Методическая статья

Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

DOI:

10.3791/51365

⸱

28 марта 2014 г.

 ,  , 
1Pharmacology & Chemical Biology Department, University of Pittsburgh School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности 1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством 8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов 2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP 11) между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) 12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина 13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов 2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Во поверхности клетки биотинилирования свободные амины ковалентно модифицированный, с потенциалом, чтобы повлиять на клеточную активность. Исследования, основанные антитела часто мешает поверхностного антигена кластеризации или укупорки, которая может изменить события с торговлей людьми. В связи с этапа отбелки на FRAP сtudies, важной задачей является повреждения основной клеточную структуру. Дополнительным преимуществом является то, что BBS отмеченных конструкции также могут быть использованы для биохимических методик с оборота рецептора в сочетании биотин-Бунгаротоксин ослов. Этот метод легко применим к клеточных линий и первичных клеток. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. Выполнение простой поверхности BGT маркировки (эквивалент Т = 0 момент времени для протокола эндоцитоза) на нетрансфицированных клеток в отсутствие тубокурарина, должны представить доказательства эндогенного Nachr.

Важным фактором для использования этого метода является целесообразным введение в BBS так, что он присутствует на внеклеточный месте, когда представляющий интерес белок доставляется в плазматической мембране. Например, N-концевые домены из GABAAR субъединиц проживают в везикулярного просвета во торговлей людьмиговли и стать внеклеточного рецептора после введения в плазматической мембране, что позволяет конкретной маркировки рецепторами клеточной поверхности и оценка их удаления с поверхности клеток с помощью эндоцитотических событий. Ранее нами было показано, что добавление GFP, Myc, или BBS эпитопов в этой области GABAAR субъединиц функционально молчание. Стандартные элементы должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что меченый белок экспрессируется на том же уровне, чтобы без метки конструкции, что она соответствующим образом локализованы, и что он не влияет на функцию рецептора. Эта характеристика трансфектированных конструкций также поможет в устранении неполадок проблем избыточной экспрессии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы, описанные ниже, в соответствии с IACUC и IRB этическими комитетами из Университета Питтсбурга в Школе медицины.

1. Подготовка гиппокампа нейронов культур в капот культуры ткани

Примечание: Используйте стерильной техники и реагентов на протяжении протокола 1.

  1. Подготовка поли-D-лизина (0,1 мг / мл в H 2 O) покровные стекла с покрытием в качестве субстрата для нейрональной культуры.
    1. Поместите 4-5 круглые покровные стекла внутри каждого 3,5 см блюдо культуры ткани.
    2. Пятно 70 мкл поли-D-лизина на каждый 12 мм покровным. Примечание: для живого изображения, со стеклянным дном 3,5-см блюдо культуры ткани могут быть использованы (пятно 200 мкл поли-D-лизин на встроенном 14 мм покровным стеклом).
    3. Оставьте приготовленных блюд в капот культуры ткани O / N. Чтобы свести к минимуму поли-D-лизин испарения и держать поверхности стерильные в капот культуры ткани, закрыть створку окна и выключить тыс.э вентилятора O / N. Примечание: УФ лампы не используются во время O / N инкубации.
    4. На следующее утро, мыть посуду 3x 2 мл H 2 O.
    5. После удаления последнего H 2 O стирка, добавить 2 мл СМИ к каждому 3,5 см блюдо и не оставляют посуду в инкубаторе до готовности к пластине нейроны в шаге 1.4.
  2. Нейронов гиппокампа получают из эмбриональный день 18-19 (E18-19) крыс (модифицированные с Goslin 22).
  3. Трансфекции недавно диссоциированных нейронов в день культивирования с 1-4 мкг maxiprepped конструкцию ДНК.
    Примечание: обычно от 3 ​​мкг ДНК трансфицируют в 1-2 млн. нейронов, с жизнеспособностью 50% и эффективность трансфекции 60% (например, начиная с 2000000 нейронов: ((2 х 10 6 нейронов х 0.5) 0.6) обеспечивает около 1 млн. нейронов;.. 600 000 из которых Трансфицированные 1 разное количество ДНК-конструкция может быть трансфицированы при устранении потенциальных проблемсверхэкспрессия, а затем соответствующей характеристике конструкта локализации и функции.
  4. Пластинчатый трансфицированных нейронов на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизина при конечной плотности приблизительно 200000 нейронов в 3,5 см чашку. Примечание: для стеклянным дном блюдо, тарелка 40,000-50,000 нейронов на 14 мм площадью остекления.
  5. Замените носитель 4-24 ч после подготовки нейронов культур, затем позволить нейроны не развивать в инкубаторе до 14-17 дней в пробирке (DIV) или желаемой стадии.

