Долгосрочный Прижизненные Иммунофлуоресценции Визуализация тканей компонентов матрицы с эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии

Краткое содержание

Внеклеточный матрикс подвергается существенной ремоделирования во время заживления ран, воспаления и опухолей. Мы представляем новый прижизненный подход иммунофлюоресценции микроскопии для визуализации динамику фибриллярных а также сетки, как компоненты матрицы с высоким пространственным и временным разрешением, используя эпифлуоресцентной или двухфотонного микроскопа.

Аннотация

Помимо того, что физическая леса для поддержания тканей морфологию, внеклеточный матрикс (ECM) активно участвует в регуляции функции клеток и тканей в процессе разработки и органов гомеостаза. Он делает это, выступая в через биохимических, биомеханических, и биофизических сигнальных путей, например, через освобождение биологически активных фрагментов ECM белка, регулирующего ткани напряженности и обеспечение пути для миграции клеток. Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли подвергается существенной ремоделирования, характеризующийся деградации, осаждения и организации фибриллярных и не фибриллярных белков матрикса. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может способствовать росту опухоли и инвазии, и вызвать ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов. Живая съемка матричных протеинов, однако, на данный момент ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии, оставляя большую часть компонентов матрицы лargely невидимым. Здесь мы описываем процедуры инокуляции опухоли в тонкой спинного уха кожи, иммунного белков внеклеточного матрикса и прижизненной визуализации открытой ткани в живых мышей с использованием эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии. Наша прижизненный метод визуализации позволяет для прямого обнаружения как фибриллярных и матричных протеинов без фибриллярных в контексте растущей опухоли кожной. Мы показываем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы. Мы также обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли обнаружены с генерации второй гармоники пространственно отличие от недавно депонированных матричных компонентов, таких как тенасцина С. Мы также показали долгосрочные (12 часов) визуализации взаимодействия Т-клеток с опухолевыми клетками и опухолевых клеток миграция вдоль коллагена IV базальной мембраны. Взятые вместе, этот метод позволяет однозначно для одновременного обнаружения опухолевых клеток, их физического микросреды и эндогенного иммунного ответа ткани с течением времени, что может провязь важную информацию о механизмах, лежащих в основе прогрессии опухоли и конечный успех или устойчивость к терапии.

Введение

Прижизненной визуализации воспалительных, метастатических и матричных процессах ремоделирования была важной областью исследований и побудило создание многочисленных трансгенных мышиных моделях репортеров, которые выражают флуоресцентные белки ^1,2. Из-за из фокуса флуоресцентных сигналов, которые снижают качество изображения и пределы проникновения света через ткань, изображения толщиной ткани возможно только с конфокальной или сканирования многофотонное микроскопии ^3. Использование быстрее, менее дорогим и сложным эпифлуоресцентная микроскопии возможно только с почти двумерных тканей, таких как курица CHORIO-аллантоисной мембраны ⁴ или мыши уха дермы ^5. Большинство систем визуализации воспользоваться трансгенных мышей, экспрессирующих различные флуоресцентные белки в зависимости от конкретного типа моды клеток. Даже если эти белки предложить слабый фототоксичность, они индуцируют иммунный ответ ^6. Кроме того, трудно для переключения между специфических клеток подтипов или пометитьИК базальная или активированные государства как такого изменения требует подготовки нового генетической модели. Кроме того, как выражение флуоресцентный белок обычно ограничивается внутриклеточное пространство, обычно не представляется возможным изображения внеклеточных структур, таких как подвал мембранных белков или тканей хемокинов отложений ^7. Вместо этого, косвенное маркировка с антителами против внеклеточных антигенов обеспечивает гибкость для практически любого камерного типа или матрицы конкретного компонента ^8,9. Однако главным недостатком этого подхода маркировки связано с иммунотоксичности опосредованного антиген-антитело иммунных комплексов, которые могут вызвать Система комплемента в зависимости от токсичности клеток и фагоцитоз клеток и внеклеточных структур ^10.

Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли, но и нормальной ткани при воспалении или заживления ран, претерпевает существенную модернизацию. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может промоТе рост и инвазия опухоли из-за стресс-индуцированных сигнальных механизмов и причин ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов ^11. Тем не менее, жить изображений матричных белков ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии. Недавно мы опубликовали новый прижизненный метод визуализации, которая сводит к минимуму риск фото-и иммуно-токсического повреждения отображаемого клеток и тканевых структур ^5. По сравнению с установленными методов визуализации, где один раунд непрерывной прижизненной визуализации находится в диапазоне от 30 минут до 2 часов ^12-17, наша прижизненный иммунофлюоресценции (ИФ) методика позволила 12 часов (долгосрочные ⁸⁾ изображений. Важно отметить, что время визуализации ограничена до 12 часов из-за пределов, определенных в нашем протоколе животных, но нет никаких технических противопоказания, что он не может быть продлен, если критические параметры для здоровья животного, как кровяное давление и сердцеСкорость контролируется ^8. Кроме того, с помощью автоматизированной флуоресценции стереомикроскоп мы смогли собрать изображения с нескольких полей во время одного эксперимента и наблюдали редкие иммунологические и реконструкции процессов, происходивших в физиологическом контексте кожи, поддерживаемой функциональной кровеносных и лимфатических сосудов. Поскольку stereomicroscopic линза имеет относительно большой, 2 см, рабочее расстояние и в отличие от двухфотонных микроскопических оптики не требует испарения воды погружение, долговременные изображений была выполнена только под флуоресцентным стереомикроскопа. Прижизненные если это разрешено иммунную маркировки и обнаружения любого внеклеточного матрикса составляющей нормальной кожи. Конструкция этой техники основано на инновационной концепции использования иммуноокрашивания для живых клеток и матричных ткани элементов на хирургическим подверженных дермы мыши, не вызывая вредные иммунотоксичном воздействии ^5. Сама хирургическая процедура является безопасной в дермусосудистую, поскольку основывается только на принципе разделения двух слоев кожи в ухе, которые независимо иннервируются, автономно питается кровью и осушенных отдельными лимфатических тиражами. Наша экспериментальная установка позволяет изображений из ряда важных патофизиологических событий более не менее 12 часов, включая торговлю лейкоцитов между кровеносных и лимфатических сосудов и заживление ран процессов. В оригинальной публикации, мы сравнили нашу технику, чтобы государством в самых современных стандартов в различных областях прижизненной визуализации. Следовательно, мы наблюдали крови экстравазации сосудов и лимфатические события intravasation различными типами лейкоцитов, в том числе уникальной визуализации иммунных клеток, поступающих сбора вместо ожидаемого начальные лимфатические сосуды ^15. Кроме того, дополняя наблюдения, выполненные другими группами ^9,18, мы обнаружили, что в естественных условиях CCL21 способен образовывать сильные, разрывные отложений на сбор, но лишь изредка на начальных лимфатические сосуды.

Здесь мы опишем модифицированную прижизненной ЕСЛИ техника, которая может сочетаться с двухфотонного микроскопии для обнаружения сеть фибриллярных коллагенов использованием генерации второй гармоники (ГВГ). Показано, что этот метод также может быть использован для инвазии раковых клеток изображения в контексте динамического микроокружения опухоли, который включает молекулы матрикса, такие как тенасцину C, которые в значительной степени неисследованным текущими методов визуализации ^19. Мы обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли, обнаружены с генерации второй гармоники, занимает различные местоположения опухоли микроокружения, чем недавно нанесенной матрицы, составленной из тенасцина С. Кроме того, мы опишем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы, долго- Термин (12 часов) визуализации Т-клеточных взаимодействий с опухолевых клеток и опухолевых клеток миграции вдоль коллагена IV базальной мембраны. Такие события могут быть отображены одновременно записывая местные физиологических параметров, таких как ре кровеносных сосудовrmeability и лимфодренаж.

Протокол

Все процедуры, проводимые на животных были в строгом соответствии с Законом о защите животных швейцарской, постановления о защите животных и Постановления об экспериментов на животных. Мы подтверждаем, что наш уход и использованию животных комитета Институциональная (IACUC), названный Комиссия де видеонаблюдения де l'Etat-де-Во (разрешение номер: 2687), в частности, одобрил это исследование.

