Методическая статья

Использование этикеток без оптические биосенсоры для обнаружения модуляции калиевых каналов на G-белком рецепторов

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51307

⸱

10 февраля 2014 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

В этой статье

Краткое содержание

Методы оптический биосенсор может обнаружить изменения в массы вблизи плазматической мембраны в живых клетках и позволяют следовать клеточные ответы в обоих отдельных клеток и популяций клеток. Этот протокол будет описывать обнаружение модуляции калиевых каналов по G-белком рецепторов в неповрежденных клеток, использующих этот подход.

Аннотация

Ионные каналы управления электрических свойств нейронов и других типов клеток возбудимых путем выборочного позволяя ионам проходить через плазматическую мембрану 1. Для регулирования возбудимость нейронов, биофизические свойства ионных каналов модифицируются сигнальных белков и молекул, которые часто связываются с самих каналов, чтобы сформировать гетеромерный канал сложную 2,3. Традиционные анализы рассматривая взаимодействие между каналами и регуляторных белков требуют экзогенных метки, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели, обеспечивая при этом мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Оптические биосенсоры, такие как системы X-BODY Biosciences BIND сканера, использовать новый без наклеек технологии, резонансную длину волны решетку (RWG) оптические биосенсоры, чтобы обнаружить изменения в резонансной отраженный свет рядом с биосенсора. Этот анализ позволяет обнаруживать относительноеизменение массы в нижней части живой клетки прилипших к поверхности биосенсора результате лиганд индуцированных изменений в клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и изменений в белок-белковых взаимодействий вблизи плазматической мембраны. РРГ оптические биосенсоры были использованы для обнаружения изменений в массе вблизи плазматической мембране клеток после активации G-белком рецепторов (GPCR), рецепторных тирозинкиназ и других рецепторов клеточной поверхности. Индуцированной лигандом изменения в ионном канале-белковых взаимодействий также могут быть изучены при применении этого теста. В этой статье мы опишем экспериментальное процедуру, используемую для обнаружения модуляции тормозной-B натрия активированного калия (K Na) каналов по GPCRs.

Введение

Изучение живых клеток в их физиологически соответствующем контексте является ключевым для понимания биологические функции клеточных мишеней. Тем не менее, анализы рассматривая взаимодействие между каналами и нормативных цитоплазматических белков, таких как коиммунопреципитации подтверждено анализами, как правило, предоставляют мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Большинство текущих анализов на основе клеток измеряют специфический клеточный событие, например транслокации флуоресцентно меченого белка. Эти анализы требуют модификации белков, представляющих интерес, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели. Неинвазивная клеток, основанные анализы, которые не требуют манипуляции с системой, обеспечивают непрерывное измерение клеточной активности и позволяют исследования клеток в их наиболее физиологически отношение государства 4.

Оптические биосенсоры предназначены для производстваизмеримое изменение в характеристике света, который соединен с поверхности датчика. Оптические биосенсоры, которые используют неоднородных волн, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и резонансную длину волны решетку методы (РРГ), были в основном используется для обнаружения сходства и кинетики молекул, связывающихся с их биологических рецепторов, иммобилизованных на поверхности сенсора. Совсем недавно, коммерчески доступные РРГ биосенсоры были разработаны, чтобы позволить обнаруживать относительное изменение массы в нижней части клеток прикрепленных к поверхности сенсора с высоким пространственным разрешением (до 3,75 мкм / пиксель) 5. Эти биосенсоры может обнаружить изменения в массе около плазматической мембраны живых клеток, которые являются результатом стимуляции, таких как клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и сигнальных путей, вызываемых различными рецепторами клеточной поверхности, включая G-белком рецепторов (GPCR) 6 . РРГ биосенсоры обнаружить относительную чанGE в показателя преломления в зависимости от относительного изменения массы в пределах 150 нм биосенсора 7. Когда клетки высевают в биосенсора, это изменение в показателе преломления отражает изменение массы около плазматической мембраны клетки в результате изменений в клеточной присоединения к биосенсора. Этот протокол будет обсудить обнаружение канала-белковых взаимодействий с помощью РРГ биосенсоров.

