Neural митоза предшественников является критическим параметром нейрогенеза. Большая часть нашего понимания нейронной митоза предшественников на основе анализа основного ткани. Онлайн изображений в эмбриональных срезах мозга является универсальный метод для оценки митоза с высоким временным и пространственным разрешением в контролируемой среде.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хотя непродолжительны, митоз является сложной и динамичной многоступенчатый процесс основополагающее значение для развития органов, включая мозг. В развивающихся коры головного мозга, нарушение митоза нейронных клеток-предшественников может вызвать дефекты в размере мозга и функции. Таким образом, существует острая необходимость в инструментах, чтобы понять механизмы нервной митоза предшественников. Развития коры у грызунов является выдающимся моделью для изучения этого процесса. Neural митоза предшественников обычно рассматриваются в фиксированных срезов головного мозга. Этот протокол будет подробно описать подход к живого изображения митоза в бывших естественных условиях эмбриональных срезах мозга. Мы опишем важные шаги для этой процедуры, которые включают в себя: добычу мозга, мозг вложение, Vibratome секционирования срезах мозга, окрашивание и культивирование срезов и покадровой обработки изображений. Затем мы продемонстрировать и подробно описывают, как выполнять анализ после приобретения митоза. Мы включаем Представитель Результаты фром этот анализ с использованием жизненно красителя Syto11 трансгенные мыши (гистонов H2B-EGFP и ЦентрИН-EGFP) и внутриутробное электропорации (mCherry-α-тубулина). Мы обсудим, как эта процедура может быть лучше оптимизирован и как он может быть изменен для изучения генетической регуляции митоза. Живая съемка митоза в срезах мозга является гибкий подход к оценке влияния возраста, анатомии, и генетической возмущения в контролируемой среде, и генерировать большое количество данных с высоким временным и пространственным разрешением. Поэтому этот протокол будет дополнять существующие инструменты для анализа нейронной митоза предшественников.
Введение
Общая цель этого протокола заключается в описании, как выполнять Живая съемка нервной митоза предшественников в эмбриональных срезах мозга. Использование живых изображений срезах мозга в культуре, этот протокол обеспечивает простой метод для анализа несколько аспектов митоза в нейронных клеток-предшественников в среде высоко аналогичной обстановке в естественных условиях. Он может быть применен к мозгу мутантных животных и / или мозгов, которые были изменены с внутриутробное электропорации) 1-5. Этот метод также идеально подходит для проверки эффекта фармакологических агентов на митоз нейронных предшественников, путем простого добавления ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка информации (рис. 1, стадия 1)
- Кусочек Культура Средний
- 25 мл ломтик культуральной среде достаточно, чтобы подготовить 5 стеклянным дном блюда с 2 ломтика на лунку.
- В 50 мл коническую трубку, добавить 250 мкл 100x N2 решения и 500 мкл 50x B27 раствора без витамина А. Добавить DMEM/F12 до объема 22,5 мл.
- Фильтр стерилизовать раствор, а затем добавить 1,25 мл инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки и 1,25 мл фетальной бычьей сыворотки.
- Инкубировать раствор в водяной бане при 37 ° С в течение всего срока подготовки ломтиками.
- Добавить факторы роста (FGF и EGF, конечную концентрацию 10
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успех этого анализа и наблюдение нескольких митотических клеток в течение одного живого изображений сессии в значительной степени зависит от обоих целостности и анатомической уровне среза, где приобретения сделаны. Как будет показано ниже, анатомическая уровень кусочком является важным фактором. 3А показывает ростро-каудально и медиально-латеральной места, где мы оказались наиболее успешными. Для дополнительного обсуждения этого вопроса см. Noctor 26. Целостность ломтик может варьироваться в .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Основным преимуществом протокола мы описали, что она обеспечивает динамический временное разрешение митоза нейронных клеток-предшественников. Как правило, анализы визуализировать митоза в развивающемся мозге выполняются с помощью иммунофлюоресценции секций фиксированных тканей. Но такой подход только обеспечивает моментальный снимок митоза в одной временной точке.
Есть несколько шагов, которые являются наиболее критическим для работы с изображениями митоза в срезах мозга: 1) Ломтики мозга до.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Авторы признают, финансирование из NINDS / NIH, R00-NS064197 и NINDS / NIH, R01NS083897 (как в DLS).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | для культуральной среды |
| 50X B27 без витамина А | Life technologies | 12587010 | для культуральной среды |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | для культуральной среды |
| Термоинактивированная лошадиная сыворотка | Sigma Aldrich | H1138-500ml | для культуральной среды |
| Термоинактивированная телячья сыворотка | Sigma Aldrich | F4135-500ML | для культуральной среды |
| FGF | R& D Системы | 3139-FB-025 | для культуральной среды |
| EGF | для культуральной среды | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | для препарирования эмбрионов |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | развести до 1 М (pH 7,4) |
| 2,5 М D-глюкоза | Sigma Aldrich | G8769 | для препарирования эмбрионов |
| 0,9 М NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | для вскрытия эмбрионов |
| Легкоплавкая агароза | Fisher | BP165-25 | для генерации срезов |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µ l аликвоты |
| 3 мг/мл коллаген тип I | Life technologies | A1048301 | для культивирования ломтиков |
| Чашка со стеклянным дном | MatTek | P35G-1,5-14-C | для культивирования ломтиков |
| Чашки | Петри для препарирования эмбрионов | ||
| Цифровой термометр | для измерения температуры агарозы | ||
| Шпатель | для Перенос мозгов | ||
| Кисть | альтернатива переносу мозгов | ||
| Вибратомный | Leica | VT1000s | для генерации срезов |
| Препарирующий микроскоп | рассечения эмбрионов | ||
| Микроскоп | Требуется конфокальный микроскоп, он должен быть оснащен инкубационной камерой |
Ссылки
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
