Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка нейронных сопредседателей культур с одной клетки Precision

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51389

⸱

20 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften, ISAS, 2Department of Biochemical Engineering, University College London, 3Institute for Life Sciences, University of Southampton

В этой статье

Краткое содержание

Протоколы для одного нейрона микрофлюидных выстроив и воды маскировки для в-чипе плазмы паттерна биоматериала покрытий описаны. Тесно взаимосвязаны со-культуры могут быть получены с использованием входов минимальные клеток.

Аннотация

Микрофлюидных варианты камеры Campenot привлекли большой интерес от нейронауки сообщества. Эти взаимосвязанные платформы со-культура может быть использован для исследования разнообразных вопросов, охватывающих с развитием и функциональный нейробиологии к инфекции и распространения заболеваний. Тем не менее, традиционные системы требуют значительных сотовой входы (многие тысячи в отсеке), неадекватные для изучения низкие клетки изобилии, такие как первичной дофаминергической черной субстанции, винтовая ганглиев и Drosophilia MELANOGASTER нейронов и непрактично для высокой пропускной экспериментов. Плотные культуры также весьма локально запутанными, с несколько выростов (<10%), соединяющих две культуры. В этой статье прямые микрофлюидных и паттерна протоколы описаны которые решения этих проблем: (я) микрофлюидных один нейрон метод выстроив, и (II) методом вода маскировка для плазмы паттерна биоматериала покрытия для Regiстер нейроны и способствовать вырост между отсеками. Минималистичные нейронов со-культуры были приготовлены с высокого уровня (> 85%) соединения intercompartment и может быть использован для высокой пропускной нейробиологии экспериментов с точностью одной ячейки.

Введение

Нервной ткани является весьма сложным; гетерогенная сотовой смесь, которая пространственно приказал в определенных слоев и отсеков и с пластиковой подключения через сотовые контактов и особенно через аксонов и дендритов выростов. Новые методы, необходимые для придания большей экспериментальной свободу, чтобы получить более глубокое понимание и разгадать механизмы центральные к болезни, развития и нормального функционирования. Campenot камера 1,2, а в последнее микроизготовленном варианты 3,4 могут быть использованы для экс виво подготовки сетевых нейронов совместных культурах с возможностью избирательно возмущают различные соматические популяции, а также их нейритов наростов. Эти микрофлюидных устройства например был использован для изучения аксонов дегенерации и регенерации следующие химической 5,6 или лазерного аксотомии 6-8 tauopathy 9, вирусного распространения 10,11 и мРНК локализации в аксонов 4.

ЛОР ">

Чтобы расширить сферу из нейробиологов, технологические разработки должны подготовить минималистичные нейронные совместно культур. Это позволяет распутывание нейронной сети для исследования системы с одной клетки и субклеточном точностью. Требование минимального количества клеток открывает возможность для анализа редких типов клеток, в том числе дофаминергических черной субстанции клеток, имеющих отношение к болезни Паркинсона, винтовая ганглиев от уха, периферических нейронах, и стволовые клетки. Помимо этого, сотовые экономика имеет отношение к инициативе 3Rs. Используя эти микрофлюидных платформы, крупномасштабные экраны токсичности или других высокую пропускную способность, данные богатых серии экспериментов, требующих нейроны животных теперь можно считать.

В данной работе протоколы для изготовления и использования микрожидкостных устройств описаны. Микрофлюидных выстроив в сочетании с в месте biomateriСпособ рисунка др. могут быть использованы для регистрации сильно взаимосвязанных нейронных совместных культурах с использованием минимального количества клеток. Микрофлюидных упорядоченный массив основан на подходе дифференциального потока 12-15, в результате чего микроструктурированных ловушки расположены внутри контура текучей (на примере вместе с изображениями SEM на фиг.1). Путь 0 → 1 имеет более низкую жидкостный сопротивление (R 2> R 1) для транспортировки нейронов к линейному массиву микроструктурированном отверстий - впускных отверстий на рост аксонов каналов. Заполняемость в ловушку одной клетки локально препятствует потоку, чтобы отвлечь линии тока для улавливания последующие клетки в соседних ловушек. Полное размещение ловушек в массиве переключает жидкостный коэффициент (R 1> R 2), чтобы отвлечь линии тока в волнообразной траектории (0 → 2) для получения обходного режима работы для удаления избыточных нейронов.

