0,05 М TBS 3x течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: с этого момента, держите покровные защищенном от света месте.
15. Добавьте вторичной флуоресцентной-сопряженных антитела, разведенного в инкубационном смеси.
16. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
17. Снимите вторичного антитела.
18. Промыть 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
19. Промыть 1X ТБ 2 раза в течение 5 мин.
20. Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить его в покровных из скважин.
21. Высушите избытка ТБ с ткани и смонтировать CoVerslips использовать монтажный среду.
22. Печать с лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение монтажной среды.

8. Дендритных позвоночника изображений с помощью Структура подсветки микроскопия

Дендритные позвоночника изображений с использованием системы SIM описано в материалах имеет боковую разрешение (XY) значение приблизительно 85-110 нм и величину осевой (Z) разрешение между 200 - 250 нм, что обеспечивает коэффициент 2 раза улучшением по сравнению с разрешением широкого поля микроскопии.

ПРИМЕЧАНИЕ: дендритных позвоночника визуализации с использованием SIM делается обычно через 2 дня после шага 7,22, но можно было бы сделать до 3 недель позже, если образцы хранятся в темноте и в контролируемой температуре 22 - 23 ° С.

1. Включите 488 нм лазера на, ртутной лампы, контроллер этапе, контроллер пьезо, галогенной лампы для проходящего света и ПК и запуска программного обеспечения SIM в режиме "ANDOR для N-SIM".
2. Очистите 100x объект TIRFив 95% этанолом три раза, а при необходимости петролейным эфиром.
3. Используйте следующие настройки фильтра: 520 ЗО с 488 дихроичных.
4. Поместите каплю иммерсионного масла на цели. Убедитесь, что нет никаких пузырьки воздуха в нефтяной-капли. Перемещение цели вверх, пока масло не касается образца.
   Примечание: место крышку над стадии защиты образца от окружающего света и тусклый свет в комнате как можно больше.
5. Установка коррекции воротник целью до 37 ° С, 200 мкм, чтобы получить наилучшее симметрию PSF. Для того чтобы установить правильное положение воротник, первое место цель звонка на оптимальном номинального положения, а затем проверить в 100 нм образец шарик. По симметрии лучшую PSF, в слегка изменить положение воротник вокруг номинальной.
6. Для освещения используйте 3D-SIM решетку (3D 1layer 100X/1.49 всех длин волн). Для начала решетки место выравнивание выбранного решетки блока в SIM-осветителя, с 100X 1,49 цель на месте. Используйте 100 нм шарик образец, установленный в средствах массовой информации, с концентрацией, которые могут позволить изолировать 10-15 бусы для поля зрения (FOV). После установки объективную коррекции воротник в нужное положение, выберите освещение 3D-SIM и начать процедуру выравнивания программного обеспечения наведением. Он будет работать (5 фаз) х (1 направление) х (100 Z-плоскости) изображения, из которого он будет реконструировать поле зрения с бисером. После выбора одного шарика через соответствующий ROI, охватывающих весь шарик в том числе из фокуса размытым свет, программное обеспечение будет начать автоматическое PSF фитинга, и она будет регулировать положение дифракционной решетки в соответствии с результатом.
7. Для проверки правильности функционирования микроскопа, повторите решетки выравнивание каждые 2 недели, из-за возможного смещения, вызванного движений стола и / или температуры дрейфа. Кроме того, дополнительно проверьте интенсивность и стабильность лазерного соответствии с предложениями изготовителя.
8. Очистите поверхность образца с 95% ETHAnol три раза.
   Примечание: Для следующих шагов см. рисунок 3 для обзора панелей управления и правильных настроек в программном обеспечении SIM.
9. В программном обеспечении SIM, выберите Оптический Configuration глаз FITC и выберите пустой блок фильтра в турель 1 для визуального контроля с белым светом.
10. Установите скорость фокусировки и скорость таблице XY для "тонкой" пути.
11. Открыть затвор и быстро сосредоточиться на образце.
12. Закройте затвор и установить Z-координату к нулю.
13. Выберите зеленый фильтр в турель 1 для визуального контроля с помощью зеленого канала.
14. Установите интенсивность ртутной лампы в минимальное значение.
15. Переход к границе образца тщательно, убедившись, что цель не касается герметик.
16. Откройте затвор и быстро сканировать через образец с минимально возможной интенсивностью.
17. После столкновения достаточно яркий дендрит интереса и центрирования сегмент интересв поле зрения, закрыть затвор.
18. Установите программное обеспечение для оптического Configuration 3D-SIM 488 и настройками камеры для чтения из режима EM, получить 1 МГц 16-бит, время экспозиции 100 мс, мощность лазера 5% и Е.М. получить 200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что зеленый фильтр в турель 2 выбран и что башни 1 пуст.
19. Убедитесь, что решетка установлена ​​на 'Перемещение' и нажмите Живая чтобы посмотреть образец лазерным светом и через камеру.
20. Активируйте справочную таблицу.
21. Сосредоточьте интересующий объект при необходимости и сосредоточиться с фокусирующей скорости, установленной в тончайших.
    ПРИМЕЧАНИЕ: в режиме чтения из EM получить 1 МГц 16-бит, целевая интенсивность для хорошего SIM изображения между 30,000-45,000.
22. Быстро настроить параметры камеры, чтобы получить значение интенсивности между 30,000-45,000 в режиме чтения из EM получить 1 МГц 16-битный. Первоначально использовать:
    1. Мощность лазера: 0% - 20% (с образцов, полученных, как описано выше, 5% или 2,6 мВт достаточно)
    2. Экспозиция:50 мс-2 сек
    3. Режим Считывание: Е. М. получаете 1 МГц 16-бит
    4. Е.М. получите: 0-300
    5. Усиления преобразования: 1x - 5.1x
    6. Формат для Live: Нет биннинга
    7. Формат для Capture: Нет биннинга
       ПРИМЕЧАНИЕ: при таких настройках достигнуто 6,3% ± 1,3% отбеливания регулярно, в 10% предела приемлемого максимального отбеливания, которые могут существенно повлиять на качество изображения ^15.
23. Нажмите Stop, чтобы отключить Live View.
24. Настройте параметры стека 3D Z в последовательности панели Н.Д. к:
    1. Диапазон: 2 мкм
    2. Установить размер: 120 нм
    3. Z самолет
    4. Нажмите исходное положение
    5. Выберите оптической конфигурации 3D-SIM 488 в разделе Лямбда-
25. Выберите 3D-SIM в качестве режима сбора в площадку N-SIM.
26. Запустите приобретение Sequence ND и сохранить исходные данные.
27. Выберите оптической конфигурации глаз FITC снова и повторите шаги 8.15-8.27, пока весь образец не был в образ
28. 3D-реконструкция изображения: Данные, полученные в шаге 8,23 может быть либо реконструированы сразу же или позже. Начните с реконструкции Z стек с настройками по реконструкции умолчанию в режиме Реорганизация Slice или реконструировать Stack и при необходимости отрегулировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов, Z стеки должны быть сделаны с указанным размером шага и реконструированы в режиме Реорганизация Stack. Всегда проверяйте правильность восстановленного изображения, сравнивая его с необработанным данным или, предпочтительно, широким полем изображения. Параметры, которые можно отрегулировать для процесса восстановления являются контраст и подавление высокочастотного шума. Оба они влияют, как различные сырые изображения свойства учитываются в процессе реконструкции. В случае низкой глубины модуляции исходных данных, параметр контрастности играет важную роль. Если у пользователя есть наборы данных с низким соотношением сигнал-шум, то параметр подавления высокочастотных помех может влиять на качество реконструкции себеverely.
29. При визуализации в готовом, центра стадии XY и переместите цели все, вплоть до ее положения покоя.
30. Отключите образец и очистить как образец и объектив с 95% этанола.
31. Завершите работу программного обеспечения и ПК и выключите все другие устройства.
32. 3d реконструкция и позвоночника классификация получаемых изображений может осуществляться после конвертирования файлов в формате TIFF, как описано выше, используя программное обеспечение NeuronStudio (см. рисунок 4) ^16.
33. Используйте следующие параметры для реконструкции в программном обеспечении NeuronStudios:
    1. Объем: размеры воксельные: X: 0,03 мкм; Y: 0,03 мкм; Z: 0.120 мкм.
    2. Обнаружение Дендрит: Прикрепите соотношение: 1.3; Минимальная длина: 5 мкм; Дискретизация побед: 1; Realign переходов: Да.
    3. Позвоночник обнаружения: Минимальная высота: 0,2 мкм; Максимальная высота: 5,001 мкм; Максимальная ширина: 3 мкм; Минимальная короткими размер: 10 воксели; Минимальная без короткими размер: 5 голосELS.
    4. Позвоночник классификатора: соотношение шеи (отношение головы и шеи): 1.1; Тонкий отношение: 2.5; Размер Гриб: 0,35 мкм;
34. Параметры NeuronStudio, используемые для оказания: нейрита форму вершины: твердый затмение; Нейритов вершина цвет: по типу; Нейритов форма края: линия; Нейритов цвет края: один цвет; Позвоночник форму: твердый затмения; Позвоночник цвет: по типу.
    Примечание: После 3D-реконструкция это также можно задать объем визуализации. Пороговое значение по умолчанию был установлен на 20 с опцией 'Восстановить объем рендеринга "активный. Непрозрачность был установлен «Автоматическая Intensity" проверено. "Поверхность только 'и опции' использовании точки Подготовка к Rendering 'были также активны

