Мультиплекс анализы могут обеспечить полезной информацией для основных клеточных механизмов и ликвидации отходов реагентов и ненужных повторяющихся экспериментов. Мы описываем здесь многозальный каспазы-3/7 анализа активности, используя флуоресцентные и люминесцентные методы, основанные на, чтобы определить жизнеспособность клеток в гипоталамо модели в пробирке следующей окислительного заражения пальмитиновой кислоты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование каспазы мультиплексирования Пробирной для определения апоптоза в гипоталамуса Cell Model
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Возможность мультиплексирования анализов при исследовании сложных клеточных механизмов исключает необходимость в повторных экспериментах, обеспечивает внутренний контроль, и уменьшает отходы в затратах и реагентов. Здесь мы опишем оптимизацию многозальный анализа для оценки апоптоза после пальмитиновой кислоты (ПА) вызов в гипоталамо модели в пробирке, используя как флуоресцентные и люминесцентные основе анализов для измерения жизнеспособных количество клеток и каспазы-3/7 деятельность в 96-а Формат микротитрационный планшет. После PA вызов, жизнеспособные клетки определяется резазурин основе флуоресцентного анализа. Каспазы-3/7 активность была затем определена с использованием люминогенных подложку, DevD и нормализованы к числу клеток. Это мультиплексирование анализ является полезным методом для определения изменения в активности каспазы следующее апоптоза стимулом, таким как вызов насыщенной жирной кислоты. Насыщенной жирной кислоты PA может увеличить гипоталамуса окислительного стресса и апоптоза, что указывает на потенциальную ImportaNCE анализов, таких как описаны здесь, что в изучения связи между насыщенных жирных кислот и функции нейронов.
Введение
Диета, богатая насыщенными жирными кислотами, такими как пальмитиновая кислота (PA) были связаны с ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний и диабета 1, 2. Жирная диета также было показано увеличение окислительного стресса, апоптоз и дегенерации нейронов в гипоталамусе, важным регулятором аппетита и энергии расходов 3-7. Понимание механизма, через который экспозиции высоким содержанием жиров индуцирует гипоталамуса нарушение регуляции Таким образом, важно для развития фармакологических методов лечения ожирения. Тем не менее, клеточные механизмы, через которые диетического жира влияет функции н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Покрытие и обслуживание культуре клеток
- Теплый Игла в модификации Дульбекко (DMEM), питательные среды (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллина / стрептомицина / Неомицин) до 37 ° C.
- Получить запас замороженных A12 клеток от -80 ° С.
- Быстро разморозить клетки в 37 ° С водяной бане; После оттаивания мягко пипеток клетки перенести на 75 см 2 вентилируемой колбу культуры и добавить 10 мл культуральной среды.
- Выдержите колбу на ночь в 5% CO 2 инкубаторе при 37 ° С Аспирируйте СМИ после 24 часов и заменить свежей средой. Продолжить выращивания клеток до 70-80% слияния не будет получено (рост 2-3 дня).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол выше описывает результаты в мультиплексирования двух отдельных анализов, чтобы определить механизмы клеточной гибели. Рисунок 1 показывает обзор протокола для определения жизнеспособности клеток и каспазы-3/7 деятельность. Каспазы активность была значительно увеличена в клетках, зараженных ПА после 2 часов инкубации (рис. 2а и табл. 1). Потеря целостности клеточных мембран является морфологическое изменение, связанное с индукции апоптоза, который проявляется в клетках после 2 ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мультиплексный анализ является широко признанным методом, который был использован учеными во многих приложениях, таких как ПЦР, микрочипов иммунологического и других белковых основе методов обнаружения 13, 14. В последнее время мультиплексирования анализы становятся все более используется в в пробирке эксперименты пластинчатых основе и были утверждены в качестве точного метода оценки цитотоксичности и жизнеспособности 12. В приведенном выше протоколе, мы продемонстрировать эффективность му.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов раскрывать.
Благодарности
Работа, описанная здесь финансировалась американским Министерством по делам ветеранов биомедицинских лабораторных исследований и развития BX001686-1А1 и В. А. реабилитации исследований и разработок.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клеточная линия гипоталамуса взрослой мыши mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Фетальная бычья сыворотка | PAA Labs | A15-751 | |
| Пенициллин/Стрептомицин | Инвитроген | 15070-063 | |
| Пальмитиновая кислота | Сигма-Олдрич | P0500 | |
| Диметия сульфоксид | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Реагент жизнеспособности клеток | Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Системы анализа | Promega | G8091 | |
| 96 Вт Оптическая нижняя пластина, черный полистирол, обработанный клеточными культурами, с крышкой, стерильный | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Многорежимные микропланшетные | молекулярные устройства |
Ссылки
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
