Мочевой пузырь Вздутие Вызванные висцеромоторный Ответы в качестве модели для мочевого пузыря боли у мышей

Краткое содержание

Приблизительно 3-8 миллионов человек в Соединенных Штатах страдают от интерстициального боли цистит / мочевого пузыря синдрома (IC / БТС), изнурительной состояние, характеризующееся частично тазовой боли. С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, физиологический модель мочевого пузыря боли используется в мышей и крыс.

Аннотация

Приблизительно 3-8 миллионов человек в Соединенных Штатах страдают от синдрома интерстициальный цистит / болевой мочевого пузыря (IC / BPS), ослабляющее состояние характеризуется повышенной срочности и частоты мочеиспускания, а также никтурия и общей боли в области таза, особенно при заполнении мочевого пузыря или мочеиспускания. Несмотря на годы исследований, причиной IC / BPS остается неуловимым и стратегии лечения не в состоянии обеспечить полное облегчение пациентам. С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, многие животные модели были разработаны, чтобы имитировать боль и симптомы, связанные с IC / BPS. Одним из таких мышиной модели является недержание живота мочевого пузыря (UBD). В этой модели, сжатый воздух из определенным давлением поступает в мочевой пузырь легкой анестезии животного в течение заданного периода времени. Во время процедуры, провода, в улучшенных косой мышцы живота записать электрическую активность от мышцы. Эта деятельность известна как ответ висцеромоторный (VMR) и яса надежные и воспроизводимые мера ноцицепции. Здесь мы описываем шаги, необходимые для выполнения этой техники у мышей в том числе хирургических манипуляций, физиологического записи и анализа данных. С использованием этой модели, координация между первичных сенсорных нейронов, спинного мозга вторичных афферентов и высших областях центральной нервной системы, участвующих в боль в мочевом пузыре может быть разгадана. Это базовые знания наука может быть клинически переведена для лечения пациентов, страдающих от IC / BPS.

Введение

Хроническая боль официально определяется как боль, которая сохраняется в течение примерно трех месяцев, или дольше, чем в обычное время заживления тканей ^1. Этот тип боли является одним из главных причин, что люди которые приводятся обратиться к врачу ² и может стоить до $ 635 млрд долларов в год ^3. Текущий хроническая боль стратегии выживания считаются архаичными; после десятилетий медицинских достижений, НПВС (нестероидных противовоспалительных препаратов) и опиоидов по-прежнему являются основными лечения, предписанные врачами. Однако эти процедуры нацелены на все различные типы боли так же,, обеспечивая обезболивающее действие на все тело, в отличие от, акцентируя основное внимание на причине, что точное боли инцидента. Для того чтобы лучше помочь тем, кто страдает от хронических болей, исследования внимание следует сместился в сторону этиологии и возможных болевых конкретных процедур, связанных с наиболее распространенных причин хронической боли. Цель этого manuscriпт является описание модели, используемой, чтобы лучше понять состояние, известное как интерстициальный цистит / болезненного мочевого пузыря синдрома (IC / БТС).

IC / BPS является изнурительным состоянием, которое затрагивает миллионы людей, в первую очередь женщин в возрасте старше 40 ^4. Точные причины IC / BPS не известны, однако распространенность была связана с генетикой ^5, конкретных диет, и высокий уровень стресса ⁶ . Симптомы IC / BPS включают, но не ограничиваются: более неотложном к мочеиспусканию, увеличение частоты мочеиспускания, боль, пирсинг, или жгучая боль во время наполнения мочевого пузыря и мочеиспускания, и никтурии ^7. Пациенты, испытывающие эти условия имеют более высокий уровень стресса и больше озабочены ^8. Это увеличило результаты стресс в усиление боли, которая увеличивает оригинальные уровень стресса. Исследования показали, что депрессия и тревога уровни уменьшения следующие процедуры, которые снимают мочевого боль, таким образом, эффективно разорвать этот круг положительной обратной связи ^{9. Одна из проблем в открытии новых методов лечения IC / BPS была нехватка базового понимания науки боли мочевого пузыря.}

