Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

14.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51395

⸱

28 апреля 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Biophotonics Core Facility, Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel

В этой статье

Краткое содержание

Существует несколько методов измерения внутриклеточного pH, но очень немногие из них позволяют одновременно измерять pH цитоплазматики и органеллы. В этой статье мы подробно описываем быструю и точную методологию одновременного измерения цитоплазматического и везикулярного pH с помощью ратиометрической визуализации живых клеток.

Аннотация

Внутриклеточный pH строго регулируется, и сообщалось о различиях в pH между цитоплазмой и органеллами1. Регуляция клеточного pH имеет решающее значение для гомеостатического контроля физиологических процессов, которые включают: синтез белка, ДНК и РНК, везикулярный транспорт, рост и деление клеток. Изменения в клеточном гомеостазе pH могут привести к вредным функциональным изменениям и способствовать прогрессированию различных заболеваний2. Существуют различные методы измерения внутриклеточного pH, но очень немногие из них позволяют одновременно измерять pH в цитоплазме и в органеллах. Здесь мы подробно опишем быстрый и точный метод одновременного измерения цитоплазматического и органеллярного pH с помощью конфокальной микроскопии живых клеток3. Эта цель достигается за счет использования двух рН-чувствительных ратиометрических красителей, обладающих селективным разделением клеточных компартментов. Например, SNARF-1 компартментализирован внутри цитоплазмы, в то время как HPTS компартментализирован внутри эндосомных/лизосомальных органелл. Хотя HPTS обычно используется в качестве цитоплазматического индикатора pH, этот краситель может специфически помечать везикулы вдоль эндосомально-лизосомального пути после того, как его захватывает пиноцитоз3,4. С помощью этих pH-чувствительных зондов можно одновременно измерять pH в эндоцитарном и цитоплазматическом компартментах. Оптимальная длина волны возбуждения HPTS изменяется в зависимости от pH, в то время как для SNARF-1 изменяется оптимальная длина волны излучения. После загрузки SNARF-1 и HPTS клетки культивируют в различных pH-калиброванных растворах для построения стандартной кривой pH для каждого зонда. Визуализация клеток с помощью конфокальной микроскопии позволяет устранить артефакты и фоновый шум. Благодаря спектральным свойствам HPTS этот зонд лучше подходит для измерения умеренно кислого эндосомального компартмента или для демонстрации ощелачивания эндосомных/лизосомальных органелл. Этот метод упрощает анализ данных, повышает точность измерений pH и может быть использован для решения фундаментальных вопросов, связанных с модуляцией pH во время реакции клеток на внешние вызовы.

Протокол

1. Приготовление растворов для мобильных телефонов рН Калибровка

  1. Добавить следующие соединения пяти отдельных 50 мл конические пробирки подготовить 5 решения, которые будут использоваться для калибровки:
    • NaCl (1 мл 1 М NaCl) (1 М NaCl = 0,58 г в 10 мл H 2 0)
    • KCl (6,75 мл 1 М KCl) (1 М KCl = 0,75 г в 10 мл H 2 0)
    • Глюкоза (1 мл 1 М D-глюкозы) (1M D-Глюкоза = 1,80 г в 10 мл H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 мл 1 М MgSO 4) (1 М MgSO 4 = 1,20 г в 10 мл H 2 0)
    • 20 мМ HEPES (1 мл 1М HEPES) (1 М HEPES = 2,38 г в 10 мл H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 мл 1 М CaCl 2) (1 М CaCl 2 = 1,47 г в 10 мл H 2 0)
      Подготовить все решения в дважды дистиллированной H 2 O (DDH 2 O).
  2. Заполните каждое решение с 35 мл DDH 2 O и смешать с магнитной мешалкой, пока таксобность достигнута.
  3. Отрегулируйте рН каждого раствора 1 н КОН или 1 N HCl для получения значения рН 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. Затем, отрегулировать громкость с деионизированной водой до конечного объема 50 мл.
  4. Мера 5 мг нигерицина и добавить его в 670 мкл абсолютного этанола подготовить 10 мМ нигерицин маточного раствора.
    Внимание: нигерицин высоко токсичен и следует обращаться с большой осторожностью (перчатки, защитные очки и маски). Смешайте раствор инверсией пока нигерицин полностью не растворится.
  5. Добавить 0,05 мл 10 мМ нигерицина (конечная концентрация 10 мкМ), чтобы каждого калибровочного раствора. Нигерицин является ионофор что увеличивает клеточной проницаемости мембраны и вызывает уравновешивание внутриклеточного и внеклеточного рН в присутствии концентрации внеклеточного деполяризующее K +.
  6. Калибровочные растворы можно хранить до 1 месяца при 4 ° С

