Методическая статья

Лазерно-индуцированное Разбивка спектроскопия: новый подход по картированию и количественной наночастиц в ткани органа

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51353

⸱

18 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ILM-FENNEC UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 2ILM-PUBLI UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 3ILM-SOPRANO UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1

В этой статье

Краткое содержание

Лазер-пробой спектроскопия выполняется на тонком органа и ткани опухоли успешно обнаружил природные элементы и искусственно вводят гадолиний (GD), выпущенные от наночастиц Б-г на ​​базе. Изображения химических элементов достиг разрешение 100 мкм и количественного чувствительности к югу мм. Совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани.

Аннотация

Излучение спектроскопия лазерной плазмы был применен к элементного анализа биологических образцов. Лазер-пробой спектроскопии (LIBS) выполняется на тонких срезов грызунов тканей: почки и опухолевых, позволяет обнаружение неорганических элементов, таких как (I) Na, Ca, Cu, Mg, P, и Fe, естественным образом присутствуют в организме и (II) Si и Б-г, обнаружен после инъекции наночастиц гадолиния основе. Животные были умерщвлены 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц. Двумерная сканирование образца, выполняется с использованием моторизованного микрометрической 3D-сцену, позволило инфракрасный лазерный луч, чтобы исследовать поверхность с пространственным разрешением менее 100 μ м. Количественный химический изображения элемента Gd внутри органа были получены с чувствительностью к югу мм. LIBS предлагает простой и надежный метод для изучения распределения неорганических материалов без какого-либо специального labeliнг. Кроме того, совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани с различными типами ответ: элементный, молекулярных или клеточных.

Введение

Широкое развитие наночастиц для биологических применений призвал параллельный улучшение аналитических методов для их количественного и обработки изображений в биологических образцах. Обычно обнаружение и отображение наночастиц в органах сделаны флуоресценции или конфокальной микроскопии. К сожалению, эти методы требуют маркировки наночастиц с помощью ближней инфракрасной краски, который может модифицировать биораспределение наночастиц, особенно при очень малых наночастиц из-за его гидрофобных свойств. Обнаружение меченых наночастиц, и особенно очень маленьких наночастиц (размер <10 нм), может, таким образом, препятствовать их биораспределение на всей шкале тела, но и на ткани и клеточных уровней. Разработка новых устройств, способных обнаружить наночастицы без маркировки предлагает новые возможности для изучения их поведения и кинетики. Кроме того, роль микроэлементов, таких как железо и медь в головном мозге болезниг нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера 1, Menkes 2,3, или Уилсон 4 предложить интерес для изучения и локализовать эти элементы в тканях.

Различные методы были использованы для обеспечения элементарного отображение или микроанализа различных материалов. В их обзоре, опубликованном в 2006 году, Р. Lobinski др.. Представил обзор имеющихся стандартных методов элементного микроанализа в биологической среде, один из самых сложных условиях для аналитических наук 5. Электронный микрозонд, который состоит из энергии дисперсионного рентгеновского микроанализа в просвечивающем электронном микроскопе, могут быть применены к многочисленных исследований, если концентрация элемент является достаточным (> 100-1000 мкг / г). Для достижения более низких пределов обнаружения, были использованы следующие методы:

  • ионного пучка микрозондовый использованием частиц индуцированного рентгеновского излучения μ-PIXE (1-10 мкг / г) 6
  • синного излучения микроанализ μ-SXRF (0,1-1 мкг / г) 7
  • вторичная ионная масс-спектрометрия SIMS (0,1 мкг / г) 8
  • лазерная абляция индуктивно связанной масс-спектрометрии LA-ICP-MS (до 0,01 мкг / г) 9,10

Вышеупомянутые методы обеспечивают микрометрическое разрешение, как показано в таблице 1, извлеченного из Lobinski соавт.

3D-реконструкция серийных 2D исследований также может быть предложен для реконструкции более глубоких тканей 11. Тем не менее, все устройства и системы требуют наличия как квалифицированных специалистов, умеренные до очень дорогого оборудования и продолжительный эксперименты (как правило, более чем на 4 ч в течение 100 мкм х 100 мкм для μ-SXRF и 10 мм х 10 мм для LA-ICP-MS ) 12. В целом, эти требования делают элементный микроанализ очень ограничивающая и несовместимы с обычными системами оптических изображений,флуоресцентной микроскопии или нелинейная микроскопии. Еще один момент, что мы можем упомянуть здесь является то, что количественное возможность измерения по-прежнему довольно ограничен и зависит от наличия соответствующих матрице лабораторных стандартов. Дальнейшее обобщение применение элементарного микроанализа в отрасли процессов, геологии, биологии и других областях применения будет генерировать значительные концептуальные и технологические прорывы.