С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, многие животные модели были разработаны, чтобы имитировать боль и симптомы, связанные с IC / BPS. Традиционно, цистит был воссоздан у животных с введением различных химических веществ, таких как горчичное масло, ацетон, липополисахарид, соляная кислота, и циклофосфамид в мочевой пузырь. Однако никакие посторонние агенты не присутствуют в стерильной моче пациентов IC / BPS, тем самым сомнению законность этих моделей. Другой мышиной модели урологической боли мочевого пузыря живота (UBD) ^10. В этой модели, сжатый воздух из определенным давлением поступает в мочевой пузырь активный или легкой анестезии животного в течение заданного периода времени. Во время процедуры, провода в превосходной косой мышцы живота записи электрической Activность от мышцы (с электромиограммы (ЭМГ)). Эта активность известен как ответ висцеромоторный (VMR) и является надежным, воспроизводимым мерой ноцицепции ^10. Похожие полый орган живота (например, мочевого пузыря, прямой кишки) у здоровых людей-добровольцев производит чувства дискомфорта и значительное увеличение сообщили боли ^11,12, черты, которые часто используются для диагностики IC / BPS. Таким образом, в сочетании с электрическими, фармакологических и optogenetic методов стимуляции или ингибирования, UBD является полезным и действует модель для понимания как периферической и центральной компоненты нервной системы ноцицепции мочевого пузыря и боли.

Здесь мы описываем процедуру UBD как в настоящее время используется в нашей лаборатории в течение женских члены общей линии мышей, C57Bl/6J. В связи с трудностями в процессе катетеризации мужчин, эта процедура в основном выполняется в самок мышей. Этот протокол был адаптирован от разработанный Несс и др. ранее опубликована от нашей лаборатории ^{13. 10} и. Следующий протокол описывает четыре основные компоненты этой модели в наркозом животных: (1) катетер мочевого пузыря и записи электрод хирургия (2) частичный вводного наркоза (3) вздутие пузыря и записи VMR, и (4) анализа данных сырьевых следов VMR / EMG . Тонкие различия в процедуре UBD-VMR из-за выбора организма, глубины анестезии и индукции, и температуры тела, обсуждаются ниже.

Протокол

Следующий протокол был одобрен Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Duquesne University по и согласуется с руководящими принципами от Национальных Институтов Здоровья.

1. Хирургическое Имплантация проволочных электродов и мочевого пузыря катетер в стерильных (общее время 5-10 минут)

