Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Колориметрический бумажной основе Обнаружение

14.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51414

⸱

9 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Wyoming, 2Department of Chemistry, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 4Department of Animal Sciences, Colorado State University, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Food Science and Human Nutrition, Citrus Research and Education Center, University of Florida, 7Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол, включающий интегрированное концентрирование, обогащение и колориметрическое обнаружение патогенов пищевого происхождения в больших объемах сельскохозяйственной воды. Вода фильтруется с помощью модифицированных тампонов Мура (MMS), обогащенных селективными или неселективными средами, а обнаружение осуществляется с помощью бумажных аналитических устройств (μPAD), встроенных в бактериально-индикативные колориметрические субстраты.

Аннотация

Этот протокол описывает быстрое колориметрического обнаружения кишечной палочки, бактерии рода сальмонелла., И листерий от больших объемах (10 л) сельскохозяйственных вод. Здесь вода фильтруется через стерильный модифицированных Moore мазков (MMS), которые состоят из простого марлевый фильтр, заключенный в пластмассовый картридж, чтобы сконцентрировать бактерии. После фильтрации неселективные или селективные обогащения для целевых бактерий выполняются в MMS. Для колориметрического обнаружения бактерий-мишеней, что обогащение затем анализировали с использованием бумажных аналитические приборы (μPADs) со встроенными бактерий-индикативные субстратов. Каждый субстрат реагирует с целевым показателем-бактериальных ферментов, генерируя окрашенные продукты, которые можно обнаружить визуально (качественного определения) на μPAD. Кроме того, цифровые изображения прореагировавших μPADs могут быть получены с общим сканирования или фотографических устройств и проанализированы с помощью ImageJ программного обеспечения, AlLowing для более объективной и стандартизированной интерпретации результатов. Хотя биохимические процедуры скрининга предназначены для выявления вышеупомянутых бактериальные патогены, в некоторых случаях ферментов, продуцируемых фона микробиоты или деградации колориметрических подложек может привести к ложным положительным. Таким образом, подтверждение с использованием более дискриминационный диагностики необходим. Тем не менее, это бактериальная концентрация и обнаружения платформа стоит недорого, чувствительны (0,1 КОЕ / мл предел обнаружения), легко выполнить, и быстрый (концентрация, обогащение, и обнаружение выполняются в течение примерно 24 часов), оправдывая его использование в качестве первоначального метода скрининга для микробиологического качества сельскохозяйственной воды.

Введение

Важно, чтобы возбудителей болезней пищевого происхождения быстро и предпочтительно обнаружены в полевых условиях на основе в целях снижения бремени болезней пищевого происхождения. Общие стратегии для выявления пищевого происхождения бактериальные патогены включают биохимический профилирование, селективный и дифференцированного культивирование, иммунологическую изоляцию и обнаружение, и молекулярный обнаружения. Однако эти методы препятствуют спорадической загрязнения, небольшие размеры выборки проверенные, зачастую низкие концентрации пищевого происхождения патогенных бактерий, требуют длительного времени для обработки, и / или не применимы для полевых условиях. Кроме того, соединения во многих пищевых матриц ингибирующее к обнаружению и диагностических применений. Для того, чтобы повысить вероятность микробного обнаружения, США пищевых продуктов и медикаментов предположил, что тестирование сельскохозяйственной воды (например, воды для стирки и воды для орошения), которые либо вступает в контакт с большой площадью поверхности свежих продуктов или служит средством для рзагрязнение roduce является жизнеспособной альтернативой прямого тестирования пищи 1. Тем не менее, часто низкий естественный возбудитель-нагрузка в сочетании с эффекта разбавления представительного сельскохозяйственной пробы воды делает Методы подготовки образца для концентрации патогенов важное значение. Такой способ требует выборки больших объемов воды (≥ 10 л), адекватной патогена-концентрации, и совместимость с последующих стратегий обнаружения.