1. Прививки опухоли уха

1. Культура B16-F10-GFP клетки меланомы в блюдо 10 см Петри с использованием DMEM + 10% FBS СМИ.
2. Когда клетки составляют 80-90% сливной, промойте их PBS и снять их трипсинизацией. Спин вниз клетки при 1500 х г в течение 5 мин при 4 ° С, ресуспендируют осадок в 1 мл раствора Рингера и передавать его в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Спин снова и удалить все супернатант кроме тонким слоем среды, которая остается только над осадком. Ресуспендируют клеток в конечном итоге с толстым клеток суспензии.
3. Обезболить мышь смесью кетамин / dorbene [медетомидин] (75mg/kg-1mg/kg) и убедитесь, что животное достаточно наркозом, выполняя нежный ног щепотку. Увеличение концентрации ИФ с шагом 0,1% в движениях случае наблюдаются (например вывод лапы). Держите мышь на прямой термистора контролируется грелку (37 ° C) в течение всей процедуры и защищать свои глаза с соответствующим глазной мази.
4. Подготовка шприца Гамильтона (33 G иглу, 10 мл шприц объем). Извлеките наконечник колпачок с иглы и загрузить 20 мкл клеточной суспензии в верхней части наконечника камеры. Потяните поршень до 5 мл суспензии не загружен внутри шприца. Удаление избытка суспензии из наконечника камеры и закрыть крышку наконечника.
5. Использование клейкой ленты, исправить проксимальный край уха на кончике указательного пальца. В углом 45 °, медленно вставьте иглу шприца Hamilton между спинной дермы и хряща. Оказавшись внутри, проникнуть в ухо проксимальнее дистальной течение 2-3 мм. Примечание: Процедура инъекции клеток должно быть сделано обученным и сертифицированным специалистом. Кроме того, этот процесс должен быть выполнять медленно и в следующей последовательности: первый игла должны быть размещены горизонтально на кожу уха и вставить медленно в ухо дермы. Как только и только тогда конец иглы в кожу, поршень должна быть нажата. При нажатии плунжера будет инициировать клеток прививку в коже. В том маловероятном случае иглы, проходящей два слоя уха дермы, слоя хряща и проникает в кожу лица, выполняющего эксперимент, боль, причиненный экспериментатор пальцем следует рассматривать как тревожный знак и привести к немедленному опровержение иглы из кожи экспериментатор. В этом случае поршень не должна быть нажата и кожа должны быть стерилизованы с алкоголем. Кроме того, неодушевленный объект вместо пальца можно использовать для стабилизации ухо.
6. Введите суспензии 3 мкл клеток и медленно втянуть иглу из уха.Пусть опухолевые клетки образуют твердую опухоль в течение 7-9 дней и последующей рост опухоли с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.
7. Кроме того, следить за ранние этапы взаимодействия опухолевых клеток с матрицей ткани, применяется 50 мкл 100000 опухолевых клеток, взвешенных в растворе Рингера на открытых и окрашенных ушных дермы (после шага 3.3).

2. Ухо хирургии

1. За три дня до эксперимента, брить голову мыши, удалять волосы волосы вокруг головы и уха (10-15 сек) и смыть водой.
2. Обезболить мышь смесью увлажненного кислорода и изофлураном (3-4% индукции, 1-2% техническое обслуживание) и убедитесь, что животное достаточно наркозом, выполняя нежный ног щепотку. Увеличение концентрации ИФ с шагом 0,1% в движениях случае наблюдаются (например вывод лапы). Держите мышь на прямой термистора контролируется грелку (37 ° C) в течение всей процедуры и защищать свои глазанеобходимости глазная мазь.
3. Постройте платформу, сделанную из 8 склеенных стекла гистологии слайдов. Переверните мышь на спину и осторожно положите опухолями уха на стопку стеклах. Используйте небольшие полоски клейкой ленты для фиксации передней и задней кромок уха в стек.
4. Разрежьте брюшной кожи уха вдоль противозавитка ушной раковины мыши с помощью скальпеля. С помощью изогнутых пинцетом, осторожно снимите брюшной дермы и хрящ от спинных дермы, где опухоль была привитых. Снять брюшной кожи и хрящей с изогнутыми щипцами, выставляя спинной дермы. Примечание: Если основные сосуды уха вырезаны или циркуляция крови не возвращается в нормальном потоке в течение 15 мин, ухо не может быть использован для визуализации. Всегда держите открытую кожу уха влажным с помощью буфера Рингера и защищать влажности с помощью покровное.
5. В случае, если постоянное кровотечение опухолевые формы сосудов, остановить кровотечение, добавив 100 мклтромбин (5 ед / мл) в буфере Рингера (102 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 28 мМ лактата натрия) в верхней части уха в течение 5 мин.
6. Промыть ухо два раза приблизительно 5 мл буфера Рингера и удалить больше жидкости стерильными салфетками. Сразу приступить к следующему шагу (не позволяйте открытым ухо сухой в любой момент!).

3. Иммунофлуоресценции Окрашивание

Использовать буфер Рингера с добавлением человеческой сыворотки (1:10), мышь поликлональной вторичным антителом к ​​IgG человека (1:50) и 125 МЕ / мл (2,5 мг / мл апротинина) (блокирующем буфере) в течение всех этапов окрашивания. Апротинин ингибирует плазмин содействие коагуляции ограничить первоначальный кровотечение, которое может произойти после операции.

1. Сложите часть уха с открытыми дермы в eminentia раковин и высушите внешние неоткрытые дермы уха стерильными салфетками. Остановите ухо на стопку стекло, применяя 0,5 мкл хирургического клея к передней и задней тыльных поверхностей стопл края. Затем, аккуратно расправьте уха дермы спинные на стекло.
2. Применение первичных антител ориентации внеклеточные матричные молекулы в концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 100 мкл блокирующего буфера к открытой уха. Накройте ухо покровным в целях предотвращения красящего раствора для просушки на ухо краев. Инкубировать в течение 15 мин. Вымойте ухо два раза примерно с 5 мл буфера Рингера.
3. Применение соответствующих вторичных антител или стрептавидин конъюгатов (флуорофоров с высокой длины волны возбуждения, таких как 594 нм или 647 нм благоприятны для прижизненной визуализации) в концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 100 мкл блокирующего буфера к открытой уха. Накройте ухо покровным и инкубировать в течение 15 мин. Вымойте ухо два раза примерно с 5 мл буфера Рингера.

