Методическая статья

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 мая 2014 г.

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноместный ген клеток выражение анализ необходим для понимания стволовых клеток неоднородности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неоднородность популяции стволовых клеток затрудняет детальное понимание биологии стволовых клеток, таких, как их дифференциации склонности к различных линий. Одна ячейка транскриптома анализ может быть новый подход к рассекает индивидуальные различия. Мы разработали метод Single Cell Qrt-PCR, и подтвердил, что этот метод хорошо работает в нескольких профилей экспрессии генов. В уровне одной клетки, каждый человек эмбриональных стволовых клеток, отсортировано по OCT4 :: EGFP-положительные клетки, обладает высокой выражение в OCT4, но другой уровень экспрессии NANOG. Наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезным, чтобы допросить неоднородности населения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самые высокие популяции эукариот являются гетерогенными, таким образом, с анализом объединенной популяции, часто бывает трудно интерпретировать их клеточных функций. Отдельные клетки внутри популяции может быть немного отличается, и эти различия могут иметь важные последствия для свойства и функции всего населения 1, 2. Тем более, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), как известно, неоднородны, что вызывает различные уровни плюрипотентности и разнообразные потенциалы в спецификации клонов в деликатно отличительных способов 3, 4. Например, различные антигенов клеточной поверхности могут быть использованы для категоризации недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, 5 и группа Austin Smith предложены различные уровни в плюрипотентности мышиных эмбриональных стволовых клеток, в зависимости от их морфологии, дифференцировки склонности и зависимости от пути передачи сигналов 6. Это явление было предположение, в человеческом эмбрионеNIC стволовые клетки 7. В то время как были выполнены исследования общей среди различных линий стволовых клеток, а не отдельные единичные стволовых клеток, это может быть очень интригующим для анализа различных уровней плюрипотентности на уровне одной клетки, которые потенциально влияет на их дифференциации возможностей в направлении всех соматических клеточных клонов.

Клеточная и молекулярная гетерогенность может быть продиктовано транскрипции профилирования, которая называется «единого транскриптома клеток" и подчеркивает, новые подходы к количественной уровни экспрессии гена 8-10. Для анализа уровня экспрессии гена в отдельных клетках, мы разработали простой, но надежный протокол одного клеток количественного RT-PCR. Мы подтвердили эффективность и целесообразность нашего протокола путем сравнения каждую половину отдельных клеточных лизатов, а также серийно разбавленных тотальную РНК из ЭСК, в результате чего минимальных технических изменений и различий. Кроме того, мы использовали генетический репортер линию, чтобы изолировать однородной рopulation из ЭСК, использующих систему таргетинга генов. Вектор донором для ориентации OCT4 локус (OCT4-2A-EGFP-ПГК-Puro построить) и пару Talen плазмид были использованы 11. Вектор доноров и пара Talen плазмид были введены в ЭСК (Н9, WA09) с помощью нашего nucleofection и клональную протокол выбора и поддержания ЭСК была выполнена на основе нашей повседневной протокола 12. Мы подтвердили этот генетический репортер линия выразить EGFP для выражения OCT4 в OCT4 :: EGFP ЭСК.

Наш результат показывает, что отдельные ЭСК (Начиная с OCT4 :: EGFP сильно положительные клетки) занимают высокие уровни экспрессии OCT4, но разные уровни экспрессии NANOG. Итак, наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезен для изучения населения неоднородностей плюрипотентных стволовых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка плиты в 96-луночный

  1. Смешайте 1 мкл одной клетки DNase1 до 9 мкл Одноместный лизиса клеток Solution.
  2. Положите 10 мкл смешанного раствора в каждую лунку 96-луночный ПЦР планшет.