1. Следующие пункты должны быть готовы до начала операции:
   1. Активно отслеживать и регулировать температуру тела до 37,5 ± 0,5 ° С с использованием системы мониторинга температуры с батарейным питанием грелку и тела животного датчика температуры (Список Материалы) Подключите систему автоматического к инфракрасной лампой низкого номинальной мощностью для дополнительного контроля температуры тела.
   2. Необходимое оборудование для анестезии изофлюраном включает сжатый воздух (например, 100% O _2), изофлюран испаритель, ИФ, ИФ индукции камеры (для начальной нокдаун), носовой конус, и система выпуска.
   3. Соберите тыс.е надлежащие хирургические инструменты, внутривенного катетера, и электроды (список Материалы)
2. Вызвать состояния анестезии в индукции камеры на 2-3% изофлуран. Удалить мышь из камеры, когда рефлекса теряется (0-1 мин).
3. Наведите мышь в носовом конусе с 2-2,5% изофлураном. Зажмите палец, чтобы проверить на полных анестезии. Там не должно быть никакого ответа от животного. Запуск таймера.
4. Поместите 1 каплю глазной мази на каждый глаз мыши.
5. Включите курсор так спинной стороны направлена ​​вниз.
6. Вставьте катетер через уретру в мочевой пузырь.
7. Опустите катетер в хирургическом смазки для смазывания катетера.
   1. Аккуратно прижмите отверстие мочеиспускательного канала с острыми щипцами перпендикулярных к телу животного. Проведение катетер с ^2-й набор щипцов, аккуратно вставьте катетера конец в уретру под углом перпендикулярно к телу животного.
   2. Когда катетер вошло в уретре ~ 1-2 мм, аккуратно регулировать катетер так, что теперь параллельно корпусунаправленный к голове. Это движение необходимо, чтобы избежать лобковой кости.
   3. Аккуратно нажмите катетер к телу мыши. Катетер должен скользить в полость тела плавно и без сопротивления. Не заставляйте катетер. Если катетер не входит плавно вернитесь в перпендикулярном положении катетера и начать все заново.
   4. С катетер вставлен в мочевом пузыре, мягко надавите на живот мыши изгнать содержимое мочевого пузыря. Удалите всю мочу из катетера, нажав небольшой кусочек бумажного полотенца в отверстие катетера. Если бумага полотенце смачивают с мочой, заменить. Удалить мочу непрерывно в течение всего оставшегося протокола в том числе во время живота пузырь экспериментов (см. Протокол 3 ниже.)
8. Вставьте две серебряные провода на левую мышц брюшного пресса и один серебряной проволоки в груди (как на основание.)
   1. Используйте спирт или йод для дезинфекции площадь боковой справа от катетера (животного левая сторона тела.)
   2. Expose левую брюшной мышцы.
      1. Держите кожу около левой брюшной мышцы с щипцами. Сделайте небольшой 1-2 см разрез с средних хирургическими ножницами.
      2. Вставьте кончик ножниц в разрез и аккуратно расширить разрез до 2 см.
      3. Используйте пинцет для перемещения облегающего фасции выставить верхняя косая брюшной мышцы. Будьте осторожны, чтобы не порезать / копировать любой из крупных кровеносных сосудов, которые расположены в этом регионе.
   3. Согните три серебряные провода в два раза. Используйте острый 21 г иглы взять небольшой кусочек мышцы. Затем нажмите иглу через мышцы. При установке в мышцах быть осторожны, чтобы не проколоть любые внутренние органы и не побуждать ненужного повреждения мышцы.
   4. Палка свободный конец одной серебряной проволоки в отверстие 21 G иглу. Осторожно потяните иглу обратно через мышцы, чтобы привлечь серебряную проволоку через мышечных укуса. Когда игла свободен от мышц, осторожно потяните серебряную проволоку через мышцы, пока петля в проводе не находится на одном уровне смышцы укус.
   5. Повторите шаги 1.7.3-1.7.4 для второй мышечной проволоки. Этот провод должен быть помещен ~ 0,5 см от первой мышечной проволоки. Важно, что эти два провода не трогать после введения.
   6. Вставьте третий серебряной проволоки (земля) в грудь, ниже сердца.
      1. Используйте острый 21 г иглы взять небольшой кусочек кожи (не стоит надрезать или бритья кожу) и нажмите иглу через кожу.
      2. Вставьте серебряной проволоки, как описано выше, и тянуть через кожу.
9. Поместите небольшое количество 37,5 ° C стерильный минерального масла над открытыми мышц, чтобы держать их влажной и тянуть за кожей, насколько открытой мышцы насколько это возможно.
10. Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы помочь сохранить уровень жидкости во время последующих шагов.
11. Аккуратно свернуть животное на бок так, чтобы температура тела может быть легко поддерживать.

2. Частичное Анестезия Шаг вниз Процедура (Тотал Время ~ 75 мин)

Следующий протокол анестезии был одобрен Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Duquesne University по и согласуется с руководящими принципами от Национальных Институтов Здоровья.

1. Сразу после раздела I (см. выше) будет завершена, нижняя изофлюран до 1,5%. Держите на этом уровне в течение 15 мин.
2. Нижняя изофлуран таким образом, что животное частично под наркозом.
   1. Нижняя изофлюран на 0,125% каждые 15 мин до выставки животных ответом сгибание до ног крайнем случае, но не озвучить или иным двигаться.
   2. Как правило, уровень 0,8-1,0% изофлураном является оптимальным, однако уровни могут изменяться в зависимости от различий в анестезии установок. Вокализ и / или передвигаться очень редкие случаи, когда анестезия на должном уровне.