2. Подготовка Сотовый

  1. Под биологической беу капот, семян клетки в 35 мм х 10 мм чашки для культивирования в 2 мл ростовой среды с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков. Используйте количество клеток, необходимых для обеспечения приблизительно 50% слияния после 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В наших экспериментах мы используем клеточной линии НТ-1080 и пластину 1 х 10 5 клеток на блюдо культуры.
  2. Определить количество чашек для культивирования, необходимых для эксперимента и пластины 5 дополнительных чашек для культивирования, которые будут использоваться для калибровки.
  3. Место культуры блюда в 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора в течение не менее 24 часов.

3. Подготовка зондов рН-чувствительных

  1. Подготовка 1М исходного раствора флуоресцентный зонд рН 8-hydroxypyrene-1, 3,6 трисульфоновой кислотой, тринатриева соль (HPTs / pyranine) в DDH 2 0. Это решение должно храниться при комнатной температуре в защищенном от света.
  2. Подготовка исходного раствора 1 мМ 5 - (и-6)-карбоновой seminaphthorhodafluor ацетоксиметил эфир ацетат (C-Snarf-1 утра; называется thereâосле Snarf-1) растворением 1 мг Snarf-1 в 1,76 мл ДМСО. Тщательно перемешайте повторным пипетированием. Snarf-1 решение необходимо хранить при -20 ° С в защищенном от света.

4. Маркировка Сотовый

  1. Шестнадцать часов до визуализации живых клеток, добавить 2 мкл 1М HPTs маточного раствора (конечная концентрация 1 мм) с каждой культуры блюдо, содержащих 2 мл полной среды.
  2. Верните чашки для культивирования в инкубатор. HPTs зонд клеток impermeant, поэтому этикетке органелл зонд должен быть рассмотрен пиноцитозом. Это условие требует, чтобы сотовые инкубации с HPTs выполняются в сыворотки дополнена культуральной среде.
  3. После инкубации с HPTs, промыть клетки дважды стерильной PBS и добавляют 2 мл бессывороточной среде в течение по крайней мере 2 часов. Инкубация с Snarf-1 должен быть выполнен в бессывороточной среде, так как в сыворотке крови может предотвратить поглощение зонда.
  4. Добавить 10 мкл Snarf-1 исходного раствора 1 мм, чтобы обеспечить афИнал концентрации 5 мкМ и позволяют клетки инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С, при слабом освещении. C-Snarf-1 концентрация и время инкубации может варьироваться в зависимости от типа клеток.
  5. В конце инкубации промыть клетки дважды в стерильной PBS и добавляют 2 мл бессывороточной среды.

5. Добавление рН модуляторов

  1. Чтобы оценить, может ли метод обнаружения изменений рН в клетках, могут быть использованы различные реагенты, которые модулируют внутриклеточный рН:
    • Bafilomycin А1, специфический ингибитор V-АТФазы 5
    • Na + / H +-обмена изоформы 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, слабым основанием, что повышает внутриклеточный рН 7
    1. Подготовьте исходные растворы реагентов, упомянутых выше:
      • Bafilomycin A1: добавить 10 мкг bafilomycin А1 до 160 мкл ДМСО, чтобы получить исходный раствор 100 мкМ
      • EIPA: добавить 25 мг EIPA до 1,67 мл метанола в obtaiпа конечная концентрация 50 мМ
      • NH 4 Cl: растворить 0,53 г хлорида аммония в 10 мл DDH 2 O с получением конечной концентрации 1 мМ.