2. Эндоцитоз Анализ

ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на α-бунгаротоксина и тубокурарина отходов и обращению:

  1. Обработка всех пептидных нейротоксинов рекомендуется в пределах руководящих принципов уровень биологической безопасности-2 (BL-2) научно-исследовательских протоколов. Все собственно средства индивидуальной защиты необходимо носить. Лиофилизованные токсина порошки должны быть восстановлены в соответствии с инструкциями изготовителя. Токсин отходов шоусть быть утилизированы в соответствии с санитарного состояния окружающей среды и труда руководящего учреждения.
  2. Для удаления возможных пептидных агрегатов, которые могли образоваться во время хранения, α-бунгаротоксина аликвоты должны быть кратко центрифугировали перед использованием, и супернатант должен быть использован для эксперимента.
  3. α-Бунгаротоксин (Bgt) запасы ресуспендировали до концентрации 1 мг / мл в стерильной Н2О и хранили в 10 мкл аликвотах при -20 ° С. Флуоресцентно сочетании запасы Bgt используются при 3 мкг / мл. Тубокурарин используют в конечной концентрации 150 мкМ.
  1. Установить скамейки верхний нагреватель блока до 16 ° С в холодной комнате с тонкого алюминия или нержавеющей стали пластины на вершине. С другой стороны, если таковые имеются, настольная охлаждение / обогрев устройство может быть использовано для каждого шага, требующего 16 ° C.
  2. Прохладный внеклеточного Гепес-солевом буфере (HBS, содержащие в мм: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 глюкозы, 1,2 MgCl 2 и 2,5CaCl 2, рН 7,4) до 16 ° С на водяной бане.
  3. Передача нейронов блюда алюминиевую пластину при 16 ° С и прохладный в течение 5 мин.
  4. Удалить вложение (держать обусловленные СМИ и резерв в инкубаторе в течение шагом 2.8, эндоцитоза временных точках анализа) и заменить с 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарина (150 мкм) в течение 2 мин.
  5. Удалить HBS + тубокурарин, чтобы обозначенный мусоросборник и заменить 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарин (150 мкМ) + α-бунгаротоксина Alexa 594 [3 мкг / мл], инкубации при 16 ° С в течение 15 мин.
  6. Удалить HBS + тубокурарин + α-Бунгаротоксин Alexa 594 до обозначенный мусоросборник и мыть посуды 3x 2 мл 16 ° C HBS (промывные воды могут быть собраны с помощью аспирации в вакуумной колбе, содержащей 50 мл 50% хлорной извести).
  7. Для экспериментов жить изображений временных рядов следующие рецептора эндоцитоза с помощью стакан дном 3,5 см культуры блюдо, выполните шаги 2.1-2.6, а затем перенести блюдо нагревательный столик(Пельтье устройство) на микроскопе, и начать изображений с конфокальной или установки TIRF микроскопа.
  8. Переход T = 0 момент времени покровные в блюдо РТ 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин, продолжая с другими покровные к шагу 2.9.
  9. Для других временных точках, заменить HBS с кондиционером, уравновешенную 37 ° C СМИ (защищены в шаге 2.4) и вернуться в инкубаторе в течение эндоцитоза при 37 ° C. Примечание: предложили дополнительные моменты времени Т = 15, 30 и 60.
  10. В моменты времени необходимо, принять блюда из инкубатора, мыть быстро дважды 2 мл РТ DPBS (не DPBS не кальций, магний), то исправить в 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин.
  11. Через 20 мин фиксации, удалить 4% параформальдегида / 4% сахарозы тратить контейнер и мыть посуду в два раза с 2 мл РТ DPBS.
  12. Инкубируйте покровные при комнатной температуре в течение 10 мин в растворе иммунофлюоресценции блок (блок решение = 5% лошадиной сыворотки, 0,5% BSA в DPBS), содержащий 0,2% Тритон Х-100 в permeabilИзе нейроны и включить анти-GFP иммуноокрашивания внутриклеточного пула рецепторов и / или маркировки других белков, представляющих интерес.