Системы сбора данных РРГ состоят из нескольких компонентов. Поскольку X-BODY Biosciences BIND Сканер был использован для этих экспериментов, мы будем называть компонентами для этой конкретной системы, которая состоит из ридере, связанных биосенсоров, приобретения программного обеспечения BIND Scan и BIND Посмотреть анализа программного обеспечения 8. Фотонный кристалл биосенсоры, далее будет называться оптические биосенсоры, состоят из периодического расположения диэлектрика и материала в 2 или 3-х измерениях, что предотвращает распространение света в конкретныхдлины волн и направления. Фотонные кристаллические структуры основаны на явление, называемое аномалия Вуда. Впервые обнаружил Вудом в 1902 году, эти аномалии эффекты, наблюдаемые в спектре света, отраженного от оптических дифракционных решеток, где быстрые изменения в интенсивности отдельных порядков дифракции происходят в определенных узких частотных полос. В 1962 году Хессел и Олинера представил новую теорию аномалий Вуда, в котором конечный период решетки генерирует постоянный резонансной длины волны 9. В оптических биосенсоров, описанных здесь, Аномалии Вуда используются для производства биосенсор RWG, что при стимуляции с белым светом отражает лишь очень узкую полосу длин волн (как правило, между 850-855 нм).

Отдельные биосенсоры состоят из низко-преломления пластического материала с периодической структурой поверхности, покрытой тонким слоем с высоким содержанием двуокиси преломления диэлектрического материала титана (TiO 2). Когда Biosensили освещается с широким длин волн источника света, оптическая решетка фотонных кристаллов отражает узкий диапазон длин волн света, который измеряется с помощью спектрофотометра в BIND сканера. Пик интенсивности отраженных волн (Пиковая длина волны значение или PWV) рассчитывается из сигнала. PWV света изменяется при изменении показателя преломления в результате к увеличению или уменьшению массы в пределах близости (~ 150 нм) поверхности биосенсора. Оптические биосенсоры включены в стандартный общества по Биомолекулярных наук (SBS) 384-луночный микропланшет для анализов, используемых в этих экспериментах.

RWV биосенсоры используются для обнаружения изменений при добавлении экзогенных сигналов в живых клетках 10. Клетки культивировали непосредственно на поверхности биосенсора RWG и изменение в локальной показателя преломления контролируется при обработке конкретных стимулов. Направление изменения массы в биосенсора может бытьопределяют, потому что увеличение локального индекса рефракции результатов с увеличением массы вблизи биосенсора и измеряется как увеличение СПВ. Наоборот, уменьшение массы приводит к снижению СПВ. Изменение обнаруженного СПВ может быть результатом многочисленных клеточных событий, в том числе изменения в клеточной адгезии, белка набора / освобождения, эндоцитоза и утилизации, экзоцитоза, апоптоза и цитоскелетного перегруппировки. Например, анализ может быть обнаружения изменений в канал-белковых взаимодействий между калиевых каналов и других цитоплазматических или цитоскелета компонентов. Событие, однако, должен происходить в пределах зоны обнаружения ~ 150 нм вблизи биосенсора, а в случае прикрепленным клетки, вблизи плазматической мембране. Приобретение клеточных ответов выполняется с помощью программного обеспечения BIND сканирования и представление изображения каждого из 384 скважин в SBS пластины генерируется. Эта система имеет разрешение до 3,75 мкм / пиксель, что позволяет обнаруживать события в одиночных камерах, имогут быть использованы либо с клеточных линий (например, НЕК293 клетках СНО или) или с более физиологически соответствующих первичных клеток. Анализ изображений с BIND View программного обеспечения позволяет обнаружить клеточные реакции как в личности и популяций клеток. Как биосенсоры были включены в стандартный SBS 384-луночных микропланшет, система легко адаптируется к высокопроизводительного скрининга (HTS).

Резонанс-волны решетки оптические биосенсоры ранее использовались для обнаружения изменений в массе около плазматической мембране клеток после активации GPCRs 11. Наша лаборатория клонировал двух калиевые каналы натрия активированного (К Na) отними-B и Slick 12. Активность обоих слабину-B и гладкий каналов было показано, что очень сильно зависит от прямой активации протеинкиназы С (РКС) 13. Активация Gα д белком рецепторов, таких как М1 мускаринового рецептора и mGluR1 метаботропного глутаматного Receptor, мощно регулирует деятельность канала через активацию ПКС. Эти каналы K Na способствовать нейронов адаптации во время длительного стимуляции и регулируют точность сроков действия потенциалов 14. Натяжные каналы, как известно, взаимодействовать с различными цитоплазматических сигнальных молекул, в том числе FMRP, хрупкой Х умственной отсталости белка 15,16. Мутации в Слэк результате в нескольких Перенастройка частичного изъятия младенчества (MMPSI), раннего натиска формы эпилепсии в результате чего задержка развития 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток (адаптировано из Флеминг и Качмарек 18)

