Методическая статья

В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

16.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 апреля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

В этой статье

Краткое содержание

Многокомпонентные белковые комплексы играют важнейшую роль в процессе клеточного функции и развития. Здесь мы описываем способ, используемый для изоляции нативные белковые комплексы из эмбрионов Drosophila после сшивания в естественных условиях с последующей очисткой сшитых комплексов для последующего анализа структуры и функции.

Аннотация

Многие клеточные процессы управляются мультисубъединичных белковых комплексов. Часто эти комплексы образуют временно и требуют родную среду собираться. Поэтому идентифицировать эти функциональных белковых комплексов важно стабилизации им в естественных лизиса до и последующем очистки. Здесь мы опишем метод, используемый для выделения больших добросовестных белковые комплексы из эмбрионов дрозофилы. Этот метод основан на эмбриона проницаемости и стабилизации комплексов внутри эмбрионов в естественных условиях по сшивки с использованием низкую концентрацию формальдегида, который может легко через клеточную мембрану. Затем белковый комплекс, представляющий интерес, иммунологически последующей гелевой очисткой и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Проиллюстрируем этот метод, используя очистку белкового комплекса Tudor, что очень важно для развития зародышевой линии. Тудор большой белок, который содержит несколько доменов Тудор - маленькиймодулей, которые взаимодействуют с метилированных аргинина или лизина целевых белков. Этот способ может быть адаптирован для выделения нативных белковых комплексов из различных организмов и тканей.

Введение

Выделение мультисубъединичных белковых агрегатов и ДНК-или РНК-белковых комплексов выполняется для выявления белковых комплексов, геномной локусов признанный ДНК-связывающих регуляторных белков или РНК-мишеней РНК-связывающих белков. Различные методы позволяют генома выявления участков ДНК, признанных факторов транскрипции или белков хроматина (чип-SEQ) 1 и РНК-мишеней, связанных с данным РНК-связывающего белка (CLIP-след) 2. Библиотеки РНК, полученных кДНК или целей ДНК затем глубоко секвенировали. Эти методы используют химическую или ультрафиолетовым излучением сшивания для стабилизации комплексов с последующим иммунопреципитации (IP) с антителом против белкового компонента исследуемого комплекса.

Во время развития организма, многие белковые комплексы образуют временно. Поэтому, крайне важно проанализировать состав и функции этих комплексов в естественных условиях, чтобы понять молекулярные механизмы, которые управляют Development. Такой анализ в естественных условиях было бы лучше, экстракорпоральное подхода в так как практически невозможно воспроизвести родной концентрации взаимодействующих компонентов и сотовой биохимической среде в пробирке. Здесь мы продемонстрировать естественных условиях подход в том, что мы успешно использовать для изоляции больших белковых комплексов из эмбрионов дрозофилы. В этом способе белковые комплексы в живых эмбрионов сшиты с низкой концентрацией формальдегида и впоследствии белковые комплексы, представляющие интерес, выделяют IP с антителом против известного компонента комплексов с последующим очисткой на геле комплексов и масс-спектрометрического анализа в идентифицировать неизвестные сложные компоненты. Так как формальдегид способен проникать через клеточную мембрану и имеет сшивающий спектр 2,3-2,7 A 3, белковые комплексы могут быть сшиты в естественных условиях и сложные компоненты, вероятно, будут близки друг к другу. В этой статье мыописать этот метод, используя изоляцию Тудор (Tud) белкового комплекса в качестве примера. Tud является зародышевой линии белок, который имеет важное значение для развития зародышевой линии 4-7. Этот белок содержит 11 TUD домены известных взаимодействовать с метилированных аргинина или лизина других полипептидов 8-10.

Ранее мы сформировали трансгенного Drosophila линию, выражающую HA-меткой функциональная Tud 5 и поэтому, конкретных анти-HA антитела используется для снести TUD комплекс после сшивания.

В дополнение к белок-белковых сшивок, формальдегид может генерировать нуклеиновых кислот белковых сшивок и используется в чип-след экспериментов. Кроме того, у дрозофилы, в естественных условиях сшивания с формальдегидом позволило выявить РНК цели Васа РНК геликазы белка 11.