figure-introduction-1
Рисунок 1. Микрофлюидных цепи. А) жидкостный контур дифференциальное сопротивление для одного нейрона выстроив, с фланговые культуры камер, соединенных между собой рост аксонов каналов. B, C) ​​СЭМ изображения двухслойной разобщенным нейрона массива сокультуры с мениска закрепления микростолбиков. При такой конструкции, Trident-образный нейрон захвата структуры были использованы для содействия пучками из нейритов наростов. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Подготовка micropatterned нейронных сетей на плоских подложек может быть легко достигнуто (для exampl эс из нашей группы, см. Frimat др.. 16 и Хайке и др.. 17). Тем не менее, инкапсуляции биоактивных материалов паттерны в устройствах PDMS и с требованием микронных выравнивания их с микроканалов создает серьезную техническую проблему. В разделе 3.1 протокол для в-чипе, или в месте, подготовка биоматериала моделей представлена. Эти модели можно было регистрировать нейронов во время длительных сроков культуры и продвижения выросты между отсеками. Мениска-пиннинга микроструктуры используют для выравнивания так называемую маску воды с нейрон упорядоченный массив сайты и нейритов каналов. Маска вода защищает молекул адгезии покрытий во плазменной обработки, в то время как открытые поверхности распадаются определить биоматериала шаблон. Кроме того, протоколы предназначены для культуры клеток и для текучей изоляции, необходимой для селективного лечения различных отсеках со-культуры.

ve_content "> Протоколы предназначены для привлечения в удобных принципов мягкой литографии для репликации поли (диметилсилоксанового) (PDMS) микрожидкостных устройств 18. Кроме того, в Ситу биоматериала паттерна проста, эксплуатируя испарения и поверхностные явления напряженности, и только требуя недорогой переносной источник плазмы. Микрожидкостных схема эффективно программы загрузки клеток и отсек конкретные процедуры делает эти операции просто вопрос выдачи материалов в правильное нижнему порту и аспирационных сверху. Таким образом, он предназначен, чтобы дать нейробиологов свобода получать и использовать микрожидкостных устройств в своих собственных лабораториях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы предназначены для неврологов, и приведены на рисунке 2. Как таковое, это рекомендовать микротехнологий из СУ-8 мастеров, используемых для PDMS репликации на аутсорсинг в коммерческих или институциональных учреждений. Два слоя маски конструкции находятся в свободном доступе в качестве дополнительной информации (ZIP) на Королевского общества химии сайте 12. Важно отметить, что первый SU-8 слой должен быть изготовлен на глубину 2,5-3,0 мкм, а второй на глубину 25-30 мкм. Это ключевые размеры, необходимые для эффективного нейрона выстроив. 3 микрон предел высоты Также необходимо, чтобы предотвратить нейроны время транспортировки или переноса между двумя отсеками 12.

1. Микрофлюидных репликации устройств в PDMS

  1. Смешайте PDMS форполимера тщательно с отвердителем (184) в соотношении 10:01 и дегазации смеси в вакуумном эксикаторе в течение обычно 20 мин. С другой стороны, поставить смесьтуры в 50 мл трубки Сокол и использовать низкую г центрифугированию для дегазации.
  2. Поместите 2-слоя микроструктурированный СУ-8 пластины на 80 ° C плитой и выровнять полимерных кадры для каждого устройства на пластине. Налейте PDMS в рамках на глубину ≥ 5 мм и позволяют> 1 час, чтобы обеспечить полное термическое отверждение.
  3. После отверждения, удалить пластину из плиты и дать остыть на плоской поверхности.
  4. Носите защитные очки и работу от одного угла (подальше от СУ-8 микроструктур) с жесткой скальпеля к мягко приз раму и PDMS от пластины.
  5. Снимите плесень PDMS от рамы и использовать ножницы, чтобы урезать устройство избыточных PDMS. Этот так называемый мигает часто получают, когда тонкая пленка PDMS распространяется между рамой и полимерной поверхности пластины.
  6. Остальные PDMS может быть применен ко всей пластины и отверждены, чтобы защитить подложку во время хранения. Удалить это до последующего формования устройства, и при этом удалять любые рсформулировать загрязнений с поверхности.