  1. Культура клеток в соответствующих средствах массовой информации для более чем 2, но менее 10 проходов перед использованием в данном анализе. Нетрансфицированных клетках НЕК-293 и клетках НЕК-293, стабильно экспрессирующие белок крыс Slack-B выращивают в модифицированной Дульбекко среде половина Дульбекко и одной половины Лейбовица L-15 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и антибиотики. 500 мкг / мл генетицина (G418) добавляют в клетках НЕК-293, стабильно экспрессирующих Slack-B, чтобы выбрать для экспрессии Slack канала. Прохождение клеток на 70-90% слияния диссоциацией от блюд с 0,25% раствором трипсин-ЭДТА.

2. Внеклеточного матрикса (ECM) Покрытие из TiO 2 384-а оптический биосенсор Тарелка с фибронектина и овальбумином

  1. Подготовка фибронектин ECM смеси и блокирующего раствора овальбумина
    1. Подготовьте рабочего раствора fibronectв в фосфатном буферном растворе (PBS) с конечной концентрацией 5 мкг / мл фибронектина в 20,0 мл PBS. Из 1,0 мг / мл маточного концентрацией, добавьте 100 мкл в 20,0 мл PBS в течение 200-кратного разведения. Рабочий раствор фибронектина можно аликвоты и хранили при -20 ° С после приготовления.
    2. Подготовьте 5% исходного раствора термоинактивированной овальбумином в стерильной воде. Развести овальбумина в стерильной культуре ткани марки воды для раствора 5%-и тепла инактивации в течение 30 мин при 60 ° С Раствор охлаждают до комнатной температуры и стерильный фильтр раствора. Алиготе 5%-ный раствор овальбумина и хранить при 4 ° С.
    3. Подготовьте 2% рабочий раствор яичного белка путем разбавления 5% исходного раствора в PBS. Например, можно добавить 12,0 мл 5% раствора овальбумина в 18,0 мл PBS для конечного объема 30,0 мл.
  2. 384-а оптический биосенсор пластины покрытие
    1. Увлажнения TiO 2 пластины с 20,0 мкл / лункуиз тканевой культуры стерильным класс воды в течение 15 мин. Следующие шаги должны быть выполнены с пипетки 16-канала.
    2. Вымойте пластины 1x 50,0 мкл PBS на лунку.
    3. Добавить 20,0 мкл рабочего раствора фибронектина в каждую лунку и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре, чтобы создать ECM.
    4. Вымойте пластины 1x 50,0 мкл PBS на лунку.
    5. Добавить 40,0 мкл рабочего раствора овальбумина в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 4 ° С, чтобы блокировать пластины.
    6. Промыть 3 раза пластины с 50,0 мкл PBS на лунку. ECM покрытием пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 48 часов.

3. Посев клеток на 384-а биосенсоров плиты оптического

  1. Удаление питательной среды из клеток и добавить трипсин, чтобы сместить клетки от пластины. Сбора клеток и центрифугируют при 1000 х г в течение 1 мин. Удалите трипсина СМИ и Ресуспендируют клеток в питательной среде.
  2. Использование гемоцитометра или автоматизированнаясчетчик клеток, определить концентрацию клеток.
  3. Чтобы свести к минимуму эффектов испарения во время инкубации, будут использованы 50,0 мкл питательной среды на лунку. Клетки должны быть разбавлены, чтобы достичь желаемого количества клеток на лунку в объеме 50,0 мкл ростовой среды. Для этих экспериментов 1000 клеток / лунку высевали на биосенсора.
  4. Разрешить отобранные клетки инкубировать в течение ночи в среде роста при 37 ° С в атмосфере воздуха / 5% CO 2.

4. Подготовка биосенсора и соединение пластин для анализа RWG оптический биосенсор

  1. Снять пластину из инкубатора и удалить питательной среды из клеток. Вымойте клетки 1x с Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS). Добавить 25,0 мкл HBSS в каждую лунку.
  2. Поместите биосенсора пластину на BIND сканера и позволяют клеткам, чтобы уравновесить до комнатной температуры в течение 1-2 часов.
  3. Подготовьте отдельный соединение пластины, из которых лиганды интерес будет объявлениеDED в биосенсора пластины во время анализа. Для этих анализов, 25,0 мкл раствора, содержащего соединения добавляли в каждую лунку на пластине для биосенсора общим объемом 50,0 мкл. Таким образом, соединения в растворе были подготовлены в 2 раза желаемой конечной концентрации.

