Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

Краткое содержание

Эта статья содержит подробные методологии использования трехмерных (3D) анализах для количественного вторжение клеток рака молочной железы. В частности, мы обсудим процедуры, необходимые для настройки таких анализах количественную и анализа данных, а также методы для изучения потерю целостности мембраны, которая возникает, когда клетки вторгнуться.

Аннотация

В настоящее время хорошо известно, что клеточной и тканевой микросреда являются важнейшими регуляторами, влияющие инициации и прогрессии опухоли. Кроме того, внеклеточного матрикса (ECM) было продемонстрировано, чтобы быть критическим регулятором поведения клеток в культуре и гомеостаза в естественных условиях. Нынешний подход культивирования клеток на двумерной (2D), пластиковые поверхности приводит к нарушению и потери сложных взаимодействий между клетками и их микросреды. Благодаря использованию трехмерной (3D) Культура анализов, условия для клеток микроокружения взаимодействия устанавливаются напоминающие микросреды в естественных условиях. В данной статье приводится подробная методика расти клетки рака молочной железы в матрице 3D базальной мембраны белка, иллюстрирующих потенциал 3D культуры в оценке вторжения клеток в окружающую среду. Кроме того, мы обсудим, как эти 3D анализы есть потенциал, чтобы изучить потерю Molec сигнализацииULES которые регулируют эпителиальных морфологию по иммуноокрашивания процедуры. Эти исследования помогают определить важные механистические детали в процессы, регулирующие вторжение, необходимых для распространения рака молочной железы.

Введение

Миграция и вторжение в индивидуальных или коллективных клеток два клейма рака, и требуется для метастазирования раковых клеток ^1-4. Способность раковых клеток, чтобы инициировать метастазов зависит от их способности к миграции и вторжение в соседнюю ткань с использованием invadopodia деградировать базальную мембрану клеток. Invadopodia динамические актина богатых деградации матрица выступы, которые позволяют деградацию внеклеточного матрикса через выпуск матричных разрушающих протеаз ^5. Вторжение Раковая клетка включает деградацию матрицы с последующим миграции раковых клеток, и это сопровождается реорганизацией трехмерное (3D) матрицы среды ^2. Таким образом, чтобы проникнуть через матрицу, клетка должна преобразовывать свою форму и взаимодействуют с внеклеточным матриксом (ECM) ^2.

Поддержание целостности ткани молочной железы зависит от плотно Controlleд архитектура ткани с клеточной ECM и межклеточной адгезии переходы влиять на экспрессию генов и разрушение эпителиальной полярности может привести к возникновению рака ^6-10. Тем не менее, большинство в пробирке миграции и вторжения анализы, такие как Transwell камерных анализов или рана царапин анализов являются двумерные (2D) и, следовательно, они пренебрегают сложные взаимодействия между клетками и их прилегающей среды ^3,6,8,11-14. Значительные морфологические и функциональные различны в том числе изменений в клеточной морфологии, клеточной дифференцировки, клетка-матрикс спаек и паттернов экспрессии генов были обнаружены путем культивирования клеток в 3D культур, которые обычно отсутствуют в 2D анализах ^2,6,8,11. Таким образом, использует 3D-анализов значительно полезным в обобщал более физиологичным в естественных состоянии, что приводит к лучшему переводе новаторских находок в фундаментальных исследованиях в клинику ^6-10. Тем не менее, следует отметить,, Несмотря на многие преимущества, полученных с использованием 3D-культур, эта модель не может учесть все сложности в естественных условиях опухоли микроокружения, что включает в себя различные типы клеток. Тем не менее, можно включить стромальных клеток в 3D-модели (например, фибробласты, лейкоциты и макрофаги) для изучения влияния опухолевых-стромальных взаимодействий на адгезии раковых клеток и вторжения ^15-17.

