Методическая статья

Нуклеозидтрифосфатов - от синтеза до биохимической характеризации

DOI:

10.3791/51385

⸱

3 апреля 2014 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь призвана объяснить и сокращать многочисленных препятствий на пути сложной трассе, ведущей к модифицированным нуклеозидтрифосфатов. Следовательно, этот протокол облегчает как синтез этих активированных строительных-блоков и их доступности для практического применения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционная стратегия для внедрения химических функциональных групп является использование твердофазного синтеза из путем добавления соответствующим образом модифицированные предшественники фосфорамидит к зарождающейся цепи. Тем не менее, условия, используемые в процессе синтеза и ограничение на относительно коротких последовательностей препятствовать применимость этой методологии. С другой стороны, модифицированные нуклеозидтрифосфаты активируются стандартные блоки, которые были использованы для мягкого введения многочисленных функциональных групп в нуклеиновые кислоты, стратегии, которая открывает путь для использования модифицированных нуклеиновых кислот в широкомасштабной палитре практических приложений таких как функциональное пометки и поколения рибозимов и DNAzymes. Одна из основных проблем заключается в сложности методологии, ведущей к изоляции и характеристике этих аналогов нуклеозидов.

В этом видео статье мы представляем подробный протокол для синтеза Фесе изменение аналогов с использованием фосфора реагентов (III) на основе. Кроме того, порядок их биохимической характеристике разглашается, с особым акцентом на удлинения праймера реакций и хвостохранилища полимеризации TdT. Это Подробный протокол будет полезен для крафта модифицированных дНТФ и их дальнейшего использования в химической биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5'-нуклеозидтрифосфатов ((г) НПТ) представляют собой класс жизненно важных биомолекул, которые участвуют в бесчисленных процессов и функций, начиная от того, универсальная валюта энергии регуляторов клеточного метаболизма. В дополнение к своей роли в этих фундаментальных биологических преобразований, их модифицированные аналоги продвинулись как универсальный и мягким платформы для введения функциональных групп в олигонуклеотидов, методологии, которая прекрасно дополняет автоматизированную твердофазного синтеза, который обычно применяется 1,2. В самом деле, при условии, что (г) НПТ может выступать в качестве субстратов для РНК и ДНК-полимеразы 3, богатством функциональных групп, включая аминокислоты 4-13, борной кислоты 14,15, nornbornene 16, алмазоида-подобных остатков 17, боковых цепей для органокатализа 18, желчные кислоты 19, и даже 20 олигонуклеотиды могут быть введены в олигонуклеотидов.

_content "> За что составляет удобный вектор для функционализации нуклеиновых кислот, модифицированные дНТФ может заниматься SELEX и других связанных с комбинаторные методы экстракорпорального отбора в для генерации модифицированных каталитических нуклеиновых кислот 21-30 и аптамеров для различных практических приложений 10, 31-36. Дополнительные боковые цепи, которые вводятся путем полимеризации модифицированных дНТФ, как полагают, увеличивает химическую пространство, которое может быть изучены в ходе эксперимента отбора и дополнить довольно плохой функциональный арсенал нуклеиновых кислот 37. Однако, несмотря на эти привлекательные черты и недавний прогресс, достигнутый в разработке синтетических и аналитических методов, нет универсально применимой и высокоурожайный процедура существует для крафта модифицированных нуклеозидтрифосфатов 2,38.

Цель этой Настоящий Протокол, чтобы пролить свет на (иногда) сложные процедуры, ведущие то синтез и биохимические характеристики этих активированных строительных блоков (рис. 1б). Особое внимание будет уделено на всех синтетических деталей, которые часто трудно найти или отсутствуют в экспериментальных участков, но которые еще ​​решающее значение для успешного завершения синтетического пути, ведущие к изоляции чистых (г) НПТ (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов

Синтетический подход выбран в соответствии с процедурой, разработанной Людвига и Экштейном так как этот метод, как правило, надежны и приводит к очень мало побочных продуктов (рис. 1А) 39.

