Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

MALDI-масс-спектрометрический изображений по расследованию метаболитов в

18.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51434

⸱

5 марта 2014 г.

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

В этой статье

Краткое содержание

Масс-спектрометрическое томография (MSI) представляет собой мощный инструмент, который может использоваться, чтобы обнаружить и идентифицировать различные химические вещества в здоровых тканей, сохраняя соединений в их родных средах, которые могут обеспечить новому взглянуть на биологические процессы. В этом способ MSI разработана для анализа малых молекул описывается.

Аннотация

Большинство методов, используемых для изучения малых молекул, таких как фармацевтические препараты или эндогенных метаболитов, использовать тканевые экстракты, которые требуют гомогенизации интересующей ткани, которые потенциально могут вызвать изменения в метаболических путей изучаемых 1. Масс-спектрометрическое томография (MSI) является мощным аналитическим инструментом, который может обеспечить пространственную информацию аналитов в неповрежденных ломтиками образцов биологических тканей 1-5. Этот метод широко используется для изучения различных типов соединений, включая белки, пептиды, липиды и малых молекул, таких как эндогенных метаболитов. С матрицей-активированная лазерная десорбция / ионизация (MALDI)-MSI, пространственные распределения нескольких метаболитов может быть зарегистрировано одновременно. При этом метод, разработанный специально для проведения нецелевых Метаболомика MSI эксперименты на бобовых корней и корневых клубеньков представлен которые могут раскрыть понимание биологических процессов, происходящих.Метод, представленный здесь показана типичная MSI рабочий процесс, от подготовки образцов до получения изображения, и фокусируется на шаге матрица приложений, демонстрируя несколько методик матрица приложений, которые полезны для обнаружения малых молекул. Как только изображения MS генерируются, анализ и идентификация метаболитов интерес обсуждается и продемонстрировал. Стандартный рабочий процесс, представленный здесь могут быть легко изменены для разных типов тканей, видов молекул, а также приборов.

Введение

Развивающейся области метаболомики имеет много важных биологических приложений, включая биомаркеров, расшифровке метаболических путей в растениях и других биологических систем, и токсикологии профилирования 4,6-10. Основной технической задачей при изучении биологических систем является изучение metabolomic пути, не нарушая их 11. MALDI-MSI позволяет прямого анализа здоровых тканей, что позволяет чувствительное обнаружение аналитов в отдельных органах 12,13 и даже отдельных клеток 14,15.

Подготовка образца является важным шагом в производстве воспроизводимых и надежных массовых спектральных изображений. Качество изображений в значительной степени зависит от таких факторов, как ткани вложение среды, толщина среза, MALDI матрицы, и техники матрица приложений. Для приложений визуализации, идеально толщина раздел ширина одной клетки (8-20 мкм в зависимости от типа образца). MALDI требуется отложение органического, кристаллинэ матрица соединение, как правило, слабая кислота, на образце, чтобы помочь анализируемого абляции и ионизацию. 16 Различные матрицы обеспечивают различную интенсивность сигнала, мешающие ионы и эффективности ионизации различных классов соединений.

Техника нанесения матрица также играет роль в качестве массовых спектральных изображений и различных методов являются подходящими для различных классов веществ. Три способа матрица приложений представлены в данном протоколе: аэрография, автоматический опрыскиватель, и сублимация. Матрица приложение Аэрограф широко используется в MALDI изображений. Преимущество применения матрицы аэрографа в том, что он относительно быстро и легко. Тем не менее, качество матрицы применения аэрографа в значительной степени зависит от мастерства пользователя и имеет тенденцию быть менее воспроизводимым и вызвать диффузию аналитов, особенно малые молекулы 17. Автоматические системы распылитель имеют схожие механики для аэрографа матрицу приложения, но ВГАе был разработан для удаления изменчивость видели с ручного нанесения аэрографии, делая спрей более воспроизводимым. Этот метод иногда может быть более трудоемким, чем традиционные применения аэрографа матрицы. Оба руководство аэрография и автоматические системы распылитель не содержат растворителей на основе методов матрица приложений. Сублимация представляет собой сухую Техника нанесения матрица, которая становится все более и более популярным для массового спектральных изображений метаболитов и малых молекул, так как уменьшает анализируемого диффузии, однако ему не хватает растворитель необходимо извлечь и наблюдать более высокие массовые соединения 18.