Грудные эпителиальные клетки в культуре расти наиболее эффективно, когда ECM белки, такие как ламинин и коллагена присутствуют. При этом известно, имеющийся в продаже матрица смесь была получена из Engelbreth-Холм-Рой (EHS) мышиного опухоли и известен как Матригель базальной мембраны матрицы ^2,8. Ряд методов были созданы расти эпителиальные клетки как 3D колоний в базальной мембраны матрицы ^2,8. В подвале матричная модель 3D мембрана является эффективным для установления и злокачественной и не злокачественной клетки грудирост, напоминающее то, что происходит в окружающей среде в естественных ^18,19. MCF10A клетки доброкачественных эпителиальные клетки молочной железы. При выращивании в базальной мембраны матрицы, эти клетки демонстрируют в естественных черт нормальных клеток молочной железы и пройти под контролем пролиферации клеток, клеток поляризацию, и апоптоз о создании просвета пространство ^8,12,20. Кроме того, внешний вид ядрах клеток MCF10A клеток, образующих ацинусов в 3D культур больше напоминают те из эпителиальных клеток молочной железы в ткани, чем те, культивировали в монослое ^21. Исследования Бисселл и коллегами были первыми, чтобы показать, что злокачественные клетки молочной железы могут быть дифференцированы от доброкачественных клеток молочной железы при выращивании в ламинином богатых окрестностях, так как злокачественные клетки отображать высоко дезорганизованы фенотип, увеличение распространения, снижение клетки к клеточной адгезии, повышенная экспрессия мезенхимальных маркеров и увеличение числа инвазивного структуру, образованную ^3,6,22.

Аномалии окружающей среды клеток может влиять на формирование опухоли ^20. Способ 3D культура может быть использована для эффективной изучить взаимодействие, которое происходит между опухолевыми клетками и окружающей их среды и определить, как влияет на экспрессию белка такой ^14,20,21,23 связи. В данной статье приводится подробная методика расти MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в 3D культур для анализа инвазивность и учиться потерю эпителиального морфологии с использованием эпителиальных маркеров ламинин, компонент клеточной базальной мембраны ^{18,19,24, 25.} Подробное описание процедур обеспечивают возможность точно и воспроизводимо количественно звездчатый (инвазивный) формирование структуры на любой инвазивной раковой клетки и не ограничивая этим клеточных линий рака молочной железы общий (например, MDA-MB-231, HS578T, MCF-7 или T47D ). Таким образом, этот анализ может служить в качестве платформы для оценки того, как экспрессии белка в клетках или лечение с про-или анти-инвазивные соединения регулируют внеклеточный деградации матрицы, по одной или нескольких клеток.

Протокол

1. Трехмерная Культура клеток рака молочной железы в базальной мембраны Matrix (анкеровки Техника)