  1. Coevaporate подходящим образом 3'-OAc-защищенный нуклеозид (как правило, 0,1 ммоль) дважды безводном пиридине (2 мл) и затем сушили под вакуумом в течение ночи. В то же время, сухой трибутиламмонийпирофосфат (0,13 ммоль) под вакуумом в течение ночи.
  2. Растворить нуклеозида в минимальном количестве сухого пиридина (0,2 мл) и добавляют сухом диоксане (0,4 мл) в качестве сорастворителя. Наконец, добавляют 2-хлор-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-он (0,11 ммоль) и дают реагировать при комнатной температуре в течение 45 мин.
    Примечание: Следует отметить, что особое внимание должно быть принято с 2-хлор-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-одного реагента. Действительно, даже хранение этого реагента в атмосфере инертного газа атмосферздесь не является достаточным, чтобы предотвратить его разложение. Таким образом, твердое вещество белого цвета, который образуется в этом разложении можно и нужно соскрести перед использованием.
  3. Готовят раствор трибутиламмонийпирофосфата в сухом ДМФА (0,17 мл) и свежеперегнанный трибутиламин (58 мкл; никогда не добавляют молекулярные сита). Добавить полученного раствора реакционной смеси (появляется белый осадок, но быстро исчезает) и позволяют реагировать при комнатной температуре в течение 45 мин.
  4. Готовят раствор йода (0,16 ммоль) в пиридине (0,98 мл) и H 2 O (20 мкл) и добавляют к реакционной смеси для того, чтобы окислить Ра (III) центр. Разрешить Полученный темный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Используйте 10% водный раствор NaS 2 O 3, чтобы утолить избыток I 2. Растворитель удаляют в вакууме (температура вод ной бане при роторном испарителе должна быть ниже 30 ° С). Добавить H 2 O (5 мл) и позволяют Миxture стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы гидролизовать циклический фрагмент, трифосфат.
  6. На данном этапе, защитные группы обычно удаляются (т.е. 3'-OAc и групп на боковых цепей нуклеоснованием). Следовательно, добавление NH 4 OH (30% в H 2 O, 10 мл) в сырой нефти и перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре, и растворитель удаляют в вакууме.
  7. Добавить 2 мл H 2 O и разбит на 2 трубки. Добавить 12 мл 2%-ным раствором NaClO 4 в ацетоне и центрифуге (1000 мкг) в течение 30 мин. Эту процедуру повторяют еще раз. Это позволяет осадки для разделения растворителей и реагентов, используемых в синтезе от трифосфата (который будет выпадать в осадок), тем самым упрощая вытекающими отсюда очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ существенно.
  8. После воздушной сушки маслянистого остатка, запись 31 P-ЯМР спектр сырого (в соответствии со стандартными процедурами, см. также перечень материалов и фиг.3) ирастворить в 4 мл H 2 O.
    Примечание: Эта методика синтеза главным образом сосредоточена на создании модифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов, но очень подобная процедура может быть применена для их аналоги РНК (просто с помощью 2 ', 3'-бис-О-ацетилированный предшественники).

