Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Опробование протеасомной деградации в бесклеточной системе у растений

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51293

⸱

26 марта 2014 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, State University of New York

В этой статье

Краткое содержание

Целевые деградации белков представляет собой важный механизм регулирования в отношении функции клеток. Это происходит с помощью консервативной убиквитин-протеасом пути, который придает полиубиквитиновый цепи с белком-мишенью, что тогда служить "теги", как молекулярные для 26S протеасомы. Здесь мы описываем простой и надежный бесклеточный анализ для протеасомной деградации белков.

Аннотация

Убиквитин-протеасомный путь для деградации белка стала одним из наиболее важных механизмов регулирования широкого спектра клеточных функций практически во всех эукариотических организмов. В частности, в растениях, протеасом система ubiquitin/26S (UPS) регулирует деградацию белков и вносит значительный вклад в развитие широкого диапазона процессов, в том числе иммунного ответа, развития и запрограммированной гибели клеток. Кроме того, все больше доказательств о том, что многочисленные возбудители растений, такие как Agrobacterium, эксплуатировать узлов ИБП для эффективного инфекции, подчеркивая важность ИБП в завод-патогенных взаимодействий.

Субстратной специфичности UPS достигается убиквитин-лигазы Е3, который действует согласованно с E1 и E2 лигазы признать и отметить специфические белковые молекулы, предназначенные для деградации путем присоединения к ним цепей молекул убиквитина. Один класс Е3 лигазы является SCF (Skp1 / CUllin / F-коробка белок) комплекс, который специфически распознает подложек ИБП и цели их для убиквитинирования через его компонента F-коробка белка. Чтобы исследовать потенциальную роль UPS в биологическом процессе интерес, важно разработать простой и надежный анализ для UPS-опосредованной деградации белков. Здесь мы описываем один такой анализ с помощью мобильного без системы растений. Этот анализ может быть адаптирована для изучения роли регулируемой деградации белков в различных клеточных процессов, с особым упором на F-коробка белок-субстрат взаимодействий.

Введение

Ubiquitin/26S протеасомный путь становится широко распространенной механизма контроля разнообразных биологических реакций, в том числе регуляции транскрипции, прогрессии клеточного цикла и передачи сигнала, рецептор понижающей регуляции или эндоцитоза, среди других обрабатывает 1-4. В этом пути, целевой белок помечены убиквитин остатки, которые сначала присоединен через тиолэфирной связью с убиквитин-активирующий фермент Е1 и затем перемещаться до остатка аминокислоты цистеина убиквитин-сопряжение фермента Е2 и, наконец, E2 взаимодействует с убиквитин лигазы Е3 , в результате чего polyubiquitination белкового субстрата. В конечном счете, polyubiquitinated белки распознаются и разрушается в результате 26S протеасомы. В этом механизме, фермент Е3 задает подложку и действует в качестве ключевого компонента регулирующего протеасомы системы ubiquitin/26S (UPS). E3 лигазы может действовать независимо, такие, как лигазы доменных кольцо или как часть мультисубъединичных SCF (Skp1/Cullin/F-box белок) комплекс, например, лигаз доменных F-коробки. SCF-опосредованные пути протеасомной деградации участвуют в регуляции транскрипции, клеточного цикла, передаче сигналов 5-10 и многих других крупных клеточных функций.