1. Обращение Матригель базальной мембраны матрица: Оттепель на льду в течение ночи при 4 ° С. Базальная мембрана матрица является жидкостью при низкой температуре, но затвердевает при комнатной температуре. Держите базальной мембраны матрицу на льду (фиг.1А-B).
2. Накройте конфокальной № 1 со стеклянным дном блюдо с 50 мкл базальной мембраны матрицы с помощью распространения матрицу с помощью кончика Р-200 Pipetman в виде спирали (рис. 1в). Соблюдайте осторожность при распространении базальной мембраны матрицу, чтобы избежать образования воздушных пузырей. Кроме того, во избежание распространения матрицу к близко к границам стеклянным дном блюдо, чтобы предотвратить образование мениска. Если неопытный обработка базальная мембрана матрица, то предварительно охлажденный блюдо, P-200 Pipetman и пипетки может быть на льду (в качестве альтернативы оставили на ночь в холодильнике при 4 ° С). На этом этапе предложениядополнительное время для распространения базальной мембраны матрицу до затвердевания. Место блюдо (адреса) в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% СО ₂₎ в течение не менее 30 мин для того, чтобы базальной мембраны матрицу, чтобы укрепить (рис. 1D).
3. В то время как матрица претерпевает затвердевание, Trypsinize 70-80% сливной 100-мм пластины клеток. Как только клетки начали подъема от пластины, ресуспендируют их в 10 мл среды RPMI 1640 среде, содержащей 10% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы инактивировать трипсин (рис. 1E). Затем передавать ресуспендировали клетки в 15 мл коническую пробирку (рис. 1F).
4. Вращайте клетки (присутствующие в конической трубе) при 100 мкг в течение 3 мин в специальной культуры клеток центрифуги (рис. 1G-H).
5. В то время как клетки центрифугировали время, аликвоту 50 мкл матрицы в 1 мл микроцентрифужных трубки (примечание: каждый стеклянным дном тарелки выделяется один микроцентрифужную пробирку, следовательно, еслиэксперимент требуется 3 блюда, то из этого следует, что 3 микроцентрифужные пробирки необходимы, а), а затем поместить трубку на льду (рис. 1В).
6. Аспирируйте среды из коническую пробирку со стадии 1.4, в то время как оставляя осадок ненарушенных (рис. 1I). Ресуспендируют клеток (которые были центрифугировали) в 1 мл FBS-дополненной RPMI среде (рис. 1j).
7. После того, как клетки подсчитывают с помощью гемоцитометра (рис. 1K) или встречный аликвоты клеток частиц 2,5 х 10 ⁴ клеток в микроцентрифужных трубки и довершение всего с помощью соответствующего средства массовой информации так, чтобы получить общий объем 50 мкл (рис. 1 л).
8. Смешайте клетки от стадии 1.7 (25000 клеток в 50 мкл) с матрицей, содержащей микроцентрифужных трубки с шагом 1,5 в соотношении 1:1; Конечный объем будет 100 мкл (Рисунок 1M).
9. Осторожно пластина 100 мкл матрицы: смесь клеток из стадии на 1,8 секolidified базальной мембраны матрица покрытием блюдо с шага 1.2 (рис. 1 н). Это позволяет клетки для встраивания в базальной мембраны матрицы.
10. Передача блюдо (адреса) в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% CO ₂₎ и позволяют матрица: смесь клеток затвердеть в течение по крайней мере 30 мин.
11. После того, как матрица: смесь клеток затвердевает, добавить 2 мл FBS-дополненных RPMI СМИ к блюду (Рисунок 1O) и возьмите блюдо назад инкубатор, где она будет храниться в течение оставшейся части эксперимента (рис. 1P).
12. Изменение носитель каждый день в течение 5 дней (или в соответствии с требуется для анализа; продолжительность анализа на MDA-MB-231 клеток 5 дней в длину).
13. Использование светового микроскопа, принять дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения колоний MDA-MB-231, взвешенных в базальной мембраны матрицы (рис. 3А). Image 20 репрезентативных районов в 10 раз Цель раз в деньв течение пяти дней, чтобы определить колонии морфогенез (рис. 3C).
14. Анализ изображений слепо определить колонии клеток образование звездчатый (рис. 3б). Колония считается севрюга, если один или более выступов от сфероида клеток воспринимаются. Чтобы определить процент инвазивных колоний звездчатых, разделить количество звездчатых колоний общего числа клеточных колоний на получившемся изображении, а затем усреднить звездчатые колонии процент 20 изображений на каждый день.

Рисунок 1. Трехмерная культуру MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в базальной мембраны матрицы (техника посадки). А.Б.) Схема экспериментальной установки (выполненного в вытяжной шкаф). C) а из стеклянным дном блюдо с покрытием50 мкл базальной мембраны матрицы. D) Dish (а) помещают в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% CO _2), чтобы разрешить матрицу затвердеть в течение по крайней мере 30 мин обрабатывали трипсином. E) клеток. F ) Клетки ресуспендировали в 15 мл коническую пробирку. GH) Клетки (присутствующие в коническую пробирку) центрифугировали при 100 х г в течение 3 мин в центрифуге тканевой культуры. I) Клеточный осадок J). Клетки (которые были центрифугировали) ресуспендировали в 1 мл FBS-дополненной RPMI среде. K) Клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра. L) 2,5 х 10 ⁴ клеток на аликвоты в центрифужную пробирку и завершенный с помощью соответствующего средства массовой информации так, чтобы получить общий объем 50 мкл. M ) Смешать клетки от стадии 1.7 (25000 клеток в 50 мкл) с матрицей, содержащей микроцентрифужных трубки с шагом 1,5 в соотношении 1:1; Конечный объем будет 100 μ.; Л N) Осторожно пластина 100 мкл матрицы: смесь клеток из стадии 8 на затвердевшего матрицы покрытием блюдо из стадии 1,2 O) После того, как матрица: смесь клеток затвердевает, добавляют 2 мл FBS-дополненной RPMI массовой информации. блюдо. Р) Место блюдо в инкубаторе, где она будет храниться в течение оставшейся части эксперимента.