2. Ассамблея устройства и межсоединений

  1. Подготовьте порты 6 интерфейса с помощью 3 мм биопсии диаметр удар. Работа по темной поверхности, в хороших условиях освещения и с микроструктурой особенностей стоящих перед вверх, чтобы помочь выравнивание портов с микроканалов.
  2. Прибор на твердых частиц. Удалите их, используя обратимое клейкую ленту.
  3. Микрожидкостных схема инкапсулируется с помощью тонкой PDMS слой, установленный на покровным стеклом: Их получают путем заливки небольшого объема (~ 0,5 мл) в PDMS-отвердителя смеси (10:1, 601) на базе гибкой, бактериологическое чашки Петри. Аккуратно нажмите покровное на слой PDMS, размещаем на электрической плитке и термически лечения в течение нескольких минут. Быстро после охлаждения, использовать скальпель, чтобы вырезать и приз бислой покровное-PDMS от чашки Петри. Обрезать ножницами в случае необходимости.
  4. Плазменные облигаций этом устройство PDMSи опорный слой для получения хорошего уплотнения: Оптимальные условия инструментом конкретных. Например, плазма печь работает на 70 Вт и 40 кГц в атмосфере кислорода 0,2 мбар в течение 40 сек производит отличную ПДМС-PDMS связь. После того, как с плазменной обработкой, нажмите обе части вместе и оставить на минуту к полностью облигаций.
  5. Используйте силиконовых трубок (1,6 мм ID, 3,2 мм OD) для взаимодействия с насосами и шприцев.

3. Биоматериала паттерна и Микрофлюидных Операции

Протоколы деятельности на местах по биоматериала паттерна, нейронов культуры и жидкостных обработок показано на рисунке 2.

figure-protocol-1
Рисунок 2. Иллюстрированные микрофлюидных протоколы. А) PL и PLL-г-ПЭГ рисунка; добавление клеточной адгезии слоя (например,PL, зеленый), с испарением производству маску выровненный воды B) Атмосферное обработки воздуха в плазме открытой PL.; две выводы антенны используются, с введением плазмы антенны, показанной с розовым звезды. C) PBS (синий) стиральная стремлением используется, чтобы избежать загрязнения области плазмы обращению с PL. D) Доставка PLL-г-PEG (красный ) стремлением к пальто плазменные обработанных областей Е) Сотовый загрузки.; одновременное микрофлюидных выстроив нейронов в обоих фланговых отделений стремлением, F) СМИ (розовый) перфузии с помощью гидростатического приводом поток G) Изолированные струйные процедуры.; периферической лечение тестируемого агента (черный) поставляется с нижней фланговые входе стремлением и H) центральной лечения, поступающей из нижней центральной входе по аспирации. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества(РКК) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Сразу же после плазменной склеивания микрофлюидных каналы PDMS очень гидрофильные (угол контакта ≤ 5 °). Такие поверхности являются подходящими для адгезии и культуры клеточных линий, таких как дифференцированные человека SH-SY5Y нейроноподобных клеток. Для экс естественных культуры первичных нейронов и культуре нейронов клеточных предшественником линий, таких как Лунда человеком Теменной клеточной линии (LUHMES) полиамина покрытием, либо полилизином (PL) или полиорнитином (PO), требуется в качестве электростатического якоря. Кроме того адгезии белки, такие как ламинин или фибронектин часто требуется, как интегрин-сопряжения покрытия. Тем не менее, PL и PO покрытия легко связать нейронов, препятствуя микрофлюидных доставку к местам массива, а также навязывания нежелательных напряжений сдвига. Для решения этой проблемы в чипе биоматериаластруктурирование требуется локализовать адгезионные материалы на ловушки сайтов и разрастание микроканалов. Это также способствует развитию между отделениями связи и снижает местный запутанности. Протокол также включает добавление ПЭГ материалов на соседних областей, чтобы обеспечить белки и нейроны ограничивается желаемых местах в течение длительного культуры. Следующий протокол описан в рисунке 3:

figure-protocol-2
Рисунок 3. Вода маскировки для биоматериала паттерна с помощью плазменного трафарету. А) Иллюстрация процесса вода маскирующего с PDMS микростолбиков закрепления водных мениск на месте в течение плазмы трафарету. Кривизна мениска в вертикальной плоскости был пренебречь. B) Маска воды визуализировали с красным красителем и позиционируется мениска рнечего. C) узорной PL-FITC покрытие отображаемого после плазменной трафарету. D) Добавление белка отвергая и сотовый отталкивает PLL-г-ПЭГ-TRITC к плазменному узором PL-FITC покрытия. Это было использовано для регистрации SH-SY5Y клеток, а также для формирования паттерна дополнительный слой фибронектина для LUHMES клеток. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