4. Взаимодействие с кровью активированных спленоцитах с опухолевыми клетками в месте

1. 7 дней после inoculatioп-GFP меланомы В16-F10 на заднем кожи конгенных мыши, эвтаназии животных и собирать селезенки. Изолировать спленоцитам с механическим разрушением селезенки через ситечко 70 мкм клетки.
2. Этикетка спленоциты в течение 8 мин при 37 ° С с Red CMTPX цитоплазме клеток красителем (1 мкМ в PBS), мыть 4 раза в 15 мл при 4 ° С и сразу же вводить с свободной среде 200 мкл сыворотки в хвостовую вену мыши, чьи уши были засевают B16-F10-GFP 7 дней ранее.

5. Прижизненной визуализации с помощью стереомикроскопа

1. Для кратковременного томографии (до 2 ч), добавьте свежеприготовленный стерильный буфер аскорбат-Рингера, содержащий 140 мМ аскорбата натрия, 10 мМ HEPES, 4 мМ KCl и 5 мМ CaCl _2, при рН 7,5 (буфер финале аскорбат-Рингера осмолярность 320 мОсм) в верхней части с иммобилизованным уха. Накройте ухо покровным и начать визуализацию с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с 2X объективом.
2. Для долгосрочного изображений(Более 2 ч), поместите выход иглы (подключенного с резервуаром, содержащим буфер аскорбат-Рингера) под покровное, около 0,5 см от уха. С помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мкл / мин постоянно доставлять буфер аскорбат-Рингера в камеру под покровное.
3. Измените 1X объектив (рабочее расстояние 6 см) до 2X объективом (рабочее расстояние 2 см). Откройте программу приобретения и настройки параметров флуоресцентного стереомикроскопа. В камере, выберите 12 бит, как глубина цвета изображения и отрегулировать камеры спектр серого значений от 0% (минимум) до 5,1% (максимум) и установить гамма-коррекции до 2.
   1. Установите усиление приобретение до 1 (минимум), интенсивности флуоресценции до 1000 (максимум), увеличением, установленным в 280x-320X и регулировать время экспозиции предотвращения чрезмерного или недостаточного воздействия (время экспозиции должно быть не менее 1 сек). В зависимости от количества полей изображений (обычно от 10 до 20), интервал времени для цикла сбора должен быть установлен бытьТвин с 1 по 2 мин. Сократить время может привести к отбеливанию и фототоксичность.
4. Выберите несколько полей, которые содержат опухолевые клетки, а также окрашенные ECM белков (например, на рисунке 3). Использование моторизованный этап, получить изображения соответствующих флуоресцентных каналов (например, GFP и флуорофором 647 на рисунке 3) в течение долгого времени (например, раз в 2 мин).
5. После эксперимента, усыпить мышь в соответствии с ведомственным руководящим принципам животных. В этом случае в конце эксперимента, эвтаназии анестезированных мышь цервикальным сдвигом с последующей путем обескровливания (внутрисердечного перфузии).

6. Прижизненной визуализации с помощью многофотонном микроскоп

1. Использование силиконовую смазку, строить круговую стенку около 2 см в диаметре и высотой 2-3 мм вокруг уха, начиная с основания уха. Убедитесь в том, нет утечкой точки. Заполните круг с буфером аскорбат-Рингера.
2. Место мышина сцене и подключить грелку (37 ° С).
3. Открытое программное обеспечение приобретения и настройки параметров многофотонном микроскопом.
4. Выберите до четырех различных полей, содержащих опухолевые клетки и окрашенные белки ECM (например, на рисунке 3). В этом примере настройки лазера Ti-сапфир до 850 нм для GFP сигнал последующего один фотон 647 для флуорофором 647 окрашивания и визуализации фибриллярные коллагены с ГВГ. Получение изображений из соответствующих флуоресцентных каналов (например, GFP и флуорофором 647 на рисунке 3) и генерации второй гармоники с течением времени, например, каждые 2 мин, с погружением в воду HCX APO 20X с 1,00 NA объектива и 2 мм рабочее расстояние.
5. После эксперимента, усыпить наркозом мышь с цервикальным сдвигом с последующей обескровливания (внутрисердечное перфузии).