2. Экспертиза морфогенный Особенности 3D культур с иммунофлуоресценции

1. Установка фразу лоток, холодный растворе с фосфатным буфером (PBS), 20% ацетон: 80% метанол (фиксирующий раствор), а 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA; блокирующий раствор) (рис. 2а) до вынимая блюдо (адреса) из инкубатора.
2. Место блюдо (адреса) на лед в трее и аспирации СМИ, затем промыть 3 раза с 2 мл холодной PBS (рис. 2В).
3. После того, как последний PBS мытья отсасывают, добавить 2 мл 20% ацетона: 80% раствор метанола в блюдо (ов) (рис. 2С (рис. 2D).
4. После 20 мин фиксации прекращается, довести посуду обратно при комнатной температуре, аспирации фиксатор, а затем промыть 3 раза с PBS. После того, как окончательный мытья PBS отсасывают, добавить 2 мл 3% БСА к блюду (ов), чтобы заблокировать в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре (рис. 2Е).
5. В течение периода блокировки подготовки разведений первичного (ламинина V 1:100) и вторичными антителами (при соответствующем разведении), растворенного в 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) блокирующем буфере. Обратите внимание, что 400-500 мкл на 'БСА + первичное антитело »решения должны быть добавлены непосредственно на матрице: смесь клеток.
6. После 30 мин блокировки истек, добавьте первичных антител и инкубируют в течение по крайней мере 1 часа при комнатной температуре (рис. 2F). Обратите внимание, что PBS моет не следует проводить после 30 мин blockinг период.
7. После завершения этапа 2.6, удалите 'БСА + первичное антитело "решение, и промыть 3 раза с PBS.
8. Добавьте вторичного антитела, растворенного в 3% БСА (в соответствующем разведении) непосредственно на матрице: смесь клеток, покрыть посуду и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре (рис. 2G).
9. Снимите 'BSA + вторичное антитело "решение, и промыть 3 раза с PBS.
10. Добавить 2 мл Hoechst 33258 (1:10000), растворенных в PBS для окрашивания ядер, и инкубировать 5 мин при алюминиевой фольги (или накройте непрозрачным контейнер, чтобы ограничить фотообесцвечивания) (рис. 2H).
11. После 5 мин инкубации с Hoechst 33258t истекли, мыть посуду (а) 5x с PBS.
12. Добавить монтажную среду непосредственно на матрице: смесь клеток в конфокальной блюдо и накройте покровным стеклом тщательно, чтобы предотвратить вызывая каких-либо нарушений целостности колоний в базальной мембраны Матрих: смесь клеток (рис. 2I).
13. Разрешить блюдо (ы) для высыхания на ночь (или 24 ч) при комнатной температуре (рис. 2i). После высыхания, блюдо (а) может храниться при -20 ° С, но настоятельно рекомендуется, что они должны быть отображены как можно быстрее.
14. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими длинами волн лазерного антител, используемых (фиг. 3D-E).

Рисунок 2. Экспертиза 3D культур по иммунофлюоресценции. .) Схема экспериментальной установки Б) Блюдо (а) помещен на лоток льда и СМИ атмосферный; Впоследствии клетки промывали три раза с 2 мл холодного PBS C) 2 мл 20% ацетона. 80% раствор метанола добавили в чашку (ов) D) фиксации клеток на.20 мин при 4 ° С (либо на льду, либо в холодильнике). E) 2 мл 3% БСА добавлен к чашке (ов), чтобы блокировать, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. F) После 30 мин блокирования истекло, добавьте первичных антител и инкубируют в течение по крайней мере 1 часа при комнатной температуре G) Вторичные антитела, растворенного в 3% БСА (в соответствующем разведении) добавляли непосредственно на базальной мембраны матрицы. смесь клеток; . впоследствии блюда закрывали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре H) 2 мл Hoechst (1:10000; растворенного в PBS) добавляется к dishe (ов) и клетки инкубируют в течение 5 мин при алюминиевой фольги I) Монтаж среда добавляется непосредственно. на матрице: смесь клеток в конфокальной блюдо и блюдо покрывается покровным стеклом. Dish (а) оставляют сохнуть в течение ночи (или 24 ч) при комнатной температуре.