  1. Вода Маскировка деятельности на местах по биоматериалов паттерна плазмой трафарету
    1. Вскоре после плазменной связующего пипетки объем 0,5 мкл PL или PO (100 мкг / мл в 1X PBS) в нижней центральной порта. В течение нескольких секунд вся микрофлюидных схема заполняется под действием капиллярных сил. Оставьте на несколько минут, чтобы полностью пальто гидрофильные PDMS поверхностей с Полнамины.
    2. Удалить несвязанных молекул полиаминовые по аспирации приводом промывки 1x PBS (см. рис 2С) в течение 1 мин.
    3. Удалите все PBS из портов и нагреть устройство при освещении с помощью микроскопа. Это увеличивает испарение из портов для быстрого формирования маски вода. Маска воды (показано на рисунке 3А и документально на фигуре 3В) устанавливается в пределах ~ 5 мин.
    4. Проверьте устройство с помощью микроскопа для обеспечения водой маскировки завершена. Обратите внимание, резервуар структуры выше сайта массива включены в конструкции маски, чтобы продлить устойчивость маски водой (~ 15 мин).
    5. Вставьте флажки из нержавеющей стали в порты (рис. 2В). Они используются для соединения плазмы, порожденная давления ручного коронного разряда атмосферного или Tesla генератора (например, работающий на частоте 2 МГц, сигнал 30 кВ) 19,20 в свободные микроканалов. Направьте кончик тон плазме источник, близкий к оконечности одного штифта и плазмы лечить микроканал для ≤ 1 сек. Используйте условия низкой освещенности наблюдать плазменный паттерна.
    6. Удалить маску воды с стадии промывки. Используйте параллельные стремление из верхних 3 портов. Используйте 4 равные длины силиконовой трубки, соединенные 4-х адаптер в аспирационной насоса для достижения параллельного стремление. Начните стремление и обойтись PBS в нижних 3 порта привлечь PBS через микрофлюидных цепи. Таким образом ПДМС-полиамин материал контраста производится (см. фиг.3С). Эвакуировать PBS от микрофлюидных цепи и оставить на несколько часов, чтобы восстановить родной, гидрофобный состояние. Это делает PDMS полностью запрещающей к клеточной адгезии.
    7. Если дополнительные адгезионные материалы, такие как ламинин или фибронектин, необходимо выполнить следующие шаги необходимы и должно быть сделано немедленно после снятия маски воды: Внесите объем 10 мкл трансплантата сополимер поли-L- Лизин-поли (этиленгликоль) (PLL-G-ПЭГ, 100 мкг / мл, в PBS) в обеих нижних фланкирующие каналов, с последующим отсасыванием с верхних фланкирующих каналов в течение 2 мин.
    8. Без прерывания потока, удалить излишки PLL-G-ПЭГ путем обмена с буфером PBS. Это выборочно покрывает не-полиаминовые покрытием регионах с остатком ПЭГ действует для предотвращения адсорбции белка и клеточную адгезию 17,21.
    9. Адгезионные белки, такие как ламинин или фибронектин может быть совместно локализованы с покрытием поли-амина: Пипетка 10 мкл объемы этих белков ЕСМ (обычно 10 мкг / мл) во все три нижних портов. Аспирируйте из трех лучших портов, пока устройство не наполнен раствора белка и инкубировать в течение 1 часа, чтобы произвести хорошее качество покрытия.
    10. Удалить лишние белки путем аспирации PBS с нижних 3 портов.
  2. Микрофлюидных одного нейрона выстроив
    1. Премьер устройства с Ассигноели СМИ. Добавьте 20 мкл в донных 3 портов и параллельным стремление из верхних трех портов быстро заполнить микрофлюидных цепь с СМИ. Используйте трубки разъем 4 направлениях для соединения 3 верхних портов через равной длины силиконовой трубки к аспирации насоса.
    2. Добавить 20 мкл дезагрегированном клеточной суспензии (1 х 10 6 клеток / мл) в каждый из фланговых входных отверстий (0, на рисунке 1).
    3. Одета при аспирации насос с регулятором расхода или использовать шприц для нежной стремление из верхних 3 портов. Полный нейрон выстроив обычно требуется 1 мин.
    4. Урожай лишние нейроны оставшиеся в 4 фланговые портов с помощью пипетки для выстроив в последующих микрожидкостных устройств.
    5. Снимите трубку. Заполните все порты со средствами массовой информации и поместить устройство в инкубаторе. В течение нескольких часов клетки становятся полностью приверженцем на биоматериала узором.
  3. Нейрон Культура, Селективный Пневмомускул лечение и иммунитетnostaining
    1. Замените СМИ периодическим перфузии с помощью гидростатического канал (2 мм разница высота колонны является надлежащим медленно).