      Примечание: Все исходные растворы должны храниться при температуре 4 ° С в течение bafilomycin А1, которые должны быть сохранены при -20 ° С в защищенном от света кроме.
    2. В отдельных культуральные чашки, добавить один из реагентов, как описано ниже:
      • 2 мкл 100 мкМ bafilomycin A1 (конечная концентрация 100 нМ)
      • 1 мкл 50 мМ EIPA (конечная концентрация 25 мкМ)
      • 40 мкл 1М NH 4 Cl (конечная концентрация 20 мМ)
    3. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С
  2. Перейдите к получения изображений.

6. Технические характеристики визуализации микроскопа Онлайн-клеток и настройки с приобретением

  1. Выполните изображений живых клеток, используя цель 40X установлен на спектральной перевернутой сканирующей конфокальной microscoре оснащен моторизованным этапе XY, камеры, который вмещает стеклянным дном чашки для культивирования в экологически управляемой (температура, влажность, CO 2) стадии инкубатора.
  2. Конфокальной инструмент (Olympus FV1000) используется здесь оборудован:
    • Диодный лазер 405 нм
    • Аргоновый лазер 40 мВт (458 нм, 488 нм, 515 нм)
    • Неоновый лазер гелия (543 нм)
    • Флюорит 10X цель, NA0.4
    • LUCPLFLN 40X цель, NA0.60
    • Масло цель PLAPONSC ПЛАН APO 60X, NA1.4
    • Дихроичное зеркало DM 405/458/488/543
    • СДМ 560 и еще SDM 640 дихроичных фильтров
    • BA655-755 барьер фильтр
    • Светоделитель BS20/80
    • Анализ данных программное обеспечение для сбора и анализа изображений,
  3. После того, как этап инкубатор прогреется до 37 ° С и микроскопа устанавливается, место культуры блюдо ранее инкубировали с HPTs и Snarf-1 в конфокальной изображения камеры этап.
  4. осле обнаружения площадь интерес, настроить параметры на приобретение программного обеспечения Рисунок 1.
    • Настройте два набора виртуальных каналов.
    • Инициировать первый этап, который соответствует возбуждения HPTs при 405 нм и сбора излучения на 505 - 525 нм и Snarf-1 возбуждении на 543 нм и сбора излучения на 570 - 600 нм.
    • Инициировать второй этап, который соответствует возбуждения HPTs на 458 нм и сбора излучения на 505 - 525 нм и Snarf-1 возбуждении на 543 нм и сбора излучения на 640 - 650 нм.
    • Конфокальной диафрагмы устанавливается до 175 мкм по умолчанию и оптимальная диафрагма должна быть вручную установлена ​​на уровне 300 мкм.
    • Возьмите изображение путем укладки последовательных горизонтальных оптических срезов (800 х 800 пикселей) 0,4 мкм толщиной.

ПРИМЕЧАНИЕ: 40X цель полезна для наблюдения несколько ячеек одновременно и хорошо работает для просмотра органелл. Тем не менее, пространственное разрешение и интенсивность сигнала являются Беттг достигается с помощью масла цели 60X. Кроме того, нет возбуждение или излучение перекрестные помехи между двумя красителей.

7. Калибровка зондов рН-чувствительных

  1. Перед калибровкой удалить среды из культуры блюдо ранее инкубированной с HPTs и Snarf-1, мыть дважды стерильной PBS, а затем добавить 2 мл одного из пяти калибровочных растворов.
  2. Место культуры блюдо в конфокальной камерной сцене.
  3. Перейдите к покадровой получения изображений в соответствии со следующими настройками:
    1. Установите количество изображений и интервальных времен по продолжительности в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используют интервал 1 мин между изображениями на срок до 30 минут.
    2. Программирование затвор, чтобы закрыть между приобретением каждого изображения.
  4. Запишите интенсивности флуоресценции в минуту в программное обеспечение электронной таблицы и определить время, когда интенсивность флуоресценции устойчив. Внутриклеточный рН обычно стабильны после 15 - 20 мин.
  5. REPEAT шаги 7,1 до 7,4 с использованием новой культуры блюдо для каждого оставшегося калибровочного раствора.