Целью настоящего рукописи является создание решения для количественного элементного отображения (или элементного микроанализа) в биологических тканей с настольной аппаратуры полностью совместимы с традиционной оптической микроскопии. Наш подход основан на лазерной искровой спектроскопии (LIBS технологии). В LIBS, лазерный импульс сосредоточен на выборке из интереса, чтобы создать разбивку и искру материала. Атомное излучение в плазме затем анализируют с помощью спектрометра и элементарныхконцентрации ментальных могут быть получены с поверочные выполненных заранее 13,14. Преимущества LIBS включают чувствительность (мкг / г для почти всех элементов), компактность, очень простой пробоподготовки, отсутствие контакта с образцом, мгновенной реакции и точно локализованной (микро) поверхности анализа. Однако, применение химических ткань изображений остается сложной, поскольку лазерной абляции ткани должны быть точно контролироваться, чтобы выполнить карты с высоким пространственным разрешением вместе с чувствительностью в мкг / г диапазоне 15,16.

При таком решении, присоединением индикаторов или маркировки агентов не требуется, что позволяет обнаруживать неорганические элементы непосредственно в их родной среде в биологических тканях. LIBS инструмент, разработанный в нашей лаборатории предлагает текущее разрешение, ниже 100 мкм по оценкам, чувствительности для Б-га ниже 35 мкг / г, что эквивалентно 0,1 мм 16, что позволяетотображение больших образцов (> 1 см 2) в течение 30 мин. Кроме того, домашнее программное обеспечение облегчает приобретение и эксплуатацию данных. Этот инструмент используется для обнаружения, карту, и количественно тканевое распределение гадолиния (Gd) на основе наночастиц 17 - 18 в почках и образцов опухоли из мелких животных, 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц (размер <5 нм) . Неорганические элементы, которые по своей сути, содержащиеся в биологической ткани, такие как Fe, Ca, Na, и Р, были также обнаружены и в образ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Биологическая пробоподготовки

Все эксперименты, описанные в данном исследовании были утверждены уходу и использованию животных комитета CECCAPP (Лион, Франция) (авторизация # LYONSUD_2012_004) на, и эксперименты проводились под наблюдением уполномоченных лиц (Л. Sancey, DDPP авторизации # 38 05 32).

  1. Добавить 1 мл H 2 O до 100 мкмоль наночастиц Гадолиний (Б-г) на базе, ждать 15 минут, и добавить 20 мкл HEPES 50 мм, NaCl 1,325 М, CaCl 2 20 мм до 100 мкл H 2 O и 80 мкл первичного решения наночастиц Б-г на ​​базе для получения раствора 200 мкл на 40 мм готовых к Inject (город: Лион, в лаборатории).
  2. Введите 200 мкл Б-г на ​​базе решения наночастиц внутривенно в анестезированных опухолями грызунов (Город: Lyon Sud (Уллен), 15 км от лаборатории).
  3. 1-24 ч после инъекции, пожертвовать мышейг поставить биологических образцов в изопентана, охлаждаемым жидким азотом. Храните образцы при - 80 ° C (Город: Лион Sud (Уллен), в 15 км от лаборатории).
  4. Нарежьте образец (City: обычно Гренобль, в 100 км от лаборатории; я постараюсь, чтобы иметь доступ в Lyon Sud) в 100 мкм толщиной горками и поставить биологические слайды на конкретных пластиковой посуды (чашки Петри). Хранить при температуре -80 ° С.
    Примечание: Пластиковая посуда в основном очень чистый образец полимера. Они используются, чтобы избежать помех элементов, содержащихся в ткани.

2. Подготовка образцов для калибровки

  1. Подготовка ампулы с увеличением дозы Gd на основе наночастиц в воду (0 нМ, 100 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ и 5 мМ).
  2. Положите 5 мкл-каплю каждого решения регулярно расстоянии 3 мм на чашке Петри.
  3. Высушивают при комнатной температуре в течение 20 мин.

