Многокомпонентные белковые комплексы играют важнейшую роль в процессе клеточного функции и развития. Здесь мы описываем способ, используемый для изоляции нативные белковые комплексы из эмбрионов Drosophila после сшивания в естественных условиях с последующей очисткой сшитых комплексов для последующего анализа структуры и функции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие клеточные процессы управляются мультисубъединичных белковых комплексов. Часто эти комплексы образуют временно и требуют родную среду собираться. Поэтому идентифицировать эти функциональных белковых комплексов важно стабилизации им в естественных лизиса до и последующем очистки. Здесь мы опишем метод, используемый для выделения больших добросовестных белковые комплексы из эмбрионов дрозофилы. Этот метод основан на эмбриона проницаемости и стабилизации комплексов внутри эмбрионов в естественных условиях по сшивки с использованием низкую концентрацию формальдегида, который может легко через клеточную мембрану. Затем белковый комплекс, представляющий интерес, иммунологически последующей гелевой очисткой и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Проиллюстрируем этот метод, используя очистку белкового комплекса Tudor, что очень важно для развития зародышевой линии. Тудор большой белок, который содержит несколько доменов Тудор - маленькиймодулей, которые взаимодействуют с метилированных аргинина или лизина целевых белков. Этот способ может быть адаптирован для выделения нативных белковых комплексов из различных организмов и тканей.
Введение
Выделение мультисубъединичных белковых агрегатов и ДНК-или РНК-белковых комплексов выполняется для выявления белковых комплексов, геномной локусов признанный ДНК-связывающих регуляторных белков или РНК-мишеней РНК-связывающих белков. Различные методы позволяют генома выявления участков ДНК, признанных факторов транскрипции или белков хроматина (чип-SEQ) 1 и РНК-мишеней, связанных с данным РНК-связывающего белка (CLIP-след) 2. Библиотеки РНК, полученных кДНК или целей ДНК затем глубоко секвенировали. Эти методы используют химическую или ультрафиолетовым излучением сшивания для стабилизации комплексов с последующим иммунопреципитации (IP) с антите....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка большая яблочный сок-агаром
- Чтобы 4 пластины, добавить 375 мл Н 2 О, 11.25 г летучей агар и мешалку, чтобы колбу 1000 мл. Это Mix А. автоклав Mix с крышкой колбу неплотно закрывают на один цикл 30 мин-стерилизации жидких товаров.
- Добавить 125 мл яблочного сока, 12,5 г столового сахара и мешалку в 500 мл стакан. Это Смесь Б. тепловой Mix B в нагретую платформу при перемешивании а поддерживать температуру ° приблизительно 70 C пока автоклавирование смешивать никогда закончено.
- После завершения Mix автоклаве, трансфер Mix B Смешать А. Продолжайте размешивать комбинированную смесь аккуратно и дайте ему остыть в тече....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эффективность сшивки и успешное очистка сшитого белкового комплекса Туд анализировали с помощью SDS-PAGE на 3% - 7% геле (шаг, показанном на фиг.1) с последующим вестерн-блоттинга (фиг. 2).
Цель с помощью 3% - 7% шага гель на основе эффективного разделения сшитого белкового комплекса Туд от остающегося несшитых белка Туд и концентрации комплекса. По нашим в естественных условиях, упомянутых выше условиях сшивания, большая часть Туд белка может по-пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Формальдегид широко применяется в качестве сшивающего реагента для выявления белок-белковых взаимодействий и белок-нуклеиновая кислота. Его хорошую растворимость и проницаемость клеточной мембраны вместе с совместимостью с процедурами ниже по течению масс-спектрометрии, чтобы формальдегид идеальным кандидатом агент для сшивания внутриклеточных приложений 3,15-17. В частности, он был успешно использован для идентификации мРНК, связанные с Vasa, критической зародышевых клеток РНК геликазы у дрозофилы <.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Иордания Дэвис, Яньнянь Лин, Эрик Schädler и Jimiao Чжэн за техническую помощь в этом исследовании. Эта работа была поддержана NSF КАРЬЕРА предоставить MCB-1054962 для ALA
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Не подвергайте смесь воды и агара автоклавированию в течение длительного периода времени, так как это приведет к тому, что пластины яблочного сока станут хрупкими |
| Метил-4-гидроксибензоат | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Другое название: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff ( http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Мелкая нейлоновая сетка | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | При изготовлении корзины для сбора отрежьте сетку немного больше отверстия колышка трубки для обеспечения плотного прилегания |
| гомогенизатора Dounce | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Охладите гомогенизатор на льду и предварительно промойте его холодным лизисным буфером перед использованием, чтобы предотвратить деградацию белка |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS может быть использован для приготовления концентрированного стокового раствора ингибитора протеазы |
| Анти-ГК агарозные гранулы | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | В набор также входят ГК-пептид и спиновые колонки |
| ГК-пептид | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Приготовьте до 2 мг/мл с PBS |
| Спиновая колонна | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Спиновые колонки входят в комплект |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Гептан | Фишера Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Разбавить с 10X до 1X наночистой водой перед использованием |
| Формальдегид | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Глицин | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Мочевина | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Фенилметансульфонилфторид | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Приготовьте 200 мМ стоковый раствор в изопропаноле, затем разбавьте до рабочей концентрации 2 мМ в буфере для лизиса |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| Пробирки 15 мл | США Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Отбеливатель | марки | Разбавьте равным объемом наночистой воды для получения 50% отбеливателя | |
| 50 мл пробирки | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp | )352098 | |
| Верхний слой сита | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Сито нижнего слоя | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
Ссылки
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Meth....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