Модифицированные Мур тампоны (MMS) недорогие, простые и прочные устройства, используемые для концентрации бактерий из больших объемах (≥ 10 л) воды 2-4. MMS состоит из пластикового кассеты, заполненной марли, который служит в качестве фильтра грубой очистки для больших объемов воды прокачивается через кассету с использованием перистальтического насоса. MMS является недискриминационный метод концентрации бактерий (≥ концентрации в 10 раз), которая фиксирует органические и неорганические частицы материала в том числе микроорганизмов в обрабатываемой LiQuid образцы. Вполне вероятно, что отлично эффективность концентрации целевых микроорганизмов со стороны MMS можно объяснить тем, что микроорганизмы, как ожидается, быть присоединены к ил-глинистой фракции или органических микро-агрегатов взвешенных твердых частиц 3. Прочная конструкция из MMS позволяет для преодоления большинство недостатки, связанные с другими методами фильтрации для захвата и концентрации бактерий из воды, таких как засорение фильтров, неспособность обрабатывать большие объемы, образцов фильтров с высокой мутности и высокой стоимости. По этим причинам, FDA рекомендует, чтобы MMS'S быть включены в официальных процедур процедур сбора проб окружающей среды и производить связанных 5.

Здесь описан способ для концентрации, обогащения и обнаружения кишечной палочки, бактерии рода сальмонелла., И листерий из сельскохозяйственных вод. MMS используется для концентрации BactEria, а также служит в качестве емкости для селективного или неселективного бактериального обогащения. Бактериальный обнаружения достигается биохимически с помощью бумажных аналитические приборы (μPADs) 6. μPADs могут быть изготовлены как жидкостных сетей или местная испытаний с использованием различных методов, включая фотолитографии, струйной печати, тиснения и воск печати 7-11. Примеры жидкостных конструкций могут быть дендритные структуры канала, где образец, размещенные в центре, а затем течет в дистальных водоемов или отдельных канальных картин, в которых образец или субстрат вытащил из внешних водоемов канала под действием капиллярных сил в центр 12. Для этого протокола, мы решили использовать для 7-мм диаметра воск-бумажной пятна массивов вложенных с хромогенных субстратов, которые могут быть обработаны ферментами свидетельствует о тестируемых микроорганизмов здесь: Хлорфенол красный β-D-галактопиранозида (CPRG) и 5 ​​- бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронида (X-Gluc)для обнаружения β-галактозидазы и β-глюкуронидазы производимого Е. палочка; 5-бром-6-хлор-3-индолил каприлат (пурпурный каприлат) для обнаружения С8-эстеразы производимого сальмонелла.; и 5-бром-4-хлор-3-индолил-мио-инозит фосфат (X-InP) для обнаружения фосфатидилинозитол конкретных фосфолипазы С (PI-PLC) получают путем L. моноцитогенес 6. Таким образом, наличие определенной бактерии можно наблюдать визуально без необходимости в сложном оборудовании или интерпретации данных. Специфичность и чувствительность фермента на основе колориметрического обнаружения μPAD этих конкретных целевых бактерий была исследована ранее 6. Кроме того, чувствительность метода интегральной концентрации обнаружения для этих целевых бактерий оценивали пики больших объемов воды с заранее определенных уровней микроорганизмов (неопубликованные данные и Bisha соавт. 13).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Концентрация бактерий из больших объемов сельскохозяйственного воды с помощью MMS