3. LIBS Эксперимент

  1. Инициализация установки LIBS
    1. Лазерные Настройки. После включения приборов, подождите 10-20 мин для лазерного импульса стабилизации энергии и охлаждения из ICCD камеры до -20 ° С Отрегулируйте энергии импульса с аттенюатора.
      Примечание: Оптимальные параметры лазера для отображения тканях 5 нс длительность импульса, 1064 нм длина волны, энергия импульса около 4 мДж. Лазер использует типичный Nd: YAG лазер наносекунды.
    2. LIBS Настройки. Установка фокусировки лазерного положение (по отношению к поверхности образца), чтобы получить меньший диаметр кратера (около 50 мкм или менее).
      Примечание: Это соответствует лазерного импульса сосредоточения 100 мкм ниже поверхности образца.
    3. Настройки спектрометра. Используйте спектрометр Черни-Тернера в сочетании с 1200 линий / мм решетки и высоким временным разрешением ICCD камеры. Управление всеми этими устройствами с помощью компьютера. Установите значение входной щели до 40 мкм. Установите Спектральный диапазон реГардинг элемент, который будет анализироваться. Используйте спектральный диапазон, охватывающий 325 до 355 нм для обнаружения Б-га с высокой чувствительностью, а также Na, Cu и Ca. Установите параметры ICCD с задержкой 300 нс, ворота 2 мкс, и прироста 200.
  2. Отображение измерений
    1. Поместите биологического образца на LIBS моторизованных держателя образца.
    2. Отрегулировать высоту образца в соответствии с положением фокуса лазера.
    3. Возьмите с высоким разрешением фотографию образца среза.
    4. Установите модуль отображения программного обеспечения LIBS приобретения выполнять карту с типично 100 х 100 точек измерения расположенных по решению около 100 мкм.
    5. Запустите приобретение. С этой точки автоматизировать все; последовательность, а также запись спектра перемещения и сохранения. 40 мин требуются для отображения 10000 пунктов (эквивалент 1 см 2 для разрешения 100 мкм). Перегруппировка все записанное спектры в тот же файл.
    6. При еinished, взять вторую фотографию образца ломтик
  3. Калибровка Измерение

С тех же экспериментальных параметров, измерения калибровочных проб (подробнее подготовки, см. раздел 2). Выполнение карту или записи 25-спектры (полученный из участков измерений в центральной части капли) в каждой из калибровочных капель.

4 Спектральный анализ LIBS:. Построение химического Images

  1. Запишите все спектры LIBS из отображения ткани и загружать их в анализе LIBS программного обеспечения. Вычтите базовый для каждого спектра и построить химические изображения с относительной шкале интенсивности использовании ложной цвет.
    Примечание: алгоритм получает конкретные интенсивности линий, таких как Б-га, Cu, Na, Ca или.
  2. Выполните те же действия на спектров, измеренных от калиброванного образца, чтобы позволить расчет калибровочных кривых (зависимость между интенсивностью и концентрацией) и построить водныйuantitative карту или изображение для Б-га (или другой элемент интереса).
  3. Применить адекватные процедуры для химических изображений, например интерполяции или сглаживания. Сохраните карты интенсивности или концентрации в формате изображения (растрового).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано на фиг.1, балки Nd: YAG лазер в фундаментальной длине волны 1064 нм была направлена ​​вертикально вниз на срез ткани кварцевой линзы 50 мм фокусного расстояния. Энергия импульса составляла 4 мДж и частотой повторения 10 Гц. Для того чтобы избежать генерацию плазмы в воздухе, лазерный луч был сфокусирован около 100 мкм под поверхностью образца. Нет воздушно-плазменной не наблюдалось в этом состоянии. В ходе экспериментов, образец перемещается с помощью шагового двигателя в целях получения од...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Применительно к биологическим образцом, этот метод позволяет химический изображений, т. е. отображение и количественного, Б-га и Si из введенных наночастиц Б-г на базе в различных органах. Из основных критических настроек, контроль лазерных свойств (длин волн, энергии импульса, фокусирующих и стабильности) имеет решающее значение для точного и тонкого ткани абляции (т.е. разрешение отображение), а также на чувствительность. Работа при высокой энергии обеспечивает лучшую чувствительность, но, к сожалени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность финансовую поддержку по Labex-Imust.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лазерный наносекундный Nd:YAGQuantelBrillant5 нсек ширина импульса, длина волны 1 064 нм
СпектрометрAndor TechnologyShamrock 303с 1 200 линиями/мм вспыхнутый при 300 нм решетка
Детектор ICCDAndor Technology Istar2 нсек временное разрешение
LIBS UnitILMСамодельные приборы
основе Gd наночастицыНано-Нчастицы
HEPESSigma-AldrichH4034для разбавления частиц
CaCl2Sigma-Aldrich21108для разбавления частиц
NaClSigma-AldrichS5886для разведения частиц
МышиCharles Riverв зависимости от разведения
ИзофлуранCoveto / Virbacдля анестезии - Isofluranum
IsopentaneSigma-Aldrich59060для замораживания образца 
медленно Жидкий азотAir Liquideдля охлаждения изопентана
CryostatLeicaCM-3050Sдля скольжения образцов
чашки ПетриДатчер353004для прилипания образец
на животных

Ссылки

  1. Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
  2. Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
  3. Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
  4. Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
  5. Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
  6. Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
  7. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
  8. Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
  9. Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
  10. Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
  11. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
  12. Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
  13. Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
  14. Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
  15. Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
  16. Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
  17. Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
  18. Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи