Белки клеточной поверхности являются биологически важной и широко гликозилированный. Введем здесь подход гликопептид захвата для растворения, обогатить и deglycosylate эти белки для легковесных протеомных анализа на основе ЖХ-МС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белки клеточной поверхности, в том числе белков внеклеточного матрикса, участвовать во всех крупных клеточных процессов и функций, таких как рост, дифференцировку и пролиферацию. Комплексный характеристика этих белков обеспечивает богатую информацию для поиска биомаркеров, идентификации камерного типа, и выбор лекарственной целевой, а также помогая продвинуть наше понимание клеточной биологии и физиологии. Поверхностные белки, однако, создают значительные аналитические проблемы, из-за их изначально низкой численности, высокой гидрофобностью и тяжелых пост-трансляционных модификаций. Воспользовавшись тем, что распространенной гликозилирования на поверхностных белков, введем здесь высокой пропускной подход гликопептид захвата, которая объединяет в себе преимущества нескольких существующих N-glycoproteomics средств. Наш метод может обогатить гликопептиды, полученные из поверхностных белков и удалить их гликаны для легковесных протеомики с использованием ЖХ-МС. Разрешенный N-glycoproteome включает инфormation идентичности белка и количества, а также их сайтов гликозилирования. Этот метод был применен к серии исследований в областях, в том числе рака, стволовых клеток и токсичности препаратов. Ограничение метода заключается в низкой численности поверхностных мембранных белков, таких, что относительно большое количество образцов, необходимых для проведения такого анализа по сравнению с исследований сосредоточены на цитозольными белков.
Введение
Белки клеточной поверхности взаимодействуют с внеклеточной среде и передают сигналы с внешней стороны к внутренней части клетки. Таким образом, эти белки, в том числе белков внеклеточного матрикса, играют важную роль во всех аспектах клеточной биологии и физиологии, начиная от распространения, роста миграции, дифференциации к старению и так далее. Поверхностные белки функционируют за счет взаимодействия с другими клетками, белков и малых молекул 1-3. Молекулярная характеристика белков клеточной поверхности представляет большой интерес не только для биологов, но и для фармацевтических компаний, так как более 60% лекарственных средств направлены на клеточной....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Harvest Мембраны
- Добавить гипотонического буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, рН 8,0) с коктейль ингибиторов протеаз на клеточного осадка (~ 10 8 клеток) и инкубируют в течение 15-30 мин на льду. Lyse клетки при прохождении пробы через шприцев игл (5-10 проходов) или гомогенизации образца на гомогенизаторе Даунса (15-30 ударов). Используйте гемоцитометра и окрашивания трипановым синим, чтобы проверить эффективность лизиса.
- Получение микросомальной фракции дифференциальным центрифугированием при 3000 лизата GX 15 мин и затем при 100000 GX 2 час. Первый центрифугирование получает осадок, который ядерная часть, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель блок-схема экспериментальной процедуры приводится на рисунке 1. Маркировка и дальнейшие шаги фракционирования являются необязательными и детали описаны в недавней публикации 18. Другой вариант заключается в анализе немодифицированных пептидов, которые не вступают в реакцию со смолой. Преимущества анализа немодифицированных пептидов включают идентификацию потенциального негликозилированной пептидов и белков, таких как клаудины в плотных контактов; Дополнительным преимуществом явл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы вводим стратегию гликопептид-захвата для профилирования белков клеточной поверхности. Этот метод может быть применен для изучения секретируемые белки, такие как те в крови, а также в других жидкостей организма или в культуральной среде клеток.
Успех метода зависит от полного переваривания проб; Поэтому SDS-PAGE характеристика эффективности пищеварения необходимо, особенно для впервые анализа образца. Полный пищеварение может быть сложным для мембранных белков, и может быть возможно .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Это исследование было поддержано запуска фонда Университета Саймона Фрейзера.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Йодоацетамид | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| периодат натрия | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz гидразидный гель | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Трипсин | Уортингтон Биомедицинский | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 картридж | Воды | WAT054955 | |
| Oasis MCX картридж | Воды | 186000252 | |
| Ингибитор протеазы | Сигма | P8340 | |
| Мочевина | Амерско | 568 | |
| Сульфит натрия | Каледон | 8360-1 | |
| инвертаза | сигма | I0408 | |
| α-1 трипсин | Sigma | F2006 | |
| рибонулеаза B | сигма | R7884 | |
| авидин | сигма | A9275 | |
| овальбумин | сигма | A5503 | |
| кональбумин | сигма | c0755 |
Ссылки
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