  13. Удалить блок + 0,2% Тритон Х-100 и инкубировать покровные в блоке решения иммунофлюоресценции без Triton X-100 в течение 20-30 мин.
  14. Выполните инкубации первичные антитела покровные в блоке в течение нескольких часов при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Примечание: инкубация покровные с праймериз при 4 ° CO / N обычно производит более высокие результаты иммунофлуоресцентных.
  15. Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
  16. Инкубируйте покровные с вторичными антителами в блоке растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
  17. Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
  18. Mount покровные, обработки каждый покровное индивидуально: удаления избытка жидкости из задней части покровного стекла с лабораторной ткани, затем инвертировать покровное на 4 мкл монтажа среду на предметное стекло.
  19. Разрешить слайды, чтобы высушить при комнатной температуре покрывается за 30 мин, затем улруда при 4 ° С до готовности для выполнения микроскопии.
  20. Сбор и анализ эксперимента с конфокальной микроскопии (слепой экспериментальной состоянии) Изображение. 60X масло Н.А. 1,49 погружения цель со следующими лазеров: аргон 488 нм, 561 диода, 640 диода.
    1. Используя те же настройки захвата изображений, приобрести односпальные Z раздел изображений с нейронной тела клетки и несколько дендритных процессов в фокусе.
    2. Количественно α-бунгаротоксина Alexa флуоресценции GFP сигнал и иммунное окрашивание по 20 мкм 3-4 проксимальных дендритов на один нейрон, используя тот же порог для анализа всех данных эндоцитоза.
    3. Анализ данных из 10-12 нейронов для каждой временной точки, повторяя эксперимент с несколькими независимыми нейрональных культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика BBS меткой построить включает в себя важные элементы, такие как определения, если экспрессированный белок собирает надлежащим образом (в частности, с рецепторами, состоящими из нескольких субъединиц), трафика на клеточной поверхности и локализует соответствующим образом. Тормозные синапсы состоят из ГАМК поверхности рецептора кластеры, которые локализуются с ингибиторной gephyrin эшафот белка и соединенный с пресинаптических тормозящих терминалов, определенных везикулярного тормозного транспортера аминоки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удаление лиганд-ионных каналов и GPCR и оценки изменений в области незаконного оборота в связи с наличием агонистов и модуляторов. Ключевые аспекты включают соответствующую локализацию тега к внеклеточного нахождения и осуществляющее контроль з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержку оказали запуска-фондов от биологического факультета фармакологии и химической в ​​университете Питтсбурга школа медицины. Подтверждение Иакова членов лаборатории, которые внесли свой вклад в видео представления: Николай Graff.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Комплект P3 Primary Cell 4D LonzaV4XP-3024
α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 647 сопряженныемолекулярные зондыB35450
α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 488 конъюгированныемолекулярные зондыB13422
α-Бунгаротоксин, Alexa Fluor 594 конъюгированныемолекулярные зондыB13423
(+)-Тубокурарин хлоридTocris2820
Монтажная среда DAKOcS703
DPBS без кальция, магнийInvitrogen14190-136
Poly-D-лизин SigmaP6407
Антитело к гефиринуSynaptic Systems147 0111:300
VIAAT/VGAT антителоSynaptic Systems131 0021:1,000
anti GFPLife TechnologiesA64551:2,000
Чашка для культуры тканей со стеклянным дномMatTek CorporationP35G-1.5-14-C - Mattek Dish
Coverslips (круглое покровное стекло)), #1 толщина, 12 ммWarner Instruments640-0702

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pH GFP

Похожие статьи