5. Выполнять исследования RWG оптический биосенсор

  1. Выполните измерение базовой с системой Scanner для скважин A1-P12 (половина 384-луночный планшет SBS), используя максимальное разрешение 3,75 мкм / пиксель для центрального 1,5 мм каждой лунки с помощью программного обеспечения BIND сканирования. Это базовое сканирование займет приблизительно 30 мин.
  2. Добавить 25,0 мкл растворах соединений в каждую лунку для скважин A1-P12.
  3. Возьмите базовое измерение скважин A13-P24.
  4. Добавить 25,0 мкл растворах соединений в каждую лунку для скважин A13-P24.
  5. Возьмите сообщение соединение сложения измерение для скважин A1-P12, и повторить для скважин A13-P24.

6.нализ из пробирной данных с BIND View

  1. Откройте данные BIND тест для базового измерения в Windows, и нажмите кнопку "Сетка Editor", чтобы позволить выбор соты. Программное обеспечение будет рассчитать показатели, представляющие интерес, определенные пользователем.
  2. Откройте "Плагины", которые включают в "Cell Finder" и функцию "Baseliner". Установка параметров в "Cell" Finder так что клетки отличаются от фоне биосенсора.
  3. Экспорт клеток карту файл, который содержит данные "Сотовый Finder" для измерения базовой.
  4. Повторите шаги 6.1-6.2 для почтовых данных соединение сложения.
  5. Откройте "Baseliner" плагин и импортировать клеток карту из измерения базовой. Программное обеспечение будет вычислить сдвиг в СПВ между фоном и после сложных данных.
  6. Выбрать "Δ Cell означать" для вывода средней сдвига в PWV для клеток. Затем данные могут быть экспортированы в Microsoft Ехсэль для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Slack-B стабильно трансфицированные НЕК-293 клеток и контролируют нетрансфицированные HEK-293 клетки высевали на 1000 клеток / лунку на 384-луночный, ECM покрытием РРГ биосенсора пластин. Изображения из центральной 1,5 мм 2 биосенсора были записаны с разрешением 3,75 мкм / пиксель (рис. 1). Градиента плотности карты массы были получены до и 30 мин после соединение дополнение вместе с программным обеспечением BIND Scan. BIND Посмотреть программного обеспечения был использован для определения с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Z премьер (Z ') фактором является общей статистический метод для количественного определения качества высокой пропускной скрининге 20, и потому, что скрининг агонистов GPCR в этом анализе произошло в SBS совместимый анализе 384-а, обеспечивает превосходное мера надежности и обоснованности данного анализа 21. Значение Az '1 указывает на теоретически идеальную анализа с бесконечным числом точек данных с несуществующим стандартных отклонений. Значение AZ 'составляет от 0,5-1 считается отли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Стивен М. Shamah является сотрудником X-BODY Biosciences.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Янъян Янь в лаборатории доктора Фреда Сигуорта в Йельском университете за щедрое пожертвование НЕК293, стабильно экспрессирующих белок крысы Слэк-B. Кроме того, авторы благодарны доктору Сигуорта для крио-электронной микроскопии гомологии модели Слэк отображается в видео внедрения. Это исследование было поддержано NIH грантов DH067517 и NS073943 к LKK

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM, High GlucoseLife Technologies11965-092
Leibovitz's L-15 MediumLife Technologies11415-064
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Life Technologies15140-122
Генетин G-418 СульфатAmerican BioanalyticalAB05057
HBSSLife Technologies14025-092
Фибронектин из плазмы крови человекаSigma-AldrichF0895
Альбумин из белка куриного яйцаSigma-AldrichA5378
DPBSLife Technologies14190-144
Фазовый гемоцитометр Hausser Bright-Line FisherScientific02-671-6
Карбамоилхолина хлоридSigma-AldrichC4382
SFLLR-NH2 трифторацетатная сольSigma-AldrichS8701
Finnpipette (5-50 &; l)Thermo Scientific4662090
BINDX-BODY BiosciencesN/A
384-луночные пластины с покрытием TiO2X-BODY BiosciencesTiO-96-CM
Система сканирования

Ссылки

  1. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
  2. Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
  3. Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
  4. Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
  5. Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
  6. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
  7. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
  8. Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
  9. Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
  10. Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
  11. Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
  12. Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
  13. Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
  14. Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
  15. Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
  16. Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
  17. Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
  18. Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
  19. Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
  20. Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  21. Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GPCRSlack BHEK 293

Похожие статьи