Здесь представлен протокол, включающий интегрированное концентрирование, обогащение и колориметрическое обнаружение патогенов пищевого происхождения в больших объемах сельскохозяйственной воды. Вода фильтруется с помощью модифицированных тампонов Мура (MMS), обогащенных селективными или неселективными средами, а обнаружение осуществляется с помощью бумажных аналитических устройств (μPAD), встроенных в бактериально-индикативные колориметрические субстраты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Колориметрический бумажной основе Обнаружение
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает быстрое колориметрического обнаружения кишечной палочки, бактерии рода сальмонелла., И листерий от больших объемах (10 л) сельскохозяйственных вод. Здесь вода фильтруется через стерильный модифицированных Moore мазков (MMS), которые состоят из простого марлевый фильтр, заключенный в пластмассовый картридж, чтобы сконцентрировать бактерии. После фильтрации неселективные или селективные обогащения для целевых бактерий выполняются в MMS. Для колориметрического обнаружения бактерий-мишеней, что обогащение затем анализировали с использованием бумажных аналитические приборы (μPADs) со встроенными бактерий-индикативные субстратов. Каждый субстрат реагирует с целевым показателем-бактериальных ферментов, генерируя окрашенные продукты, которые можно обнаружить визуально (качественного определения) на μPAD. Кроме того, цифровые изображения прореагировавших μPADs могут быть получены с общим сканирования или фотографических устройств и проанализированы с помощью ImageJ программного обеспечения, AlLowing для более объективной и стандартизированной интерпретации результатов. Хотя биохимические процедуры скрининга предназначены для выявления вышеупомянутых бактериальные патогены, в некоторых случаях ферментов, продуцируемых фона микробиоты или деградации колориметрических подложек может привести к ложным положительным. Таким образом, подтверждение с использованием более дискриминационный диагностики необходим. Тем не менее, это бактериальная концентрация и обнаружения платформа стоит недорого, чувствительны (0,1 КОЕ / мл предел обнаружения), легко выполнить, и быстрый (концентрация, обогащение, и обнаружение выполняются в течение примерно 24 часов), оправдывая его использование в качестве первоначального метода скрининга для микробиологического качества сельскохозяйственной воды.
Введение
Важно, чтобы возбудителей болезней пищевого происхождения быстро и предпочтительно обнаружены в полевых условиях на основе в целях снижения бремени болезней пищевого происхождения. Общие стратегии для выявления пищевого происхождения бактериальные патогены включают биохимический профилирование, селективный и дифференцированного культивирование, иммунологическую изоляцию и обнаружение, и молекулярный обнаружения. Однако эти методы препятствуют спорадической загрязнения, небольшие размеры выборки проверенные, зачастую низкие концентрации пищевого происхождения патогенных бактерий, требуют длительного времени для обработки, и / или не применимы для полевых условиях. Кро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Концентрация бактерий из больших объемов сельскохозяйственного воды с помощью MMS
- MMS Подготовка
- Вырежьте прямоугольное сечение 4-слойной марли измерения 40 х 12 см.
- Сложите марлю вдоль обеих осей, чтобы получить прямоугольник 20 х 6 см.
- Рулон марлю плотно вдоль его длинной оси, чтобы сформировать цилиндрическую тампон примерно 6 см и 3 см в диаметре.
- Автоклав марлю тампон в алюминиевую фольгу, не автоклав кассету. Дезактивации кассету, погрузив его в течение 30 мин в 10% бытовой отбеливатель, и деактивировать остаточного хлора путем замачивания кассету в течение 15 мин в пентагидрата тиосульфата натрия (Na 2<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как описано в данном протоколе, концентрация бактерий, использующих MMS (рис. 1) может быть выполнена в течение примерно 15-20 мин. В MMS в построенные из акрилонитрил-бутадиен-стирола (ABS) в двух отдельных компонентов; Крышка и картридж и с интегрированным патрубком сборки в которой цилиндрический марлю тампон вставлен (рис. 1А). Оба компонента ввинчивается затем вместе формирования MMS (рис. 1В). Обработка MMS основе приводится в движение с батарейным питанием перист.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает интегрированный способ обнаружения E. палочка, сальмонелла., Л. моноцитогенес в сельскохозяйственном воды. Здесь концентрация MMS бактерий из больших объемов (10 л) сельскохозяйственной водой, соединен с бактериальным обогащения, и бактериально-колориметрический указывает обнаружение с помощью μPADs. Процедура MMS может справиться с высоким содержанием твердых частиц в пробах воды, концентрируясь бактерий в 10 раз, является надежной и достаточно простой для полевых заявлений минимально о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы с благодарностью признательны за финансирование этого проекта от грантов Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США 2009-01208 и 2009-01984.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сельскохозяйственная вода | Оросительная вода, промывочная вода, колодезная вода и т. Д. | ||
| Виниловая трубка | Wilmar | BN-CVT1005 | Внутренний диаметр 1/4 дюйма, Внешний диаметр 3/8 дюйма, доступен по адресу: http://www.wilmar.com |
| Модифицированный картридж Moore Swab | Lumiere Diagnostics | 11 ½ см в длину и 4 ½ см в ширину, доступно по адресу: http://www.lumierediagnostics.com. В качестве альтернативы можно использовать одноразовый вариант картриджа (см. текст) | |
| Марля | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Марка #90, переплетение 44 x 36, доступно в: |
| www.raglady.com Бытовой отбеливатель | Различная | концентрация гипохлорита натрия ок. 6% | |
| Тиосульфат натрия 5-гидрат | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Коллектор | Встроенный на месте | Опционально, устройство может быть изготовлено из труб ПВХ и соответствующих фитингов | |
| Перистальтический насос | Микронные измерители | RPP1300 | Доступно в: http://www.micronmeters.com |
| Серологическая пипетка | Различные | одноразовые, 10 мл | |
| Универсальный бульон для предварительного обогащения | Difco | 223510 | |
| Буферизованная пептона вода | Difco | 218105 | |
| добавка сальмонеллы | Biomé rieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Бульон | Biomé rieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Различные | Drummond DP-110 используемые здесь | |
| Встряхивающий инкубатор | Различные | Excella E25, Нью-Брансуик Научный использован здесь | |
| Микропипетка | Различные | 10 μ l, 1 мл | |
| Наконечники для микропипеток | Various | Barrier, 10 μ l, 1 мл | |
| 1,5 микроцентрифужные пробирки | Различные | РНКазо- и ДНКазные зондовые | |
| ультразвуковые аппараты | Q Sonica LLC | XL-2000 серия | |
| &микро; PADs | Avant | Напечатанные воском круги диаметром 7 мм, с толщиной линии 4 пт. Свяжитесь с доктором Чарльзом Генри для получения дополнительной информации | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′ -2-этансульфоновая кислота] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Хлорфенол красный-галактопиранозид (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-бромо-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-глюкуронид (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-бром-6-хлор-3 индолилкаприлат (пурпурный каприлат) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Бромо-4-хлор-мио-инозитолфосфат (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Чашки Петри, полистирол 100 мм на 15 мм | Различные | стерильные | |
| плоские сканеры | Различные | Xerox USB | |
| сканеры Программное обеспечение ImageJ | Национальные институты здравоохранения | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Ссылки
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
