Опробование протеасомной деградации в бесклеточной системе у растений

Краткое содержание

Целевые деградации белков представляет собой важный механизм регулирования в отношении функции клеток. Это происходит с помощью консервативной убиквитин-протеасом пути, который придает полиубиквитиновый цепи с белком-мишенью, что тогда служить "теги", как молекулярные для 26S протеасомы. Здесь мы описываем простой и надежный бесклеточный анализ для протеасомной деградации белков.

Аннотация

Убиквитин-протеасомный путь для деградации белка стала одним из наиболее важных механизмов регулирования широкого спектра клеточных функций практически во всех эукариотических организмов. В частности, в растениях, протеасом система ubiquitin/26S (UPS) регулирует деградацию белков и вносит значительный вклад в развитие широкого диапазона процессов, в том числе иммунного ответа, развития и запрограммированной гибели клеток. Кроме того, все больше доказательств о том, что многочисленные возбудители растений, такие как Agrobacterium, эксплуатировать узлов ИБП для эффективного инфекции, подчеркивая важность ИБП в завод-патогенных взаимодействий.

Субстратной специфичности UPS достигается убиквитин-лигазы Е3, который действует согласованно с E1 и E2 лигазы признать и отметить специфические белковые молекулы, предназначенные для деградации путем присоединения к ним цепей молекул убиквитина. Один класс Е3 лигазы является SCF (Skp1 / CUllin / F-коробка белок) комплекс, который специфически распознает подложек ИБП и цели их для убиквитинирования через его компонента F-коробка белка. Чтобы исследовать потенциальную роль UPS в биологическом процессе интерес, важно разработать простой и надежный анализ для UPS-опосредованной деградации белков. Здесь мы описываем один такой анализ с помощью мобильного без системы растений. Этот анализ может быть адаптирована для изучения роли регулируемой деградации белков в различных клеточных процессов, с особым упором на F-коробка белок-субстрат взаимодействий.

Введение

Ubiquitin/26S протеасомный путь становится широко распространенной механизма контроля разнообразных биологических реакций, в том числе регуляции транскрипции, прогрессии клеточного цикла и передачи сигнала, рецептор понижающей регуляции или эндоцитоза, среди других обрабатывает ^1-4. В этом пути, целевой белок помечены убиквитин остатки, которые сначала присоединен через тиолэфирной связью с убиквитин-активирующий фермент Е1 и затем перемещаться до остатка аминокислоты цистеина убиквитин-сопряжение фермента Е2 и, наконец, E2 взаимодействует с убиквитин лигазы Е3 , в результате чего polyubiquitination белкового субстрата. В конечном счете, polyubiqu....

Протокол

1. Выражение белка

1. Выбор системы экспрессии
   Выберите систему, т. е. векторы и вектор способ доставки, лучше всего подходит для экспрессии белка интереса к конкретной модели организма / клетку. Следует отметить, что наш анализ требует экспрессии исследуемых белков в легко детектируемый количествах, которые лучше всего достигается путем временной трансформации большого количества клеток. В растениях, например, это лучше всего достигается с помощью бинарных плазмид в качестве векторов экспрессии и Agrobacterium как системы доставки.
2. Конструирование векторов двоичных выражений
   Клонирование последователь....

Результаты

На рисунке 1, адаптированный Зальцман и соавт. ^17, показывает репрезентативные эксперименты для обнаружения протеасомной деградации в бесклеточной системе. В частности, мы показываем, дестабилизацию завода оборонной тематике белка VIP1 со стороны F-коробки белка ВПЗ через пути SCF ^ВПЗ в N. benthamiana. Arabidopsis ВПЗ и HA-меткой VIP1 (HA-VIP1) белки экспрессируются временно, и HA-VIP1 содержание белка в экстрактах, экспрессирующих листьев анализируют с п.......

Обсуждение

Этот анализ основан на экспрессии исследуемых белков в тканях растений, таким образом, потенциал процесс деградации протеасомы, очевидно, происходит уже в живые ткани. Мы анализе белка дестабилизации, однако, только в экстрактах, со временем нулевой образец, выступающей в качестве начальной точки отсчета. Таким образом, мы определяем его как бесклеточной анализа.

Одним из важных аспектов для успеха этого анализа является правильный выбор вектора экспрессии, из которого проходят белок (белки).......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для анализа белка	Bio-Rad	500-0001
Коктейль ингибиторов протеиназы	Sigma-Aldrich	S8820
Мини-протеевая система	Bio-Rad	165-8000
Полусухая электротрансферная система вестерн-блоттинга SD	Bio-Rad	170-3940
Affinity Очищенный кролик Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Козий анти-кролик IgG пероксидаза конъюгат	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT нитроцеллюлозная передаточная мембрана	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western хемилюминесцентный подложка HRP	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
лактацистин	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL	Substrate Pierce	35055