2. ВЭЖХ Очистка модифицированного нуклеозидтрифосфатов

  1. Приготовление 1 М исходного раствора бикарбоната триэтиламмони (TEAB): 40
    1. Приготовьте раствор 1 моль триэтиламина (139 мл) в ≈ 600 мл дистиллированной и фильтруют H 2 O.
    2. Пузырь CO 2 (через сухого льда и газовой барботером) в раствор при интенсивном перемешивании до рН 7,6 не будет достигнуто (это займет не менее 10 часов). Этот исходный раствор можно хранить в холодильнике в течение до одного месяца.
  2. Очистка:
    1. Приготовьте два буферных растворов от 1 М складе: 2 л 50 мМ TEAB в особо чистой воды (элюент)й 1 л 50 мМ TEAB в 50% MeCN (элюент B). Дега оба элюентов под вакуумом и при перемешивании в течение 20 мин (особое внимание необходимо, чтобы не изменить рН путем удаления СО 2 в процессе дегазации).
    2. Подготовить аналитическую пробу путем растворения 10 мкл неочищенного трифосфата в 300 мкл дистиллированной H 2 O и впрыснуть в ВЭЖХ системе, оснащенной полу-колонки RP (C18) и, используя градиент в диапазоне от 0-100% В в течение 40 мин (рис. 4). Отрегулируйте программу ВЭЖХ в соответствии с R т трифосфата (который, как правило, основной пик на хроматограмме) и дифосфат (который имеет несколько меньшую R T). Очищают сырой смеси с использованием этих условий и, удалив ранние фракции, которые могут содержать некоторые дифосфат.
    3. Смешайте все фракции, содержащие продукт и подвергают сублимационной сухой (который является предпочтительным для испарения на роторном испарителе, чтобы минимизировать гидролиз к нежелательному diphosphели). Coevaporate несколько раз сверхчистой водой (для удаления остатка триэтиламин из элюентов). Оценить чистоту трифосфата методом ЯМР (как 1 H и 31 P ЯМР) и MALDI-TOF применением стандартных протоколов (см. рисунок 5). Типичные выходы, полученные путем применения этого протокола, как правило, лежат в диапазоне 30-70%, в зависимости от субстрата.

3. Грунтовка Реакции расширения и TdT полимеризации

  1. 5'-конец маркировка праймера
    1. Смешайте 30 пмоль соответствующей грунтовкой (например, P1, Перечень материалов) с 4 мкл 10х полинуклеотид-киназы (ПНК) буфера, 3 мкл γ-[32 Р]-АТФ, 1 мкл ПНК и DDH 2 O (для Общий объем реакционной смеси 40 мкл). Инкубируют реакционную смесь при 37 ° С в течение 30 мин и затем термически деактивировать киназу (10 мин при 70 ° С).
    2. Во время маркировки реакции подготовкиколонка Sephadex G10, подключив пипетки на 1 мл с силанизированного стекловолокна и заполнение наконечник с G10 раствора (10% в DDH 2 O, автоклавного). Спином вниз и промыть три раза 500 мкл DDH 2 O и одной заключительной промывки 50 мкл DDH 2 O. Запуск реакционной смеси через G10 (чтобы удалить свободный радиоактивную метку).
    3. Гель очистить (стр. 20%) меченые праймер и восстановить путем применения давке и замочить метод (т.е. вымывание с 500 мкл водного раствора, содержащего 1% LiClO 4 и 1 мм Вес нетто 3 (рН 8) при 72 ° С в течение 15 мин). Этанол осадок и G10 опреснения элюированную олигонуклеотида.
  2. Грунтовка реакция расширение
    1. Отжиг 1 пмоль радиоактивно грунтовки P1, 10 пмоль праймера Р1 и 10 пмоль шаблона T1 (перечень материалов) в 10х реакционного буфера (по данным поставщика полимеразы, которые будут использоваться), поместив тUbe в горячей (90-95 ° С) воде и позволяя постепенно остыть до комнатной температуры (через 45 мин).
    2. Поместите пробирку на льду и добавляют (в свою очередь) коктейль дНТФ (содержащий обе модифицированные природные и трифосфатов, 100 мкМ конечная концентрация) и 1 ед ДНК-полимеразы (Vent (экзо -), Кленова, Pwo или 9 ° N м) и в комплекте с водой (в общем реакционном объеме 20 мкл). Инкубируют при оптимальной рабочей температуры фермента (например, 60 ° C в течение 30 мин при Vent (экзо -) используется).
    3. Добавьте 20 мкл стоп-раствора (формамидном (70%), этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA; 50 ммоль), бромфенол синий (0,1%), ксилолцианола (0,1%)), нагреть образцы (95 ° C, 5 мин), прохладно вниз (0 ° С), и разрешить по денатурации гель-электрофореза в полиакриламидном. Визуализация на Phosphorimager.
  3. Полимеризации TdT
    1. Развести 7 пмоль одноцепочечной, Без маркировки праймер Р2 (Перечень материалов), 1 пмоль радиоактивно грунтовки в 1 мкл TdT буфера 10х.
    2. Поместите пробирку на льду и добавляют (в свою очередь) коктейль дНТФ (при адекватной концентрации, составляющей от 10 до 200 мкм) и TdT-полимеразы (4 U). Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Добавить 10 мкл стоп раствора, нагревать образцы (95 ° C, 5 мин), остыть (0 ° C), и разрешить по денатурации гель-электрофореза в полиакриламидном (стр. 15%). Визуализация на Phosphorimager.