  1. MMS Подготовка
    1. Вырежьте прямоугольное сечение 4-слойной марли измерения 40 х 12 см.
    2. Сложите марлю вдоль обеих осей, чтобы получить прямоугольник 20 х 6 см.
    3. Рулон марлю плотно вдоль его длинной оси, чтобы сформировать цилиндрическую тампон примерно 6 см и 3 см в диаметре.
    4. Автоклав марлю тампон в алюминиевую фольгу, не автоклав кассету. Дезактивации кассету, погрузив его в течение 30 мин в 10% бытовой отбеливатель, и деактивировать остаточного хлора путем замачивания кассету в течение 15 мин в пентагидрата тиосульфата натрия (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) раствор (50 мг / л подготовлен в стерильной воде).
    5. Вставьте тампон в кассету MMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется многоразовая версия кассеты MMS, начните с 4-слойной листе марлю меняasuring 80 х 22 см, сложите его до 40 х 11 см и свернуть его в цилиндр примерно 11 см высотой и 6 см в диаметре.
    6. Соберите MMS.
    7. Присоединить винилового шланга к патрубками на обеих сторонах MMS, обеспечивая трубка полностью прилипает к патрубками, и зафиксировать шланг в перистальтического насоса. Убедитесь, что трубы вверх по течению от перистальтического насоса имеет достаточную длину для отбора проб.
  2. Концентрация бактерий
    1. Образец не менее 10 л сельскохозяйственной воды, запустив перистальтического насоса на высокой скорости.
    2. После отбора проб завершена, снять перистальтический вход насоса из образца воды и продолжать работать насос, пока не выходящий воды не наблюдается выхода из MMS.
    3. Если многообразие используется для запуска нескольких образцов одновременно, собирать эффлюента каждого MMS, а когда 10 л фильтруют через один MMS закрыть клапан для этого конкретного MMS и продолжать работать насос.
      1. При отборе проб Iы завершена, снять перистальтический вход насоса из сельскохозяйственного воды, открыть все клапаны коллектора, и продолжать работать насос, пока не выходящий воды не наблюдается выхода из ММСС.
  3. Когда концентрация была завершена для всех ММСС, осторожно снимите виниловую трубку от патрубка MMS и крышки цапфы на обеих сторонах MMS. Плотно закрывают MMS можно хранить в течение до 12 часов, прежде чем добавлять СМИ обогащению.

2. MMS по обогащению и подготовки образцов

  1. Обогащение
    1. Отвинтите крышку из MMS, и в асептических условиях добавляют 20 мл соответствующей стерильной бульона обогащения. Используйте одну MMS для каждого избирательного обогащения. Кроме того, выполнить неселективное обогащение распространять все три целевые бактерии в том же образце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется многоразовая версия кассеты MMS, асептических удалить марли фильтр из кассеты и поместить в стерильный пакет перед объявлениемдинь 225 мл соответствующего СМИ обогащения.
      1. Для обогащения Е. палочка, добавляют 20 мл забуференного пептон воды (BPW) с добавлением 8 мг / л ванкомицина гидрохлорида.
      2. Для обогащения бактерии рода сальмонелла., Добавить 20 мл BPW дополненные с Salmonella дополнение (4 мл / л).
      3. Для обогащения L. моноцитогенес, добавить 20 мл VIDAS UP Listeria (LPT) бульоне.
      4. Для одновременного неселективного обогащения для всех трех микроорганизмов с помощью одного MMS, использовать универсальный preenrichment бульон (СПБ).
    2. Винт крышку MMS обратно на плотно. Убедитесь, что патрубки плотно закрыты, чтобы не пролить и возможного загрязнения во время обогащения.
    3. Инкубируйте MMS на срок до 18-24 часов в дрожащей инкубаторе при 200 оборотах в минуту. Используйте 42 ° С в течение Е. палочка и сальмонелла. селективные обогащения. Используйте 30 ° C для L. моноцитогенес селективное обогащение, и использовать 37 & #176; C для неизбирательного обогащения.
  2. Подготовка образцов
    1. При инкубации завершена, удалите MMS из инкубатора, Открывать один из патрубка и осторожно обходиться примерно 0,5 мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. С другой стороны, открутить MMS и пипетку вне 0,5 мл ночной обогащения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется не-одноразовые версия кассеты MMS, пипетки 0,5 мл обогащения из мешка.
    2. Для колориметрического анализа Е. палочка селективное обогащение или для анализа неселективных обогащения, разрушать ультразвуком 0,5 мл обогащения на 5 Вт, 22 кГц в течение 20 секунд с помощью ультразвукового зонда.