. 3 Электромиограмма (ЭМГ) Запись Во время пузыря живота с градуированных давлениях (15-75 мм рт.ст.) (общее время - переменная, в зависимости от эксперимента)

1. Настройка следующие пункты для ЭМГ и живота мочевого пузыря:
   1. Настройка усилитель, дигитайзер и программное обеспечение для записи. В таком случае, дигитайзер имеет один вход для усилителя и два входа для регулятора давления (давление и стимулом маркеров входов, см. ниже раздел 3.1.2). Точное оборудование и программное обеспечение установки настраивается (см. список материалов для конкретных инструкций).
   2. Настройка системы для доставки конкретные всплески давления воздуха к животному. Эта система называется "таймерной регулятора давления» в следующей методике. Это позволяет для автоматизированного поставки под давлением, включая цифровую форму давления воздуха, контроля пробного длины, в том следственном интервала автоматизации, контроля пробного числа, и начала стимула цифровой сигнал (см. Андерсон и др.. ¹⁴ для схемы из приурочен регулятора давления).
2. Подключите все подводящие провода от мыши (2 брюшной проводов + 1 провод заземления) к усилителю идигитайзер и начать EMG сигнала записи в дигитайзер программного обеспечения. Примечание какое время "Написать" выбран в дигитайзер программного обеспечения.
3. Удалить бумажное полотенце от катетера мочевого пузыря. Подключите катетер для воздуха труб (от регулятора приурочен давления.)
4. Поставьте один суд 20 сек при 60 мм рт давления растяжения полости матки.
   1. Установите регулятор потока до 60 мм рт.ст. (проверка давления с использованием аналогового сфигмоманометром.)
   2. Установите регулятор приурочен давления доставить 20 секундный интервал prepressure (это будет стимулом сигнал 2В записан в дигитайзер программного обеспечения), а затем растяжения полости матки давление импульса 20 сек.
   3. Запустите суда (prepressure интервал + живота давление триал). Когда суд фактическое давление начинает, дважды проверьте давление с помощью 3 сфигмоманометры, подключенных к системе.
   4. В ходе судебного разбирательства растяжения полости матки давление, сильный сигнал ЭМГ (> 0,5 В) должны соблюдаться во время и, возможно, после сек живота 20. Животное может проявлять abdomiНАЛ движение, но животное не должно озвучить или иным двигаться. Хотя и редко, если наблюдаются аномальные движения или вокализации, повысить уровень ИФ.
5. Если ^1-й 60 мм рт.ст. живота производит соответствующий сигнал EMG, повторите шаг 3,4 еще два раза с Интервал между 1-2 мин.
6. После получения сильные сигналы от трех 60 мм рт.ст. испытаний, выполнить экспериментальные Вспучивания.
   1. Многие исследования использовать градуированные distensions начиная при низком давлении (10-15 мм рт.ст.) и работает до вредных давлениях (75-80 мм рт.ст.) в 10-15 шагом мм рт. Смотреть репрезентативные результаты ниже Например следов при различных давлениях.
   2. Типичные испытания включают в себя интервал 20 сек prepressure, вздутие давление испытание 20 сек, и 1-2 мин Интервал между.
   3. Выполните три Вспучивания на каждом давлении, а затем в среднем по трем испытаний (для получения одного ответа висцеромоторный для каждого давления). В альтернативном способе, сerform пять distensions на каждом давлением, отказаться от высоких и низких испытания, а затем в среднем оставшиеся три ответа.
7. После того, как экспериментальные distensions являются полными, остановить запись, сохраните файл эксперимент, и пожертвовать животное с использованием утвержденных методов.