8. Сбора данных

  1. После калибровки было сделано, приобрести образцы данных от 4-5 произвольно выбранных полей, содержащих 15-20 клеток на поле. Два изображения получаются для каждого поля: одно для HPTs маркировки (везикул), а второй для Snarf-1 маркировки (цитозоля).
  2. Фоновой флуоресценции (внеклеточный область) в цифровой форме вычитают из флуоресцентных изображений обоих зондов. Меченые пузырьки и цитозоль из своих сохраненных изображений выбираются с помощью двоичного маску. Для каждого рН-чувствительного зонда, интенсивности флуоресценции измеряется на числовой шкале (0-4,095 шкалы уровней серого). Среднее значение интенсивности для всех пикселей в органеллы цитоплазмы или рассчитывается и значения используются для вычисления коэффициентов флуоресценции.

9. Анализ данных

  1. Различные программные пакеты являются коммерчески доступными для анализа данных. Т.е.FluoView Программное обеспечение.
  2. В электронной таблице рекордных значений и рассчитать коэффициенты флуоресценции следующим образом: В случае HPTs, R = (F 458 нм / F 405 нм) и, в случае Snarf-1, R = (F 644 нм / F 584 нм ).
  3. Участок данные, используя научную программное обеспечение графиков таких как GraphPad Prism. Сюжет должен изобразить отношения флуоресценции (Y-ось) в зависимости от рН (оси Х). Место Кривая достигается с помощью нелинейной регрессии.
  4. Сбор интенсивности флуоресценции образцов, как описано в шаге 8.2 и рассчитать коэффициенты флуоресценции. С помощью калибровочных кривых для преобразования коэффициентов в значениях рН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для одновременного измерения рН в обоих отсеках внутриклеточных и эндосом / лизосом клеток были использованы логометрических флуоресцентные рН-чувствительный зонды Snarf-1 и HPTs. Snarf-1 ограничен цитозольной отсека в то время как HPTs позволяет измерять пропорциональный рН эндосом / лизосом отсека. Сотовый загрузка с HPTs в течение 16 часов позволяет его селективный локализацию в эндосомах / лизосом 4. Типичным примером флуоресценции, записанного с HT-1080 клеток, нагруженных зондов рН-чувствительных показа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Количественное измерение рН в живых клеток визуализации различных клеточных отсеках необходима, чтобы точно измерить вариации рН в клеточных ответов на внешние вызовы. Тем не менее, одним из основных препятствий, что остается только легко и специально направлены сотовой отсеков. В этом отношении несколько исследований выявили использование HPTs как внутриклеточный рН-индикатора, введенного в клетки путем электропорации микроинъекции или 8-10. Эти методы страдают от серьезных недостатков, а именно электропорац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Мы благодарим доктора Жиля Дюпюи за критическое прочтение рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения, грант # MOP-126173. C.M.D является членом Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Растворы для калибровки
Хлорид натрияFischerL-11621
Хлорид калияFischerM-12445
D-глюкоза (декстроза)FischerD16-1
Сульфат магнияFischerM65-500
HEPESSigma-AldrichH3375
Дигидрат хлорида кальцияFischerM-1612
Деионизированная водан/д/д
НигерицинCalbiochem481990Токсичен при вдыхании или контакте с кожей
Хранить в защищенном от света месте при 4 ° C
Чашки для культуры и пустые; 35 ммBD Biosciences354456
pH-чувствительные зонды
8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота (HPTS)Life technologiesH-348Хранить вдали от света при комнатной температуре
5-(и-6)-карбокси SNARF®-1, ацетоксиметиловый эфир, ацетатLife technologiesC-1271Хранить вдали от света и влажности при температуре -20°°; C
Диметилсуфоксид (ДМСО)FischerBP231-1 вредный
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 100X
Хлорид калияFischerM-1244520 г
Одноосновной фосфат натрияFischerS369-1115 г
Моноосновной фосфат калияJ.T Baker3246-0120 г
Деионизированная водан/д н/дДоведите до 1 л
автоклава и отрегулируйте pH до 7,4
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 1X
PBS 100XН/ДН/Д50 мл
Хлорид натрияFischerL-1162140,5 г
Деоинизированная водан/д н/дДоведение до 5 л
рН-модуляторы
Бафиломицин A1Sigma-AldrichB-1793
5-(N-этил-N-изопропил)амилорид (EIPA)Sigma-AldrichA3085
Хлорид аммонияFischerA649-500
н

Ссылки

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

pHHPTSSNARF 1pH
Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.