Помимо этих важнейших ролей в регуляции клеточных процессов, UPS занимает центральное место в многих растений патогенных взаимодействий. Например, увеличение данные свидетельствуют о том, что несколько патогены растений, в том числе Agrobacterium tumefaciens, полагаться на хозяина ИБП для для облегчения процесса инфекции 11. Agrobacterium вызывает опухолевые наросты на растениях, которые представляют для естественных хозяев, и это также может преобразовывать широкий спектр других эукариот, от грибов 1,2 с клетками человека 12,13. За время своего инфекции, Agrobacterium экспортирует элемент ДНК (Т-ДНК) и несколько вирулентность (Vir белков) в клетку-хозяина 12-13. Один из этих белков VirF, первый белок F-коробка найденокоторый должен быть закодирован прокариотической генома 14. В рамках убиквитинлигазы комплекса SCF, VirF и его функциональной принимающей гомолога ВПЗ 15, облегчения Agrobacterium инфицирование через UPS-опосредованной деградации белков, которые, предположительно, облегчает декапсидацию вторжения бактерий Т-ДНК из его сопровождающих бактериальных и белков хозяина, VirE2 и VIP1 соответственно 16,17. Интересно, что многие белки F-коробка, в том числе VirF, по своей природе нестабильны из-за их собственной протеолиза, который, опосредованного активностью autoubiquitination 18,19 или другими E3 лигазы, для которого F-коробка белки могут служить субстратами 20-23.

При изучении биохимических деятельности F-коробка белков, других убиквитиновых лигаз, и / или их субстратов, было бы очень полезно использовать простой и надежный тест для протеасомной деградации. Здесь мы опишем один такой протокол для анализа стабильности белка в клетке-Свободная система. В этом анализе, стабильность подложки UPS анализируют в присутствии или в отсутствие одного из важнейших компонентов в пути деградации протеосомной, такой как белок F-бокса, в бесклеточной системе. Как правило, мы выразить испытаны белок (белки) в тканях растений, готовят бесклеточных экстрактов из этих тканей, и контролировать количество белка (ов), представляющие интерес помощью вестерн-блоттинга. Механизм ИБП зависит от деградации белков свидетельствует включения специфических ингибиторов протеасом и / или с использованием коэкспрессия доминантно-негативной форме SCF компонента, Каллин. В то время как мы иллюстрации этого анализа с использованием протеасомной деградации в Arabidopsis VIP1 17 белка белка F-бокса ВПЗ 15, он может быть использован для исследования устойчивости любых других протеасом субстратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выражение белка

  1. Выбор системы экспрессии
    Выберите систему, т. е. векторы и вектор способ доставки, лучше всего подходит для экспрессии белка интереса к конкретной модели организма / клетку. Следует отметить, что наш анализ требует экспрессии исследуемых белков в легко детектируемый количествах, которые лучше всего достигается путем временной трансформации большого количества клеток. В растениях, например, это лучше всего достигается с помощью бинарных плазмид в качестве векторов экспрессии и Agrobacterium как системы доставки.
  2. Конструирование векторов двоичных выражений
    Клонирование последовательности (ы) кодировани белка (ов), представляющие интерес в вектор по отдельности или в поступательном слияния с эпитопом тега экспрессии. Использование векторов подходит для выбранной системы экспрессии и стандартных процедур молекулярной биологии для клонирования гена. Для агробактериальной доставки генов, используют двоичные векторы и ввести их, также используя STANDAй протоколы, в Agrobacterium штамма, например, EHA105, для последующей прививки растительных тканей.
  3. Выбор видов растений
    Выберите видов растений, в котором будет выражена белок (ы) интерес. Следует отметить, что, в то время как любые виды растений, подверженных Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации может быть использован, наши видов растений выбора является Nicotiana benthamiana, который легко выращены, очень восприимчивы к Agrobacterium, и имеет большие листья, которые легко инокулированных.
  4. Рост растений
    Вырастить одно растение от 4 до 6 недель в кастрюлю с Pro-Mix BX в горшке (20 см х 20 см х 20 см) под экологически контролируемых условиях (например, камеры роста) длинного дня (то есть, 16 час из 130 -150 мкЕ м-2 с-1 свет при 23 ° С и 8 ч темно при 20 ° С) и 40-65% относительной влажности.
    1.5.2 Fertilize иногда с коммерчески доступных продуктов в соответствии с инструкциями изготовителя. Как только растение выращивается, выберителистья с размером 50 мм х 70 мм и более (эти измерения длины не включают черешок) для Agrobacterium прививки.
  5. Заражение Agrobacterium
    Grow штамм Agrobacterium, несущие конструкцию бинарного выражения испытаны белок (белки) с шага 1,3 течение ночи при 28 ° С в YEP среде (1% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl) с добавлением соответствующих антибиотиков (например, 100 мг / L стрептомицина и 10 мг / л рифампицина для pPZP-RSC2 векторы на основе 24-25).
    1.6.2 Центрифуга клетки, ресуспендировали в OD 600 = 0,5 в инфильтрации буфера [10 мМ MgCl 2, 10 мМ Mes (рН 5,6), 100 мкМ ацетосирингона], и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Проникнуть в культуру абаксиальной стороне листа, с помощью безыгольного шприца 1-мл; отметить, что листья инокулируют на месте, в то время как прикреплен к станции.
    1.6.3 После инфильтрации, вырастить растение в течение 72 ч под световом режиме 16 ч 130-150 &# 181; Электронная м-2 с-1 свет при 23 ° С / 8 ч темно при 20 ° С до сбора урожая.
  6. Применение ингибиторов протеасом
    Для подтверждают мнение, что тестируемый белок (белки) разлагается через протеасомной пути, использовать специфические ингибиторы протеасомной MG132 и лактацистина 28-29, который должен уменьшить или даже блокировать деградации. Через четыре часа перед сбором (см. Шаг 2,1), проникнуть в Agrobacterium-инокулируют листа области с 10 мкМ MG132 (EMD Millipore) или 10 мкМ лактацистина (Sigma-Aldrich) или макет лечения лист с соответствующими растворителями, т. е. 0,1% ДМСО или дистиллированную воду.