В то время как в этой статье мы опишем метод в естественных условиях сшивки и пурфикация белковых комплексов из эмбрионов Drosophila, этот метод может быть адаптирован для других организмов и тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка большая яблочный сок-агаром

  1. Чтобы 4 пластины, добавить 375 мл Н 2 О, 11.25 г летучей агар и мешалку, чтобы колбу 1000 мл. Это Mix А. автоклав Mix с крышкой колбу неплотно закрывают на один цикл 30 мин-стерилизации жидких товаров.
  2. Добавить 125 мл яблочного сока, 12,5 г столового сахара и мешалку в 500 мл стакан. Это Смесь Б. тепловой Mix B в нагретую платформу при перемешивании а поддерживать температуру ° приблизительно 70 C пока автоклавирование смешивать никогда закончено.
  3. После завершения Mix автоклаве, трансфер Mix B Смешать А. Продолжайте размешивать комбинированную смесь аккуратно и дайте ему остыть в течение 15 минут. Избегать чрезмерно охлаждения и затвердевания агара в результате перед добавлением консерванта.
  4. Сделать 10% (масса / объем) метил-4-гидроксибензоата раствор в этаноле. Это будет действовать в качестве консерванта. Добавить 3,75 мл раствора к вышеуказанному яблочный сок-агар смеси. Продолжайте размешивать для соседнийг 5 мин.
  5. Налейте 125 мл яблочного сока-агар смеси с консервантом в каждой 300 см 2 пластика или пенополистирола пластины. Пусть ему остыть до комнатной температуры и затвердеть. Избегайте формирования пузырьков воздуха при заливке.
    Примечание: яблочный сок-агаром готовы сразу же использовать. Обложка неиспользуемые пластины с четкими обертывания и хранить при температуре 4 ° С в течение до недели.

2. Дрозофилы эмбрионов и Pre-сшивки Лечение

  1. Загрузите клетку населения с примерно 40.000 до 50.000 мух, из которых будут собраны эмбрионы.
  2. Сделать две тарелки каждый из которых содержит 125 мл стандартных фуражное зерно-патоки среднего 12 и посыпать примерно 4 г дрожжей сушат пекаря на каждой пластине. Поместите эти пластины в клетку населения в 25 ° C инкубаторе в течение 48 часов, чтобы откормить мух.
  3. Теплые 2 яблочный сок-агаром до 25 ° С. Посыпать примерно 1 г дрожжей сушат пекаря на каждомпластина. Поместите 2 тарелки в клетке населения, чтобы начать собирать 0-1 HR-старый эмбрионов.
  4. Вынуть пластины в конце сбора 1 час. Замените 2 новых пластин, если другой раунд сбора не требуется.
  5. Добавить достаточно воды, чтобы покрыть пластины и ресуспендируйте эмбрионов осторожно тонкой кистью. Налейте ресуспендированные эмбрионов через два слоя сито, изготовленные из нержавеющей стали проволочной сетки.
    Примечание: Верхний слой изготовлен из среднего размера пор (850 мкм) сетки, который собирает большую часть мух, позволяя через эмбрионов. Нижний слой сделан из мелкой сеткой (75 мкм), который собирает эмбрионов, позволяя через дрожжей и воды.
  6. Используйте тонкую кисть, чтобы передать собранные эмбрионов в корзину для сбора, полученного с 50 мл трубки и тонкой нейлоновой сетки. Промыть эмбрионы кратко водой, затем промокните сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
  7. Погрузитесь эмбрионов в 50% гипохлоритом натрия с нежным закрученного в течение 3 мин. Промыть тщательнолы с водой для удаления остатков отбеливателя. Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
  8. Погрузите dechorionated эмбрионов в изопропанола при легком помешивании в течение 15 сек или до пробоя нескольких эмбрионов сгустки (это не должно занять больше времени, чем 30 сек). Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы полностью высохнуть.
  9. Погрузитесь эмбрионов в гептана в течение 5 мин, пока с помощью пипетки, чтобы поток гептан за эмбрионов, чтобы держать их Ресуспендированный. Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
  10. Промыть эмбрионы с потоками забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4 (PBS), содержащим 0,1% Тритон Х-100 (PBST) в течение 3 мин.
  11. Разберите корзины сбора и передачи эмбрионов вместе с сеткой в ​​15 мл пробирку, содержащую 10 мл PBST. Переверните пробирку осторожно мыть эмбрионов от сетки.
  12. Удалить сетку из трубки. Поместите трубки в вертикальном положении, и пусть эмбрионы опускаются на дно трубки под действием силы тяжести.
    Примечание Приблизительно 100 - 300мкл эмбрионов, как ожидается, для коллекции 1 час от одной клетки.
  13. Снимите PBST и продолжать выполнять сшивания сразу.

3. В естественных условиях Сшивание Сборник эмбрионов

  1. Подготовка 0,2% формальдегида в PBST непосредственно перед использованием. Добавьте 10 мл формальдегида фиксатором для эмбрионов и инкубировать при 25 ° С при осторожном перемешивании на роторном шейкере в течение 10 мин. Отбросить неиспользуемые фиксатор к концу дня.
  2. Quench реакцию сшивания
    1. В конце сшивки, пусть эмбрионы опускаются на дно пробирки.
    2. Снимите раствор формальдегида. Сразу добавляют 10 мл 0,25 М глицина в PBST для гашения реакции сшивания. Инкубируют при 25 ° С при осторожном перемешивании на роторном шейкере в течение 5 мин.
    3. Пусть эмбрионы опускаются на дно пробирки. Снимите закалки решение. Вымойте эмбрионов с 10 мл PBST три раза.
    4. Полностью удалить рBST промывочного раствора с помощью пипетки. Магазин эмбрионы при -80 ° С до использования.