    2. Кроме того, погрузите микрожидкостных устройств в средах, периодически обмениваясь СМИ (2-3 дня), как со стандартными клеточных культурах.
    3. Избирательные струйные процедуры по обе нейрона культуры отсеке или центральной рост аксонов отсеке достигаются следующим образом: Внесите 20 мкл испытуемого вещества в нижний порт канала, представляющего интерес, и аспирации от порта непосредственно выше. Для длительных процедур уменьшить скорость потока с помощью регулятора потока и пополнить исследуемое вещество по мере необходимости.
    4. Иммуноокрашивание протоколы изменяются для каждого молекулярной мишени и связанных реагентов. В целях противодействия потенциальный риск сдвига, вызванных повреждением нейронов, используемых медленный расход. Это приводит к увеличению времени приложений, чтобы полностью заливать систему, расширяя нормальные раз протокола. Hyростатического перфузии через порты с различной высоты столбцов (например, 2 мм) был использован для доставки реагентов. Более быстрое добавление реагента и удаление с помощью насоса может быть использован для уменьшения экспериментальные временные рамки. Подключите стремление насос на верхние 3 порта привлечь реагенты из нижних 3 портов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вода маскирующие подвиги поверхностного натяжения. Допуск давление на границе раздела воздух-жидкость изменяется обратно пропорционально с радиусом кривизны [ figure-results-1 , Создании высокостабильных интерфейсы на микрофлюидных размеров. В микростолбиков эффективно закрепить маску воды на месте. Формирование маска Вода движет испарения от микрофлюидных портов, со скоростью увеличился на отопление. Использование тепла от малом увеличении (4X - 10X) м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микрожидкостных техника выстроив является первым в своем роде, который позволяет точности одного обращения нейронов для установления минималистичные культур. В сочетании с месте биоматериала методом структуризации в, мощный подход к выравнивания моделей сотовых с микрофлюидных структур, эти минималистичные культуры имеют уровни подключения высокого intercompartment с уменьшенной локальной запутанности. Эти особенности могут быть использованы для эффективного изучения между отсека передачи, и с простой ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Авторы благодарны Ульрих Маргграф (МСА) для СУ-8 изготовление и Мария Беккер (МСА) для работы с изображениями SEM. Исследование было при финансовой поддержке Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), в Bundesministerium für Bildung унд Forschung гранта (BMBF 0101-31P6541) и по Ministerium für Innovation, Wissenschaft унд Forschung де Ланды Северный Рейн-Вестфалия. Хайке Hardelauf благодарит Международный Лейбниц Высшая школа "Системная биология Лаборатории-на-чипе" за финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PDMS Sylgard 184Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601Wacker
CoverslipsVWR630-1590толщина 130-160 мм
3 мм биопсийные проколыKai MedicalHandle с осторожностью - чрезвычайно острые
трубки TygonFisher ScientificS-50-HL1,65 мм ID; 3,35 мм OD
1 мл шприц ( Inkjekt и Omnifix)Braun6064204
4-ходовой соединитель трубкиVWR или регулятор потока Fisher Scientific
ApparatusHarvard Apparatus722645
штифты 0,5 ммОтделы
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]-PEG(5)Стабильностьпри хранении может быть проблемой
поли-D-лизинаSigma-AldrichP6407
Полилизин-FITCSigma-AldrichP3069
ПолиорнитинSigma-AldrichP4957
ФибронектинSigma-AldrichF2006
ЛамининSigma-AldrichL2020
PBSSigma-AldrichP4417
Инвертированный флуоресцентный микроскоп
Пример аспирационного насосаKNF Neuberger, LaboportN811KVP
Ручное устройство для коронного разрядаLeybold-Heraeus, СШАVP23Может не соответствовать стандартам безопасности вашей страны
Фемтоплазменная печьDiener Электронный
вакуумный дессикатор или центрифуга
пошива одежды

Ссылки

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Массив одиночных клетокмикрофлюидное устройствоплазменное склеиваниепаттернирование полилизиномводное маскированиерост нейритовформовка из ПДМСкапиллярное заполнениеселективная обработка
Подготовка нейронных сопредседателей культур с одной клетки Precision
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.