4. Анализ сырье ЭМГ Следы

1. Анализ ответов висцеромоторный (т.е. EMG записи) легко сделать с помощью бортового программного обеспечения дигитайзер или через программу стороннего (Список Материалы) Следующие инструкции приведены общие инструкции, которые могут быть использованы для анализа этих данных с помощью нескольких программ или с помощью ручного анализа .
2. Чтобы экспортировать EMG, давление, и сигнальные стимулом данные дигитайзер программного обеспечения выполните следующие действия:
   1. Откройте экспериментальный файл.
   2. Нажмите кнопку "Файл", "Экспорт в".
   3. Изменить тип файла на "таблица текст (. TXT)," имя файла и нажмите кнопку "Сохранить".
   4. В рор-окно, изменить выходную частоту сэмплов "1000," изменить время начала сбора данных момент начала и изменить время окончания, чтобы "MaxTime ()". Установите флажок маркировку "выход временного сдвига так первая строка 0.0 сек, "и нажмите" ОК ".
   5. Данные теперь будут экспортированы в текстовый файл, который можно открыть в различных программах. Файл должен содержать четыре столбца (таймер, VMR (ЭМГ), давление, Стимул).
3. Для каждого подопытного животного испытания, выполните следующие математические операции.
   1. Устранить сигнал EMG для всего набора данных путем вычисления абсолютного значения каждого момента времени.
   2. Определить среднюю реакцию ГРП в разделе о предпосылках эксперимента.
   3. Вычтите эту среднюю фона EMG ответ от всех ректификованного точки данных в эксперименте для получения фона исправленный набор данных.
   4. Определить площадь под кривой (AUC) для каждого 20 с предварительноИнтервал давления в фоновом режиме скорректированного набора данных.
   5. Определите AUC для каждого 20 сек суда живота давление в фоновом скорректированного набора данных.
   6. Разделите каждый живота давление пробную AUC (полученного на стадии 4.3.5) по самой низкой интервала prepressure AUC от всего эксперимента (полученного на стадии 4.3.4.). Это нормированные и фоновая скорректированная AUC за каждый полный суда растяжения полости матки давление.
4. Для каждого подопытного животного, в среднем несколько нормированные испытания от одного давлении с получением нормализованное VMR в вольтах * сек (VSEC).
5. Выполните соответствующие статистические данные о данных в зависимости от эксперимента.

Результаты

Иллюстрация общей установки UBD-VMR можно видеть на фиг.1А. Шаги Повышение давления вызывают увеличение сырьевого VMR (т.е. ЭМГ) (рис. 1В). Сырой VMR, давление, и стимулом маркер сигнал, что следует соблюдать во время записи с помощью дигитайзер программного обеспечения можно увидеть на рисунке 2. Верхний канал видели в Рисунок 2 является следом ЭМГ (в V). Фоновый сигнал следа EMG должна быть устойчивой и низкой амплитуде (<0,2 В). Если фон ...