Результаты

На сегодняшний день, иммуноокрашивание в живой ткани обычно не используется в связи с образованием иммунных комплексов, приводящих к высокой окрашивания фона и иммунотоксичности ^20. Это был преодолен путем предварительного блокирования Fcγ рецепторы на тканевых макрофагов, таким образом, "ослепляя" эти клетки к последующему косвенного сильной иммунной окраски. Как было маркировка внеклеточный, фототоксичность и флуорофор отбеливание можно контролировать путем погружения ткани в природный антиоксидант буферный, isosmotic аскорбиновой кислоты (Фиг.1А). С нашей начальной Описание этого метода ^5, мы улучшили нашу анти-отбеливающий и анти-фототоксических технику так, чтобы фотообесцвечивания теперь может быть запрещена не только, но полностью предотвратить (рис. 1В). Это делается путем встраивания в ухо в большом объеме антиоксиданта (100 мкл) в камере, где ухо иммобилизованного. Обратите внимание, что время 300 секунд постоянной изображений соответствует 10 часов визуализации, когда картинысобраны для 500 мс каждую минуту (средние настройки визуализации).

Рисунок 1. Фотообесцвечивание и фототоксичность был остановлен замен с аскорбата в буфере Рингера и встраивания подвергается ухо в 100 мкл объем этого раствора. (A) Ткань окрашивали с первым биотинилированного антитела против коллагена IV, компонента базальной мембраны. Окрашивание позже обнаружен со стрептавидин-647 (красный), а затем постоянно изображается в течение 300 секунд в любом буфере нормального Рингера (верхняя панель) или аскорбиновая кислота-Рингера (нижней панели) в. Обратите внимание, что 300 секунд постоянная времени изображения соответствует 10 часов визуализации, когда картины собраны в течение 500 мс каждую минуту (обычные настройки визуализации). Самая яркая 25% пизначения интенсивности XEL зеленые цвета. (B) Количественный анализ иммунофлюоресценции распада (50% в сравнению Рингера 0% в аскорбат-Рингера). Значения были нормализованы к начальной флуоресценции. Изображения, полученные с иммунофлюоресценции стереомикроскопом. Бар Масштаб в А, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Исследуя взаимодействие между метастатических клеток опухоли и опухоли стромы важно понять процесс миграции клеток опухоли и опухоли иммунитета. Это потому, что опухоль-ассоциированных стромы составляет до 90% от массы опухоли и активно регулирует рост опухоли и метастазирования ^21. Тем не менее, механистический понимание, как миграция матричные диски опухолевых клеток к любой лимфатической или кровеносных сосудов не хватает ^22. Это частично обусловлено тем, что им прижизненнойстарение матричных протеинов ограничивается визуализации созрели волокон фибриллярных коллагенов использованием генерации второй гармоники в двухфотонного микроскопии ^23. Таким образом, мы адаптировали наш метод для визуализации ткани микросреды в том числе кровеносных и лимфатических сосудов, перицитами, нервов, мышц и адипоциты чтобы включить в него прямой визуализации компонентов внеклеточного матрикса. Многие структуры можно выделить на основе их морфологии после иммуноокрашивания для подвальных компонентов мембранных таких как коллаген IV или перлекана (рис. 2а), впрочем, прямого окрашивания для конкретных маркеров клеточной поверхности, например Lyve1 (рис. 2В и С) и podoplanin (рис. . 2C), в дальнейшем позволяет различать начальные, капиллярных лимфатических (Lyve1 ⁺⁾ от лимфатических коллекторов (Lyve1 ^-). Окрашивание для матрицы с привязкой CCL21 в коже показало, залежи этого хемокином на базальной мембраны лимфатических коллекторов язьntified с окрашиванием для перлекана, в гепаран протеогликан сульфата (рис. 2D).

Рисунок 2. Примеры живой окрашивания в нормальном уши мыши. (А) Окрашивание для перлекана, компонент базальной мембраны, изображает все кровеносные и лимфатические сосуды, нервы, мышечные волокна и адипоциты. (В) окрашивание Lyve1 знаменует начальный лимфатическую капиллярную сеть. (C) Со-окрашивание Lyve1 и podoplanin, пан-лимфатической маркера, изображает сети начальных и собирающих лимфатических сосудов. Спинной уха дермы могут быть отображены с помощью классических эпифлюорисцентной микроскопии (без оптического секционирования), как уха дермы имеет низкое количество адипоцитов, которые могли бы покрыть поле изображения. (D) CCL-21 стаи Нин (зеленый) на лимфатическую базальной мембраны окрашенных для перлекана (красный). Изображения, полученные с иммунофлюоресценции стереомикроскопом. Масштабные бары в А и В, 1 мм; в С, 100 мкм и 50 мкм в D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Самое главное, структурные белки, которые обычно не могут быть обнаружены с помощью ГВГ, классическим методом обнаружения матрица ^23, могут быть визуализированы. Например, мы обнаружили, что тенасцин C (рис. 3а), матричный белок, который экспрессируется во опухолей, заживление ран и воспаления ¹⁹ откладывается в разных местах опухоли стромы, чем фибриллярных коллагенов (рис. 3б). Эта матрица неоднородность может повлиять распределения клеток и метастазирование опухоли (рис. 3в).