2. Подготовка бесклеточных экстрактов

  1. Лист уборки
    Урожай засеянных области листа, обычно ок. 200-400 мг сырой массы, и измельчить их в мелкий порошок в жидком азоте. Кроме того, шарик-бить тканей, с помощью любого борта для взбивания (например, БИОСПЕК) или зубной смеситель (например, TPC Дополнительно Технологии) непосредственно в буфере деградации (см. шаг 2.2).
  2. Добыча Белок
    Подготовка общей белкового экстракта путем размещения на первом ткани в 500 мкл буфера деградации [50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2, 5 мМ ДТТ, 5 мМ аденозин-5'-трифосфат, и ингибитор протеазы 1x коктейль (Sigma-Aldrich)]. Следует отметить, что коктейль ингибиторов протеаз поражает главным образом серин, цистеин, аспарагиновой и металлопротеазы и не мешает протеазы 26S. Уточнить выписку двумя последовательными центрифугирования при 12000 мкг в течение 5 мин.
  3. Реакция разложения белка
    Передача равных объемов экстрактов, обычно 20 мкл, в микроцентрифужные пробирки и инкубируют их при комнатной температуре для увеличения периода времени. Как правило, время выборки нулю, а 5, 10, 15, 20, и 30 мин времени. Остановить реакцию путем кипячения в SDS буфера гель-образец, и анализировать их с помощью вестерн-блоттинга.
jove_title "> 3. Обнаружение деградацию белков иммуноблоттингом