2. Снятие ЭСК для FACS очистки

  1. Отделить Oct4 :: клеточной линии EGFP ES от 60 мм чашку с 1 мл Accutase в течение 20 мин, при 37 ° С, которые были нейтрализованы с человеческим ES средств массовой информации.
  2. Подготовить популяцию клеток в 1 мл FACS буфера и настроить ячейку до 1 х 10 6 клеток / мл.
  3. Передайте образец клеток через клеточный фильтр крышкой трубки 35 мкм.
  4. Храните трубку во льду до сортировки клеток.

3. Лизис СУИМ очищенного одну ячейку в каждую лунку 96-луночного планшета

  1. Сортировать образец для EGFP-позитивных клеток по мобильному сортировщика с обученным оператором. Положите одну ячейку в одной ячейке решения Lysis/DNase1 в 96-луночный ПЦР планшет. Если необходимо, 96-луночный планшет с образцом могут быть сохранены в -80 ° C морозильная камера меньше, чем один месяц.
  2. Инкубируйте образцы 5 мин при комнатной температуре для лизиса клеток.
  3. Добавить 1 мкл стоп раствора для остановки реакции лизиса.
  4. Инкубировать 2 мин при комнатной температуре.

4. Обратной транскрипции

  1. Добавить в каждой 0,5 мкл аликвоты 20 мкм SMA-T15, SMA-A.
  2. Добавить 4 мкл 5X буфера, 2 мкл DTT, 1 мкл обратной транскриптазы и 1 мкл дНТФ в каждую лунку.
  3. Выполните обратную транскрипцию в термоциклере.
    1. Установка тепловой программу при 42 ° С × 90 мин и инактивировать обратной транскриптазы при 85 ° С × 5 мин.

5. Усиление

  1. Добавить 4 мкл ExoSAP-IT реагента в каждую обратной транскрипции образца.
    1. Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 15 мин и 80 ° С в течение 15 мин для инактивации ExoSAP-IT реагента.
  2. Подготовка ПЦР реакции смесь жIth SMA-P2 (2 нМ)
  3. Добавить 10 мкл ПЦР реакционную смесь до каждого обратной транскрипции образца.
  4. Выполнение амплификацию, состоящий из 20 циклов денатурации (94 ° С в течение 30 сек), отжига (57 ° С в течение 30 сек), и расширения (68 ° C в течение 10 мин).

6. Производительность Qrt-ПЦР

  1. Добавить 10 мкл 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 мкл амплифицированной кДНК, 2 нм праймеров и 7 мкл воды в каждую лунку.
    1. Установите программу с последующим 95 ° С в течение 3 сек, 60 ° C в течение 30 сек х 40 циклов.
  2. Выполните в двух экземплярах для технических ошибок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективная и надежная одного усиления сотового РНК

Чтобы свести к минимуму транскрипции разброс между ЭСК, мы использовали OCT4 :: EGFP чЭСК клон для очистки FACS. После сортировки Oct4 :: EGFP-положительных клеток в 96-луночный планшет, каждая ячейка лизировали в буфере для лизиса и преобразуется поли (А) + РНК в кДНК полной длины с использованием SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)-праймера и закрепления с SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) с использованием тех...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноместный ген клеток профилирование может быть основным инструментом для прогнозирования функциональность одной клетки или все население. Из-за технических ограничений, весь анализ гена профилирование было ограничено средних населенных пунктов. Вариации паттернов экспрессии генов и уровней между отдельными клетками и субпопуляций были предложены, чтобы привести к неправильной интерпретации. Такие различные клеточные аспекты можно найти в ЭСК и их неоднородность вызывает тонко различной способностью для поддержания плю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночный ПЦР-планшетСША научный1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe Обратная транскриптазаClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq ДНК-полимераза High FidelityInvitrogen11304
10 мМ dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS buffer45 мл PBS, 5 мл a-MEM, 100 μ l ДНКаза, фильтр стерилизованный
35 мкм; m Пробирки с крышкой клеточного фильтраBD Biosciences352235

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

OCT4 EGFP

Похожие статьи