Здесь мы опишем рабочий процесс для быстрого анализа и изучения коллекций флуоресцентной микроскопии изображений с помощью PhenoRipper, недавно разработанной анализа изображений платформу.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря быстрого прогресса в высокой пропускной микроскопии, количественные изображений на основе анализов по-прежнему представляют значительные трудности. В то время как множество специализированных инструментов анализа изображений доступны, большинство традиционных рабочие процессы анализа изображений на основе иметь крутых кривых обучения (для тонкой настройки параметров анализа) и привести к увеличению времени оборота между визуализации и анализа. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток в изображении, является серьезной проблемой в этом отношении.
Здесь мы представляем альтернативное, сотовый сегментации без рабочего процесса на основе PhenoRipper, в программной платформы с открытым исходным кодом, предназначенный для экспресс-анализа и исследования микроскопии изображений. Трубопровод, представленные здесь оптимизирован для иммунофлюоресценции микроскопии изображений клеточных культур и требует минимального вмешательства пользователя. В течение получаса, PhenoRipper может анализировать данные из типичного эксперимента 96-луночный и генерации профилей изображения. Пользователи могутзатем визуально исследовать свои данные, осуществлять контроль качества на их опыте, обеспечить реакцию на возмущения и проверить воспроизводимость повторах. Это облегчает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, которая имеет решающее значение в процессе оптимизации анализа. Этот протокол полезен не только как первый проход анализа для контроля качества, но также может быть использован в качестве раствора из конца в конец, особенно для скрининга. Рабочий процесс, описанный здесь масштабируется для больших объемов данных, таких, как генерируемых экранов высокой пропускной, и было показано, что группы экспериментальных условиях по фенотипу точно в широком диапазоне биологических систем. Интерфейс PhenoBrowser обеспечивает интуитивный рамки для изучения фенотипическую пространство и относятся изображения свойства биологических аннотации. Взятые вместе, протокол, описанный здесь снизит барьеры для принятия количественный анализ изображений на основе экранов.
Введение
За последние десять лет, быстрое развитие технологий визуализации дали много лабораторий способность выполнять с высокой пропускной микроскопии. Задача теперь переместился из одного из изображений к одному из анализа. Как мы можем охарактеризовать, сравнивать и исследовать поток сложных еще тонких фенотипов порожденных типичной экране изображения с высокой пропускной?
Ряд изображений анализ и информатика платформ дали пользователям искушенным Ящики для инструментов 1-3 для извлечения биологическую информацию от больших коллекций изображений. Тем не менее многие значительные препятствия остаются в анализе данных с картинки основ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка проб и обработки изображений
- Клеточные культуры
- Сплит культур в плановом порядке и поддерживать на 20-70% слияния. За один день до эксперимента клетки HeLa расти в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко, см. таблицу материалов) и с добавлением 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1x пенициллина / стрептомицина.
- В день эксперимента, сплит клетки растут в культуре (около 50% сливной).
- Промыть клетки с PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), подвергать его воздействию приблизительно 2 мл трипсина / EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение нескольких секунд. Аспирируйте избыток трипсина....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы проверили способность этого рабочего процесса группировать препаратов на основе механизма их действия. HeLa клетки высевали в 30 лунки 384-луночный планшет и окрашивают для ДНК / актина / α-тубулина. Конкретные первичные антитела, флуоресцентно меченные вторичные антитела, и другие флуоресцентные пятна, которые были использованы, перечислены в таблице материалов. Лунки обрабатывают 15 лекарств, относящихся к трем классам (механистических гистондеацетилазы ингибирования, ориентированных микротрубочек и ДНК повре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рабочий процесс, описанный здесь позволяет быстро и легко характеристику и сравнение микроскопии изображений. Мы впервые продемонстрировали, как это рабочий процесс может помочь оптимизации эксперимента, например, быстро обеспечения контроля качества на микроскопии изображений. Далее, мы показали свой потенциал для анализа скрининга данных с высокой пропускной: мы смогли группы препаратов на основе механизма их действия. Группировка препаратов был сопоставим с использованием найдено более сложные методы 6, хо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Адам Костера и всех других членов лабораториях Альтшулер и Ву для полезных советов и дискуссий. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставляет R01 GM085442 и CA133253 (ся), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), и Welch Foundation I-1619 (SJA), и я-1644 (LFW).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM, высокий уровень глюкозы | Invitrogen | 11965 | Высокий уровень глюкозы, маркер L-глутамина |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Окрашивание ДНК, разведение 1:2,000 5 мг/мл стоковый |
| маркер фаллоидин-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Конъюгированный фаллотоксин, разведение 1:200 |
| Первичное антитело &альфа;-тубулин | Sigma | T9026 | Первичный Ab, мышь моноклональный, разведение 1:200 |
| Вторичный Антиводы анти-Мышиный TRITC | Jackson | 115-025-166 | Конъюгированный вторичный АТ, 0,5 мг в 1 мл PBS + 1 мл глицерина |
| альдостерона | : 0,2 мкм; Используемая | ||
| М апицидина | : 20 мкм; M | ||
| колхицина | : 0,16 Используемая | ||
| кортизола | : 0,2 мкм; M | ||
| дексаметазона | : 0,2 мкм; M | ||
| доцетаксела | : 0,2 мкм; Используемая | ||
| M344 | : 20 мкм; M | ||
| MS-275 | используемая концентрация: 5 Используемая | ||
| нокодазола | : 0,3 мкм; M Используемая | ||
| преднизолона | : 0,2 мкм; Используемая | ||
| RU486 | : 0,2 мкм; Используемая | ||
| Scriptaid | : 70 Используемая | ||
| Таксола | : 0,3 мкм; M | ||
| трихостатина А | : 0,2 мкм; M | ||
| винорелбина | : 0,3 μ М |
Ссылки
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