т "FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 3. Спинной уха дермы можно жить отображаемого использованием мульти-фотонной микроскопии. Одно поле опухоли B16-F10. Опухоль стромы метили тенасцина C антител и окрашивания был обнаружен с анти-коза-594 осла антитела. Иммунофлуоресценции тенасцина C (красный) сети показана в А и фибриллярные коллагены обнаружены с генерации второй гармоники (SGH) в B. Эти две сети накладываются с опухолевыми клетками (Cyan) в С (объединенной). Новый матричный опухоли отмечен тенасцина С, не дублировали фибриллярных коллагенов обнаруженных с ГВГ (зеленый). Изображение с 44, в четыре раза усредненной Z-секции с г-шаг 1,0 мкм была приобретена в 16-битном режиме глубиной цвета. Изображения, полученные с двухфотонного микроскопа. Шкала бар, 100 мкм.ссылка = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

После иммунного различных компонентов матрикса опухоли (например тенасцина С и коллагена IV) матрицы опухоли мы могли идентифицировать ограничен и внезапные события опухоли матрица направленной ремоделирования (Видео 1). Силы, которые развиваются в опухоли микроокружения может привести к расширения или сжатия матрицы опухоли и в следствие реконструкции и удлинения сосудистую сеть опухоли в такой же степени, как мы показали ранее в случае заживления ран ^11,24.

Видео 1. Расширение матрицы опухоли с надписью с коллагеном IV (красный) и тенасцина C (голубой) удлиненных кровеносные сосуды (стрелка) и пассивно перемещать три опухолевые клетки (зеленые). Локализованная сокращение teascin C богатых опухоли матрицы транслоцируются кровеносного сосуда (красный горизонтально ориентированным Структуре) около 100 мкм в течение 12 часов визуализации. Изображения, полученные с иммунофлюоресценции стереомикроскопом. Нажмите здесь для просмотра ролика.

Использование нескольких фотонов микроскопии с флуорофора маркировки является проблематичным, поскольку поток фотонов используется в этих экспериментах быстро отбелить флуоресцентные красители, которые не защищены от окисления ^25. Здесь мы показываем, что мы можем выполнить двухфотонного покадровой микроскопии одновременно визуализации immunolabeled тенасцина C матрицу с минимальным фотообесцвечивания флуорофоров даже в высокой плотности фотонов двухфотонного микроскопии (Видео 2).

Видео 2. Низкий уровень фотообесцвечивание тенасцина C иммунофлюоресценции (красный) в течение двух-фотонной микроскопии. Опухолевые клетки B16-F10-GFP (Cyan) были обследованы в открытом спинной ухо 9 дней после прививки. Флуоресцентный сигнал был защищен применения аскорбат-Буфера Рингера на изображаемого ткани. Генерация второй гармоники (зеленый) не дублировали новой матрицы, представленной тенасцина C. глубиной цвета 16 бит изображения с 11, четыре раза в среднем Z-секции с г-шаг 1,9 мкм была приобретена в течение 15 мин. Изображения были собраны каждые 1 минуту 5 секунд в 6 Z-плоскостей, собранных. Нажмите здесь для просмотра ролика.

Мы также отображены иммунной клетки взаимодействия с метастатических опухолевых клеток. CMTPX меченные Спленоциты от несущей опухоль мыши из сосудов от опухолеассоциированных кровеносных сосудов через 8 часов после внутривенного переливания, вторглись в матрицу опухоли и активно взаимодействовали с опухолевыми клетками, формируя долговечные мобильные контакты (Видео 2). Флуорофором 647 меченные структуры коллагена IV были устойчивы к фотообесцвечивания в течение 12 часов с изображениями.

Видео 3. Взаимодействие CMTPX-меченых спленоцитами опухоли (B16-F10)-Bколошения мышь с отдельных опухолевых клеток (GFP-B16-F10). Спленоциты IV переливают после ткани окрашивания коллагена IV. Коллаген IV-зеленый (647), Спленоциты-красный (CMTPX), B16-F10 голубой (GFP). Изображения, полученные с иммунофлюоресценции стереомикроскопом. Продолжительность видео 12 часов. Нажмите здесь для просмотра ролика.

Свежевыделенные опухолевые клетки наслаивали на открытых уха дермы предварительно окрашенных для коллагена IV. Мы могли бы заметить, что после присоединения к ткани некоторые группы клеток началось коллективной миграции вдоль базальной мембраны кровеносных сосудов и адипоциты.