Результаты

Описанный здесь представляет собой стандартизированный рабочий протокол для работы с изображениями дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа в пробирке с использованием SIM. Рабочий процесс протокол и его решающие этапы показаны на рисунке 1. Целом, протокол занимает около 2 недель экспериментальной работы, разделенные на первом этапе подготовки образца, в том числе культурой, развитием и трансфекции крысы первичных нейронов гиппокампа и иммуногистохимии, и второй этап образца ви...

Обсуждение

В этой статье рабочая протокол изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в лабораторных использованием SIM описывается. Основной метод гиппокампа нейрон культура как адаптация оригинального метода, описанного Kaech и Banker ^18. Основные отличия заключаются использование Neurobasal/B27 культуральной среды, что исключает требование астроглиальных культур фидерных и добавлением ингибитора митотической ФУДР на 3 день, что способствует выживаемость нейронов, пода...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тонкие щипцы
Большие щипцы
Тонкие ножницы
Большие ножницы
Тупой шпатель
Препарирующий микроскоп с подсветкой
Световой микроскоп
37 & Град; C водяная баня
Ламинарный проточный капюшон
Высокотемпературная сухая печь
Бунзеновская горелка
Инкубатор для клеточных культур (5% CO2, 37 &d; C)
Микроцентрифуга
Орбитальный шейкер
[header]
Микроскоп Nikon со структурированным освещением, состоящий из:
Исследовательский инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti с идеальной системой
Масляный объектив Nikon CFI Apo TIRF 100x (N.A. 1.49)
4 когерентных сапфировых лазера (длина волны возбуждения 458, 488, 514 и 561 нм)
SIM Illuminator
Сценический контроллер Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive пьезоконтроллер
Nikon Intensilight C-HGFIE ртутная лампа
SIM Микроскоп SIM Контроль
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC с Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon' s NiS Elements 6.14 SIM программный пакет
тип A погружное масло