4. ПЦР с модифицированных нуклеозидтрифосфатов

  1. Смешайте 8 пмоль прямого и обратного праймеров с 0,5 пмоль шаблона должен быть усилен. Добавить 10x реакции буфер и коктейль дНТФ (для 200 мкм конечной концентрации) и положить трубку на льду. Добавить 1 U ДНК-полимеразы и в комплекте с H 2 O, чтобы достичь конечного объема 20 мкл. Передача смеси в пробирку PCR и выполнять 30 циклов ПЦР.
  2. Развести 6 мкл с 6 мкл 2х буфера для сахарозы и разрешить по агарозы 2% (окрашивали бромистым этидием) электрофореза. Визуализация на Phosphorimager.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модифицированные нуклеозидтрифосфаты которые заманчивые синтетических целей, так как они позволяют легкому введения огромного массива функциональных групп в нуклеиновых кислот 41. Тем не менее, выделение и характеристика этих активированных блоков часто обнаруживается быть трудным. Следовательно, результаты, показанные здесь, как полагают, обеспечивают руку помощи, чтобы следовать различные шаги в рамках вышеупомянутых синтетических и биохимических процедур (рис. 1б).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Включение модификаций в нуклеиновые кислоты представляет интерес для многочисленных практических приложений, включая разработку антисмысловых и антигенных агентов 42,43, маркировки и функциональной мечения олигонуклеотидов 41, а также в усилиях по расширению генетический алфавит 44-46. Химические изменения и функциональные группы, как правило, вводят в нуклеиновых кислот путем применения стандартных и автоматизированных протоколов синтеза твердофазных. Тем не менее, фосфорамидита строите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (гранты N ° PZ00P2_126430 / 1 и PZ00P2_144595). Профессор С. Leumann выражает искреннюю признательность за предоставление лабораторного помещения и оборудование, а также за постоянную поддержку. Г-жа Сью Кнехт признается за плодотворные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пирофосфат трибутиламмония Sigma AldrichP8533Гигроскопичное твердое вещество, хранить под Ar
2-Хлор-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он Sigma Aldrich324124Влагочувствительный
пиридинSigma Aldrich82704Под молекулярные сита
DioxaneSigma Aldrich296309Под молекулярными ситами
Dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Под молекулярными ситами
Acetonitrile Fisher ScientificВЭЖХ
ТриэтиламинSigma Aldrich90342
ТрибутиламинSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qдеионизированная и очищенная вода, автоклавированная в присутствии диэтилпирокарбоната (DEPC)
Диэтилпирокарбонат (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) ДНК-полимеразаNEBM0257S
ДНК-полимераза I, большой (Кленов) фрагментNEBMO210S
9° Nm ДНК-полимеразаNEBMO260S
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT)PromegaM828A
Pwo ДНК-полимеразаPeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Акриламид/бисакриламид (19:1, 40%)Serva10679.01
АгарозаАполлон СайнтишBIA1177
G10 СефадексСигмаG10120
МочевинаАполлон СайнчBIU4110
Юпитер полупрепаративная РП-ВЭЖХ колонка (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
флаконы для ПЦРBioconcept3220-00
система ВЭЖХAmersham Pharmacia BiotechÄ kta basic 10/100
Все олигонуклеотиды были приобретены у Microsynth и очищены PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Более подробную информацию об экспериментальных процедурах и оборудовании можно найти в следующих статьях:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Биомол. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F
марки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TdTMALDI

Похожие статьи