Результаты

Примером MDA-MB-231 клеток вторжения в 3D матрицы показана на рисунке 3C. Клетки встроены в матрицу (день 1) и начало формирования инвазивных (звездчатые) структур на 3-й день, и полностью вторжение в матрицу на 5-й день (фиг. 3C). Количество звездчатых колоний, образованных подсчитывают и выражают в процентах от общего числа колоний на чашку (инвазивных и неинвазивных). Кроме того, поскольку измерения производятся в день в течение пяти дней, скорость вторжения также может быть оценена....

Обсуждение

Развитие 3D методы культивирования клеток позволило исследователям изучить трансформацию молочной эпителиальных клеток, что позволяет нам визуализировать драматические морфологические изменения. Кроме анализа вторжение клеток, единичные или многоклеточные эпителиальные сфероиды могут быть использованы для оценки изменений в клеточной адгезии, пролиферации, размера и базального-верхушечный полярности. В отличие от ранее представленных методологий, где клетки накладываются с ECM ^8, наш метод внедряет клетки в E...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тубы 1,5 мл	VWR	CA10011-700	Стерильные, одноразовые
100-мм чашки для культивирования BD353003	VWR	CABD353003	Стерильные, одноразовые
15 мл Falcon	Туба VWR	CA21008-918	Стерильные, одноразовые
1 мл фильтрованные наконечники	VWR	10011-350	Стерильные, одноразовые
200 μ l фильтрованные насадки	VWR	22234-016	Стерильные, одноразовые
20 μ l фильтрованные насадки	VWR	22234-008	Стерильные, одноразовые
35 мм со стеклянным дном Confocal No.1 для культур	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Предварительно охлажденный перед использованием
бычий сывороточный альбумин (БСА)	BioShop	ALB003.100	Используется в концентрации 3% для IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) антитело, высокоадсорбированное	Life Technologies	A11029	1:250 для IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Антитела Life Technologies	A11011	1:1,200 для
анти-бета-катенина ПЧ	BD Transduction Laboratories	610153	мышиный моноклональный; Используется в соотношении 1:100 для фетальной
бычьей сыворотки (FBS)	Sigma	F1051	Используется в соотношении 10% (v/v)
Hoechst 33258, Пентагидрат (бис-бензимид) - 10 мг; мл раствора в Water	Life Technologies	H3569	используется в концентрации 0,1% (разбавление 1:10 000)
InVivo Analyzer Suite	Медиа-кибернетика		Используется для 3D-визуализации культур (ДВС-изображения при 10-кратном и 40-кратном
Кисспептин-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	используется при 100 нМ
Антиламинин	Cedarlane	AB19012(CH)	Кролик-поликлональный полноразмерный человек; Используется в соотношении 1:100 для
лазерного сканирующего микроскопа IF LSM-510 META	Zeiss		Используется с объективом 63X; масляная иммерсионная линза
Matrigel phenol red free (BD356237)	VWR	CACB356237	Лот No2180819; Микроскоп Olympus IX-81 10,4 мг/мл
	Olympus		Используется для 3D-визуализации культур (ДВС-изображения при 10X и 40X)
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Life Technologies	15140-122	Антибиотик (добавлен в среду; используется в концентрации 0,01%)
10 мл пипетка	VWR	CA53300-523	Стерильная, одноразовая
среда RPMI 1640 с глутамином	Life Technologies	11875-119	Используется для культивирования клеток
MDA-MB-2310,25% трипсин-ЭДТА (1x), фенол Red	Life Technologies	25200-072	Используется для трипсинизации клеток MDA-MB-231
MEGM (набор пуль): MEBM (CC3151) + одиночные квоты (CC4136)	Lonza	CC-3150	Используется для культивирования клеток MCF10A