  1. Гель-электрофорез
    3.1.1 разрешать образцы белка с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и электропереноса разрешенные белков на нитроцеллюлозную мембрану в соответствии со стандартным протоколом 30.
    3.1.2 Определение концентрации белка с помощью метода Брэдфорда (Bio-Rad) и загрузить 50-80 мкг общего белка на полосу. Убедитесь, что все образцы загружаются в равной степени. Для управления загрузкой, сравнение интенсивности повсеместно видов белков, таких как предполагаемый RUBISCO больших сетей, которые мигрируют в качестве основного диапазона с относительной электрофоретической подвижности около 50 кДа, они могут быть обнаружены на Кумасси синим окрашенных гелей или на Ponceau S-или люминесцентные SYPRO Рубин окрашенных нитроцеллюлозных мембран.
  2. Блокирование
    Блок мембрану с 5% обезжиренным молоком в TBST (10 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Первичное антитело
    Развести основной эпитоп анти-антитела в 1% обезжиренным молоком в TBST до концентрации, рекомендованной изготовителем и инкубировать с блокированной мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  4. Полоскание
    Промыть мембрана промывают в TBST 20 мл в течение 15 мин один раз, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
  5. Вторичный антитела
    Развести вторичного антитела (например, анти-IgG кролика), конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) в 1% обезжиренным молоком в TBST, как рекомендовано изготовителем и инкубировать с мембраной в течение 1 ч при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
  6. Обнаружение
    Промыть мембрану снова, как описано на стадии 3.4. После окончательной промывки в TBST, визуализации белков, представляющих интерес с HRP хемилюминесцентного субстрата, обычно с использованием набора ECL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1, адаптированный Зальцман и соавт. 17, показывает репрезентативные эксперименты для обнаружения протеасомной деградации в бесклеточной системе. В частности, мы показываем, дестабилизацию завода оборонной тематике белка VIP1 со стороны F-коробки белка ВПЗ через пути SCF ВПЗ в N. benthamiana. Arabidopsis ВПЗ и HA-меткой VIP1 (HA-VIP1) белки экспрессируются временно, и HA-VIP1 содержание белка в экстрактах, экспрессирующих листьев анализируют с п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот анализ основан на экспрессии исследуемых белков в тканях растений, таким образом, потенциал процесс деградации протеасомы, очевидно, происходит уже в живые ткани. Мы анализе белка дестабилизации, однако, только в экстрактах, со временем нулевой образец, выступающей в качестве начальной точки отсчета. Таким образом, мы определяем его как бесклеточной анализа.

Одним из важных аспектов для успеха этого анализа является правильный выбор вектора экспрессии, из которого проходят белок (белки)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Работа приводит к этой публикации получил финансирование из программы Мари Кюри COFUND "U-Mobility", совместно финансируемый университета Малага и Евросоюз 7-й Рамочной программы (FP7/2007-2013) под GA-№ 246550. Работа в нашей лаборатории поддержана грантами NIH, USDA / NIFA, NSF, бард, и ЧФ в ВК

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для анализа белкаBio-Rad500-0001
Коктейль ингибиторов протеиназы Sigma-AldrichS8820
Мини-протеевая системаBio-Rad165-8000
Полусухая электротрансферная система вестерн-блоттинга SDBio-Rad170-3940
Affinity Очищенный кролик Anti-HaICL LabRHGT-45A-Z
Козий анти-кролик IgG пероксидаза конъюгатThermo Scientific31460
BioTrace, NT нитроцеллюлозная передаточная мембранаPall Corporation27377-000
Immobilon western хемилюминесцентный подложка HRPEMD MilliporeWBKL S0 050
MG132EMD Millipore474790-1MG
лактацистинSigma-AldrichL6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECLSubstrate Pierce35055

Ссылки

  1. Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
  2. Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
  3. Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
  4. Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
  5. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
  6. Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
  7. Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
  8. Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
  9. Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
  10. Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
  11. Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
  12. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  13. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
  14. Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
  15. Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
  16. Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
  17. Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
  18. Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
  19. Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
  20. Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
  21. Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
  22. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
  23. Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
  24. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  25. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  26. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  27. Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
  28. Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
  29. Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
  30. Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
  31. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
  32. Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Взаимодействие патогена и растенияубиквитин-протеасомная системасубстрат F-box белкавестерн-блот-анализэлектрофорез в ПААГ с SDSанализ стабильности белкаинокуляция Agrobacteriumингибитор протеасомы MG132
Опробование протеасомной деградации в бесклеточной системе у растений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.