Обсуждение

У людей, интерстициальный цистит / мочевого пузыря болевой синдром (IC / БТС) представляет собой значительный клиническую проблему, потому что пациенты изнурительной боли, которая часто не реагируют на регулярной лечения боли ^15. Одна из основных проблем в понимании и в конечном счете лечения хронической боли в мочевом пузыре, чтобы понять, нормальные нервные процессы, которые участвуют в борьбе с вредными живота мочевого пузыря. Для того чтобы преодолеть эту проблему, животной модели боли мочевого пузыря явл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инфракрасное отопительное одеяло и система мониторинга	Kent Scientific	Right-Temp System	Эта система настроена на мониторинг двух отдельных температур. Это должно включать в себя животное и одеяло с подогревом. Кроме того, система может автоматически регулировать температуру для поддержания заданной температуры. Однако эта автоматическая функция создает электрические помехи во время записи ЭМГ и должна быть отключена. Кент может предоставить аккумуляторную батарею для грелки для использования во время записи riEMG в рамках эксперимента.
Изофлуран вапорайзер	Draeger	Vapor 19.1	Подойдет любой изофлуран вапорайзер, но полезно иметь тот, который имеет несколько зазубрин от 0 до 2% изофлурана.
Изофлуран	из нескольких источников	н/д
100% кислородный баллон для воздуха	нескольких источников	н/д	Для вентиляции животного
Воздух для дыхания	нескольких источников	н/д	Для расширения мочевого пузыря
24 г 0,56 в внутривенном катетере	BD Biosciences	381411	Для катетеризации мочевого пузыря
Surgilube (стерильный)	Savage Laboratories	0281-0205-02	Подойдет любая хирургическая смазка.
Минеральное масло (стерильное)	несколько источников	н/д
Солевой раствор (стерильный)	несколько источников	н/д
AG8W Серебряная проволока, 2 м, 0,20 мм (.008 дюйма) D, L, без изоляции	Уорнер Инструментс	W4 64-1318	Подойдет любая серебряная проволока с этими характеристиками. Проволока не нуждается в "хлорировании."
Офтальмологическая мазь	несколькими источниками	н/д
Маленькие хирургические ножницы	с несколькими источниками	н/д
21 G Игла	с несколькими источниками	н/д
Усилитель Grass P511 с 3-х отведенным входным кабелем	Grass Instruments	P511 ( F-P5IC3/REV1)	Это "усилитель", используемый в протоколе. Усилитель со следующими настройками: Калибратор = 1 мВ; Lo freq = 300 Гц; Усиление = 20; Hi freq = 10 кГц; Линейный фильтр = вход.
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (или эквивалент)	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	Это «дигитайзер», используемый в протоколе. Другие системы дигитайзеров от WINDAQ или других компаний будут работать нормально; Требуются входы для сигнала давления, ЭМГ и сигнала стимула.
Программное обеспечение CED Spike2	Cambridge Electronic Design	Spike 2	Это "программное обеспечение для дигитайзера", используемое в протоколе. Должен быть от того же производителя, что и дигитайзер.  Программа должна быть настроена с 3 каналами для измерения давления (шкала 0-100 мм рт.ст.), сигнала ЭМГ (обычно от -5 до +5 В) и диапазона маркера стимула (0-2 В).
Схема процесса от воздушного бака к катетеру мочевого пузыря	н/д	/д	Последовательность соединений от баллона с сжатым воздухом к мочевой пузырю животного:  Воздушный бак до 1/4 в трубке к расходомеру Gilmont к Y-образному соединителю. Ответвление 1 Y-образного соединителя к сфигмоманометру. Ответвление 2 на одиночный вход на 4-ходовом ганг-клапане на 4-ходовой выход клапана на синхронизированный регулятор давления на трубку 3/32 от синхронизированного регулятора давления к 2-му соединителю Y (ответвление 1 к сфигмоманометру) с ответвлением 2 на 3/32 трубки  на 3-й Y-образный коннектор.  Ветвь 1 Y-образного соединителя с 3-м сфигмоманометром и ветвь 2 с катетером мочевого пузыря животного.
Расходомер Gilmont	Gilmont	GF8321-1401	Будут работать расходомеры нескольких марок. Для растяжения воздуха в мочевом пузыре расходомер должен быть способен выдерживать высокое давление (например, этот измеритель Гилмонта).  Для воздуха для дыхания скорость потока должна быть отрегулирована в сторону до 100 мл/мин (типичная скорость мыши составляет 500-1 000 мл/мин).
4-ходовой клапан	Gang Elite		Это специфическое оборудование. Клапан Elite предназначен для аквариумов при низком давлении воздуха. В установке для растяжения мочевого пузыря этот клапан действует как предохранительный клапан в случае скачков давления. Слишком высокое давление при первоначальном включении бака приведет к выходу из строя датчика давления в регуляторе давления с ограниченным временем и/или сфингнометрах. Кроме того, обеспечивая небольшую утечку в системе, этот клапан облегчает регулировку давления в пределах 10-80 мм рт.ст.
1/4 дюйма Трубка	с несколькими источниками	н/д
3/32 дюйма Трубка	с несколькими источниками	н/д
Разъемы "Y" (1/4 и 3/32 дюйма)	несколько источников	н/д
Сфигмоманометр	CVS		Любой аналоговый сфигмоманометр из аптеки подойдет для этого приложения.
Регулятор давления с заданным временем	на заказ		Это специально изготовленная машина (Вашингтонский университет в Сент-Луисе Машинный цех), которая позволяет автоматизировать подачу давления, включая оцифровку давления воздуха, контроль длины испытания, автоматизацию интервалов между испытаниями, контроль номера испытания и цифровой сигнал начала стимула. Тем не менее, основными компонентами системы (давление при включении и выключении в течение определенного испытательного периода) можно было управлять с помощью простого встроенного переключателя.   Такой аналоговый контроль испытания потребовал бы дополнительных параметров анализа (см. Протокол 4).  Кроме того, при анализе данных пришлось бы вручную назначать давление на основе аналогового сфигмоманометра.
IGOR Pro	Wavemetrics	н/д	Для анализа сигнала ЭМГ. Для анализа данных в этих экспериментах можно использовать множество различных типов программного обеспечения.