3. Подготовка и внедрение колориметрических субстратов в μPADs

  1. Подготовьте μPADs для каждого образца и цели испытания. Для обнаружения E. палочка подготовить CPRG и Х-Gluc μPADs, для бактерии рода сальмонелла. Обнаружение подготовить MC μPADs, и для L. monocytОбнаружение ogenes подготовить X-InP μPADs.
    1. Подготовка HEPES буфера [0,1 М HEPES с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)] для колориметрических субстратов и регулировать рН буфера в соответствии с подложки, которая будет использоваться: рН 7,5 для приготовления CPRG или X-Gluc, рН 9 для MC, и рН 7 для X-InP.
    2. Подготовка исходные растворы субстратов в рН, доведенным HEPES буфера при концентрации 3 мМ (CPRG), 62,5 мМ (X-Gluc), 15 мм (MC), 100 мм (X-InP). Защита растворы от света.
    3. Поместите μPADs внутри стерильную чашку Петри, затем вложить в Microspot μPAD с 24 мкл каждого раствора субстрата.

4. Обнаружение и анализ данных

  1. Обнаружение
    1. Добавить 6 мкл обогащенного образца к каждой соответствующей μPAD микропятне, содержащегося в чашке Петри.
    2. Установите крышку обратно на чашку Петри и запечатать его парафильмом.
    3. Выдержите образецс μPAD при 37 ° С в течение до 3 часов, чтобы позволить для развития цвета и сушки микропятен.
  2. Визуальный осмотр результатов
    1. Выполните обнаружение простым осмотром цветовых изменениями μPADs.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, сильные реакции, которые производят окончательные изменения цвета, как ожидается, следующее 18-24 часов обогащения, которая должна исключить необходимость в дополнительных разъяснений и должна считаться положительным результатом.
    2. Определить присутствие Е. палочка положительный образец, наблюдая микропятен вложенные с изменением CPRG от желтого до красно-фиолетового и микропятен вложенных с X-Gluc изменения от бесцветного до сине-зеленого.
    3. Определить наличие L. моноцитогенес положительный образец, наблюдая микропятен вложенные с X-InP изменения от бесцветного до индиго.
    4. Определить наличие бактерии рода сальмонелла. Положительная проба на наблюдения микропятен вложенных с MC изменения от седловинебесцветных до пурпурно-лиловый.
  3. Программное обеспечение автоматизированного анализа данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вел четко определить, являются ли положительными или отрицательными слабые реакции и для того, чтобы полу-количественный анализ результатов.
    1. Позвольте μPADs полностью высохнуть.
    2. Сканирование μPAD используя сканер с плоским слоем.
    3. Использование программного обеспечения ImageJ для обработки изображения.
      1. "Открытый" отсканированное изображение должны быть проанализированы в ImageJ расположенной на вкладке "Файл" в главном меню (или нажмите «ЦПТ + O").
      2. Инвертировать изображение выбрав "Инверсия", расположенную на вкладке "Правка" в главном меню (или нажмите "Clt + Shift + I").
      3. Используйте вкладку "Анализ" в главном меню и выберите "Сделать Измерения ...", чтобы выбрать в отчетности измерений анализируются.
      4. Убедитесь, что "Среднее серый интенсивность", "Ограничение до порога", и "Этикетка Дисплей" коробкипроверил, и нажмите "OK". устанавливается, как программное обеспечение анализирует каждую область выбранный и как она сообщает об этом.
      5. Используйте "Овал" инструмент, чтобы нарисовать круг, описывающий область, которую вы хотите измерить в.
      6. На вкладке "Анализ" выберите "Измерить" (или нажмите "Clt + M"). Программное обеспечение будет измерять среднюю серый интенсивность в области, определенной и сообщить об этом на экране всплывающее окно, которое может быть скопировать и вставить, чтобы преуспеть для дальнейшего анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для уточнения анализов, должны быть выполнены по крайней мере, два технических повторов каждого образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как описано в данном протоколе, концентрация бактерий, использующих MMS (рис. 1) может быть выполнена в течение примерно 15-20 мин. В MMS в построенные из акрилонитрил-бутадиен-стирола (ABS) в двух отдельных компонентов; Крышка и картридж и с интегрированным патрубком сборки в которой цилиндрический марлю тампон вставлен (рис. 1А). Оба компонента ввинчивается затем вместе формирования MMS (рис. 1В). Обработка MMS основе приводится в движение с батарейным питанием перист...