Видео 4. Опухолевые клетки мигрируют вдоль базальных мембран. Нормальная кожа уха окрашивают в течение коллагена IV (647, красный) покрывали недавно пассированных B16-F10-GFP клеток и отображаемого в течение 5 часов. Некоторые опухолевые клетки, которые придерживались ткани начали коллективную миграцию вместебазальной мембраны кровеносных сосудов и адипоциты. Изображения, полученные с иммунофлюоресценции стереомикроскопом. Продолжительность видео:. 5 часов Нажмите здесь для просмотра ролика.

Кроме того, поскольку уха дермы практически двумерным, мы легко могли бы собирать большие объемы данных, используя быстрый флуоресценции стереомикроскопия, вместо более медленным и дорогим конфокальной или мультифотонной микроскопии. Тем не менее, это также можно использовать любой из упомянутых методов сканирующей микроскопии с нашим прижизненный ЕСЛИ препараты (рис. 3, Видео 1).

Обсуждение

Значение

Здесь мы представляем новый прижизненный микроскопии подход, позволяющий с высоким разрешением и динамической визуализации различных компонентов тканей микроокружения, в том числе фибриллярных а также сетки, как матричных протеинов. Этот метод имеет несколько преимуществ по сравнению с текущими прижизненных методов визуализации: (я) Прижизненные изображения флуоресценции был использован в микроциркуляции исследований, например, для отслеживания утечки растворенного вещества из крови или в лимфатические сосуды, но не было в сочетании с иммунной окраски. (II) Использование генетически модифицированных репортер мышей позволяет для конкретных типов клеток для включения в образ, но требуется их наличие (или значительные усилия для создания новых) и ограничивает количество взаимодействующих типы клеток, которые могут быть изучены. (III) Внеклеточный матрикс могут быть отображены в естественных условиях с использованием генерации второй гармоники, но эта методика может только обнаружить волокнистых коллагены, в результате чего большое количество важных компонентов внеклеточноготаких как базальных мембран, фибронектины, tenascins, факторы роста, хемокинов и ткани гликозаминогликанов вне досягаемости для современных исследований. Наш метод позволяет преодолеть эти ограничения, и позволяет стандартные методы визуализации, которые будут включены и далее в сочетании с immunostainings для других типов клеток, тканевых структур, месторождений гепаринсульфат связывания факторов роста (например, VEGF ²⁶⁾ и хемокинов (CCL-21 ^5,18 и рис. 2D ), или белки внеклеточного матрикса и одновременно отслеживания крови и / или лимфатические потоков.

Недостатки

Эпифлуоресцентная визуализации прижизненной IF ограничивается тонких кожных лоскутов, лишенных толщиной подкожного слоя (жировой ткани). В то время как мы обнаружили, что спинной уха дермы является оптимальным для относительно безвредны хирургического экспозиции кожи уха, эпифлуоресцентной с прижизненный IF методика не ограничивается уха дермы и потенциально могут быть применены к напроткрытые участки кожи из ног или задней коже новорожденного мыши. Быстрое окрашивание антителом (15 минут) в иммунофлюоресценции ЕСЛИ не зависит от пассивной диффузии, но требует функциональной лимфодренаж и интерстициальный поток жидкости, следовательно, нет окрашивание не может наблюдаться, если лимфатические сосуды поглощаются ^27. В соответствии с этим, лимфатические сосуды пятно сильнее вытекающей сосудистую крови (поврежденные сосуды, артериол) ^5. Разделение спинной и брюшной ушанке кожи является мягким хирургическая процедура, но это вызывает повреждение некоторых капилляров и гибели клеток в различные клетки тканей. Это может быть проблемой, когда нужно исследовать полностью неповрежденной ткани, например, глядя на мягкое воздействие наркотиков на выживание клеток. Также применение антиоксидант, который служит для защиты кожи от фототоксичности и фотообесцвечивания исключает использование прижизненной техники иммунофлюоресценции для изучения например, ткани окислительного стресса или азотной Biolog оксидау.

Наконец, ослепляя макрофагов ткани резидентов с иммунных комплексов может активировать эти клетки и влияние, например, при изучении тканей иммунной реакции и активации дендритных клеток.

Изменения и устранение неисправностей

Для изучения тканей окислительный стресс или азотной биологию оксида, аскорбиновая кислота должна быть заменены другими тканей совместимых носителей, не мешает экспериментальной продукции. Точно так же, блокирующие Fc рецепторы на кожных иммунных клеток следует избегать, если цель исследования заключается функция и активация тканевого иммунного ответа и активации дендритных клеток и миграции. Это может быть сделано с использованием вторичного антитела с Fc-фрагментом расщепленного (F (аb) 2-фрагменты антител) или использование биотинилированного антитела и флуоресцентного стрептавидина в качестве реагентов обнаружения.

