Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности 1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством 8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов 2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP 11) между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) 12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.
Введение
Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина 13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов 2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фот....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы, описанные ниже, в соответствии с IACUC и IRB этическими комитетами из Университета Питтсбурга в Школе медицины.
1. Подготовка гиппокампа нейронов культур в капот культуры ткани
Примечание: Используйте стерильной техники и реагентов на протяжении протокола 1.
- Подготовка поли-D-лизина (0,1 мг / мл в H 2 O) покровные стекла с покрытием в качестве субстрата для нейрональной культуры.
- Поместите 4-5 круглые покровные стекла внутри каждого 3,5 см блюдо культуры ткани.
- Пятно 70 мкл поли-D-лизина на каждый 12 мм покровным. Примечание: для живого изображения, со стеклянным дном 3,5-см ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Характеристика BBS меткой построить включает в себя важные элементы, такие как определения, если экспрессированный белок собирает надлежащим образом (в частности, с рецепторами, состоящими из нескольких субъединиц), трафика на клеточной поверхности и локализует соответствующим образом. Тормозные синапсы состоят из ГАМК поверхности рецептора кластеры, которые локализуются с ингибиторной gephyrin эшафот белка и соединенный с пресинаптических тормозящих терминалов, определенных везикулярного тормозного транспортера аминоки.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удаление лиганд-ионных каналов и GPCR и оценки изменений в области незаконного оборота в связи с наличием агонистов и модуляторов. Ключевые аспекты включают соответствующую локализацию тега к внеклеточного нахождения и осуществляющее контроль з.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Поддержку оказали запуска-фондов от биологического факультета фармакологии и химической в университете Питтсбурга школа медицины. Подтверждение Иакова членов лаборатории, которые внесли свой вклад в видео представления: Николай Graff.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект P3 Primary Cell 4D | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 647 сопряженные | молекулярные зонды | B35450 | |
| α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 488 конъюгированные | молекулярные зонды | B13422 | |
| α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 594 конъюгированные | молекулярные зонды | B13423 | |
| (+)-Тубокурарин хлорид | Tocris | 2820 | |
| Монтажная среда | DAKO | cS703 | |
| DPBS без кальция, магний | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-лизин | Sigma | P6407 | |
| Антитело к гефирину | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT антитело | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Чашка для культуры тканей со стеклянным дном | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dish | |
| Coverslips (круглое покровное стекло)), #1 толщина, 12 мм | Warner Instruments | 640-0702 |
Ссылки
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. E....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