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает интегрированный способ обнаружения E. палочка, сальмонелла., Л. моноцитогенес в сельскохозяйственном воды. Здесь концентрация MMS бактерий из больших объемов (10 л) сельскохозяйственной водой, соединен с бактериальным обогащения, и бактериально-колориметрический указывает обнаружение с помощью μPADs. Процедура MMS может справиться с высоким содержанием твердых частиц в пробах воды, концентрируясь бактерий в 10 раз, является надежной и достаточно простой для полевых заявлений минимально о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы с благодарностью признательны за финансирование этого проекта от грантов Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США 2009-01208 и 2009-01984.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сельскохозяйственная водаОросительная вода, промывочная вода, колодезная вода и т. Д.
Виниловая трубкаWilmarBN-CVT1005  Внутренний диаметр 1/4 дюйма,   Внешний диаметр 3/8 дюйма, доступен по адресу:  http://www.wilmar.com
Модифицированный картридж Moore Swab Lumiere Diagnostics11 ½ см в длину и 4 ½ см в ширину, доступно по адресу: http://www.lumierediagnostics.com.  В качестве альтернативы можно использовать одноразовый вариант картриджа (см. текст)
МарляChesapeake Wiper & Supply, Inc.CC90Марка #90, переплетение 44 x 36, доступно в: 
www.raglady.com Бытовой отбеливательРазличнаяконцентрация гипохлорита натрия ок. 6%
Тиосульфат натрия 5-гидратMallinckrodt Baker Inc8100-04
КоллекторВстроенный на местеОпционально, устройство может быть изготовлено из труб ПВХ и соответствующих фитингов
Перистальтический насосМикронные измерителиRPP1300Доступно в:  http://www.micronmeters.com
Серологическая пипеткаРазличныеодноразовые, 10 мл
Универсальный бульон для предварительного обогащенияDifco223510
Буферизованная пептона водаDifco218105
добавка сальмонеллыBiomé rieux Industry42650http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) БульонBiomé rieux Industry410848http://www.biomerieux-usa.com
VancomycinSigma-Aldrich861987http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-AidРазличныеDrummond DP-110 используемые здесь
Встряхивающий инкубаторРазличныеExcella E25, Нью-Брансуик Научный использован здесь
Микропипетка Различные10 μ l, 1 мл
Наконечники для микропипетокVariousBarrier, 10 μ l, 1 мл
1,5 микроцентрифужные пробиркиРазличныеРНКазо- и ДНКазные зондовые
ультразвуковые аппаратыQ Sonica LLCXL-2000 серия
&микро; PADsAvant Напечатанные воском круги диаметром 7 мм, с толщиной линии 4 пт. Свяжитесь с доктором Чарльзом Генри для получения дополнительной информации
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′ -2-этансульфоновая кислота]Sigma-AldrichH3375
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA8022
Хлорфенол красный-галактопиранозид (CPRG)Sigma-Aldrich59767
5-бромо-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-глюкуронид (X-Gluc)Sigma-AldrichB8174
5-бром-6-хлор-3 индолилкаприлат (пурпурный каприлат) Sigma-Aldrich53451
5-Бромо-4-хлор-мио-инозитолфосфат (X-InP)Sigma-Aldrich38896
Чашки Петри, полистирол 100 мм на 15 ммРазличныестерильные
плоские сканерыРазличныеXerox USB
сканеры Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохраненияhttp://rsb.info.nih.gov/ij/

Ссылки

  1. Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
  4. McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
  5. Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , Administration USFaD. (2013).
  6. Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
  9. Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
  10. Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
  11. Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
  12. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).
  13. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJ
Колориметрический бумажной основе Обнаружение
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.