Будущие приложения

Мы представляем новый и уникальный интражизненно важным, если метод для изображения компонентов не-фибриллярных внеклеточного матрикса в трансплантации опухолей кожи в сочетании с SHG-обнаруженного фибриллярных и созрели коллагенов, используя двухфотонного микроскопа. Одним из преимуществ использования нескольких фотонов (или конфокальной) микроскопии над изображениями эпифлуоресцентной является г-укладки возможность и в следствие пространственной совместная локализация событий, возникающих на внеклеточного матрикса, например опухоли intravasation в лимфатической или кровеносного сосуда, который в случае Стандарт эпифлуоресцентная микроскопии можно только вывести из морфологических изменений вторжения клетки. Этот метод имеет гораздо более широкий потенциал. Например, мы использовали прижизненной ЕСЛИ чтобы исследовать механизм лимфатической окклюзии по лимфатической конкретных фотодинамической терапии ^27. Дополнительные возможности применения данного способа включают, но не ограничиваются ими исследовании иммунитета кожи во время воспаления, механизма отказа или методов крови и лимфы трансплантата рост судно ATIC во опухолей.

Критические шаги в процедуре

Самый важный шаг, который имеет важные последствия для поддержания физиологического среду ткани является хирургическая разделение брюшной кожи и хряща от спинных дермы. Разрезать или окклюзии основной артерии или вены приведет к чрезмерному кровотечению и местного гипоксии тканей, которые будут влиять на клеточный ответ на лечение и клеточного движения ^8. Иммобилизации ухо хирургического клея должно быть сделано с осторожностью, так как разлив клей на подвергайте ткани вызовет постоянные травмы в ткани окклюзии кровеносных сосудов. Температура мыши необходимо контролировать и выдерживают при 37 ° С Кроме того, увлажненный кислород должен быть использован для изофлуран анестезии, так что глаза и легкие остаться должным образом увлажненный в ходе эксперимента. Кроме того, аскорбат натрия должны быть готовы недавно и его рН проверяется перед использованием.

ntent "> Таким образом, этот прижизненной иммунофлюоресценции мостов в реальном времени, локальные измерения физиологических функций с молекулярной визуализации сложных клеточных событий в коже мыши. Кроме того, этот метод имеет большой потенциал как она может быть легко применен к исследованию, например, после развития механизмы крови и лимфы-ангиогенеза или визуализировать ранние фазы инфекции кожи различными патогенными агентами. Благодаря гибкости и высокой пропускной потенциал, это прижизненный метод может внести существенный вклад в нескольких областях биологии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышей штамма
BALB/C мышей (8-12 недель) Чарльз	Ривер Орлеан		, Франция
C57/Bl6 Мыши (8-12 недель)	Харлан		Каршалтон
Великобритания Клеточная линия
B16 F10 Меланома, экспрессирующая OVA-GFP
Поддержание анестезии
Изофторан	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Буффало, штат Нью-Йорк
Увлажненная система доставки	Rothhacher GmBH		Berne, Швейцария
Система контроля температуры постоянного тока	FHC Inc		Боуден, Массачусетс
Стереомикроскоп
Флуоресцентный стереомикроскоп с моторизованным предметным столиком.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Вецлар, Германия
1X объектив (линейное увеличение системы от 7,5X до 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Германия
2X объектив (линейное увеличение от 15,6X до 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Германия
Камера DFC 350 FX под управлением программного обеспечения LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Вецлар, Германия
Многофотонная микроскопия
LEICA SP5, двухфотонный умножитель, моторизованная сцена	Leica Microsystems CMS GmbH		Вецлар, Германия
HCX APO 20X/1.2 масляный иммерсионный
Ультра лазер «Хамелеон»
Буфер Рингера (102 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl<суб>2, 28 мМ лактат натрия)	B. Braun Medical AG	445968	Земпах, Германия
Апротинин	Elastin	AP92	Оуэнсвилль, Миссури
Тромбин	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Тауфкирхен, Германия
Аскорбат натрия	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Германия
Сыворотка мыши, выращенная против человеческого IgG	Abcam	ab34834	Кембридж,
Великобритания Коллаген IV	Abcam	AB6581	Кембридж, Великобритания
Perlacan	RnD	ab79465	Миннеаполис, Миннесота
Tenascin C	RnD	AF3358	Миннеаполис, Миннесота
Подопланин	RnD	AF3244	Миннеаполис, Миннесота
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Германия
CCL21	RnD	AF457	Миннеаполис, Миннесота
Streptavidin Pacific Blue	Invitrogen	S11222	Grand Island, Нью-Йорк
Стрептавидин Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, Нью-Йорк
Стрептавидин Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Donkey Anti Goat 594	Инвитроген	A21113	Гранд Айленд, Нью-Йорк
Donkey Anti Rabbit 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, California
Histocryl (хирургический клей)	Braun Aesculap	1050060	Туттлинген, Германия
Реагенты для клеточных культур
Дульбекко s модифицированный Eagle' s среда (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Фетальная бычья сыворотка (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Гранд Айленд, Нью-Йорк