4. Белок Подготовка образцов и Иммунопреципитация

  1. Однородный 500 мкл сшитые эмбрионов с использованием гомогенизатора Даунса в 2 мл лизирующего буфера (0,5 М мочевины, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 мМ фенилметансульфонилфторид [PMSF] и коктейль ингибиторов протеаз в PBS).
    Примечание: Выполните это и следующие шаги при комнатной температуре, если не указано иное.
  2. Перенести лизата до 1,5 мл центрифужные пробирки и осторожно встряхнуть на вращающейся платформе в течение 15 мин, чтобы обеспечить тщательное лизис. Центрифуга лизат при 16000 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток. Сохранить супернатант в чистую пробирку 15 мл.
  3. Добавить 40 мкл анти-HA агарозы суспензии к супернатанту и инкубировать на вращающейся платформе в течение 2,5 часов.
  4. Гранул шарики центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант, но оставить соответствуюximately 250 мкл в трубке. Ресуспендируют бусины в оставшейся супернатанта и трансфер в спин колонки 1.5 мл с пор фильтра 10 мкм.
  5. Центрифуга столбец отжима при 12000 мкг в течение 10 сек и отбросить поток через.
  6. Промыть шарики путем добавления 200 мкл промывочного буфера (0,1 М глицина, 1 М NaCl, 1% Igepal CA-630, 0,1% Твин-20, в PBS). Центрифуга столбец при 12000 мкг в течение 10 сек и выбросьте стирки. Повторите стирке еще два раза.
  7. Добавить 40 мкл буфера для элюции (2 мг / мл HA-пептид в PBS) с гранулами и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин при осторожном перемешивании каждые 5 мин. Центрифуга столбец при 12000 мкг в течение 10 сек и собирать элюата.
  8. Подтвердите вымывание комплекса по Вестерн-блот анализ с использованием анти-HA антитела 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность сшивки и успешное очистка сшитого белкового комплекса Туд анализировали с помощью SDS-PAGE на 3% - 7% геле (шаг, показанном на фиг.1) с последующим вестерн-блоттинга (фиг. 2).

Цель с помощью 3% - 7% шага гель на основе эффективного разделения сшитого белкового комплекса Туд от остающегося несшитых белка Туд и концентрации комплекса. По нашим в естественных условиях, упомянутых выше условиях сшивания, большая часть Туд белка может по-пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Формальдегид широко применяется в качестве сшивающего реагента для выявления белок-белковых взаимодействий и белок-нуклеиновая кислота. Его хорошую растворимость и проницаемость клеточной мембраны вместе с совместимостью с процедурами ниже по течению масс-спектрометрии, чтобы формальдегид идеальным кандидатом агент для сшивания внутриклеточных приложений 3,15-17. В частности, он был успешно использован для идентификации мРНК, связанные с Vasa, критической зародышевых клеток РНК геликазы у дрозофилы <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Иордания Дэвис, Яньнянь Лин, Эрик Schädler и Jimiao Чжэн за техническую помощь в этом исследовании. Эта работа была поддержана NSF КАРЬЕРА предоставить MCB-1054962 для ALA

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Не подвергайте смесь воды и агара автоклавированию в течение длительного периода времени, так как это приведет к тому, что пластины яблочного сока станут хрупкими
Метил-4-гидроксибензоатSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Другое название: TEGOSEPT
Population cageFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
Мелкая нейлоновая сеткаFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102При изготовлении корзины для сбора отрежьте сетку немного больше отверстия колышка трубки для обеспечения плотного прилегания
гомогенизатора DounceSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETОхладите гомогенизатор на льду и предварительно промойте его холодным лизисным буфером перед использованием, чтобы предотвратить деградацию белка
Коктейль ингибиторов протеазы Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS может быть использован для приготовления концентрированного стокового раствора ингибитора протеазы
Анти-ГК агарозные гранулыMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8В набор также входят ГК-пептид и спиновые колонки
ГК-пептидMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Приготовьте до 2 мг/мл с PBS 
Спиновая колоннаMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Спиновые колонки входят в комплект
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
ГептанФишера Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Разбавить с 10X до 1X наночистой водой перед использованием
ФормальдегидFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
ГлицинBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
МочевинаBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
ФенилметансульфонилфторидSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GПриготовьте 200 мМ стоковый раствор в изопропаноле, затем разбавьте до рабочей концентрации 2 мМ в буфере для лизиса
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
Пробирки 15 млСША Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
ОтбеливательмаркиРазбавьте равным объемом наночистой воды для получения 50% отбеливателя
50 мл пробиркиBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Верхний слой ситаFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Сито нижнего слояFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324 Clorox

Ссылки

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tudor

Похожие статьи