Уверенный идентификация метаболитов обычно требует точных измерений массовых получить предполагаемые идентификации последующим тандемной масс (MS / MS) экспериментов для проверки, с МС / МС спектры время по сравнению со стандартами, литературы, или теоретических спектров. В этом протоколе высоким разрешением (масса разрешающей способности 60 000 на м / Z 400), жидкостной хроматографии (LC)-МС соединен с MALDI-MSI получить как пространственную информацию и уверенно идентификации эндогенных метаболитов, используя Medicago truncatula корни и корневые клубеньки как биологической системы. MS / MS эксперименты могут быть выполнены непосредственно на ткани с MALDI-MSI или на тканевых экстрактов с ЖХ-МС и используется для проверки идентификации метаболитов.

Этот протокол обеспечивает простой метод для сопоставления эндогенных метаболитов в М. truncatula, который может быть адаптирован и применен к MSI малых молекул в различных типах тканей и биологических системах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Измерительные приборы

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. Используйте масс-спектрометр, оснащенный MALDI источником для анализа малых молекул (см. таблицу материалов / оборудования). Выполнение поглощений в положительном или отрицательном режиме ионов в зависимости от интерес аналитов. Указание массовый диапазон интересов и собирать 500 лазерных вспышек / участок, на 50 мкм с интервалом в обоих направлениях х и у размеров по всей поверхности образца, чтобы генерировать ионные изображения. Ширина растра и количество лазерных импульсов можно регулировать, чтобы получить более высокое пространственное разрешение и максимальную интенсивность сигнала соответственно. Используйте матричные пики DHB или внутренние стандарты, применяемые к слайду или непосредственно в ткани для калибровки масс-спектры.
  2. Высокое разрешение ЖХ-МС. (См. Таблицу материалов / оборудования) выполнения примера экстракты с ЖХ-МС с использованием либо с обращенной фазой (RP) LC с С-18 колонке, или нормальной фазы (НП) с колонна HILIC в зависимости от анализируемых интересов. Используйте подвижных фаз иградиенты, как подходящие для конкретного типа образца. Выполните приобретений в положительных или отрицательных режимах ионных зависимости от типа образца.

2. Тканевый препарат

  1. Обрежьте клубеньковых от завода, в результате чего 3-4 мм, корня, прикрепленные к узелка.
  2. Сразу после вскрытия с помощью пинцета, чтобы поместить ткань в криостате чашку и покрывают с желатином (100 мг / мл в деионизированной воде). Это имеет важное значение для ткани, чтобы застрять в нижней части чашки без каких-либо воздушных пузырьков.
  3. Флэш заморозить ткани, поместив чашку в сухой лед / этанол до тех пор, желатин не затвердевает и становится непрозрачным. Храните образцы при -80 ° С до использования.
  4. Удалить образцы от -80 ° C морозильник, отрезать пластиковую криостата чашку и обрежьте излишки желатин. Установите встроенный ткани криостата патрон с десяти центов размера суммы оптимальной температуры резания (ОКТ) средства массовой информации, в то время как не давая октября касаться ткани. Место в криостатне боксировать, пока не затвердеет октября.
  5. Разрешить патрон и желатин, чтобы уравновесить в коробке криостата (установлен на -20 или -25 ° C) в течение примерно 15 мин.
  6. Используйте криостат (см. таблицу материалов / оборудования) к разделу ткани примерно толщина одной клетки (8-20 мкм в зависимости от типа ткани) и оттепель монтировать каждый ломтик на стекло ITO покрытием согреть его спиной (не ITO покрытием сторона) с ITO покрытием стекло на задней руке. Поместите ITO покрытием сторону утепленной горкой возле замороженной ткани ломтик и позволить кусочек придерживаться на слайде. Размещение разделы близко друг к другу на слайде обеспечит лучшую координацию во MSI.

3. Матрица Применение

  1. Аэрограф Применение MALDI Matrix
    1. Все процедуры аэрография должны выполняться в вытяжном шкафу.
    2. Тщательно очистите аэрограф решения контейнера и сопло (см. таблицу материалов / оборудования) с метанолом изаполнить контейнер с раствором DHB матричного раствора (150 мг / мл в 50% methanol/0.1% ТФУ об / об).
    3. Держите аэрограф примерно 35 см от образца и применить 10-15 слоев матрицы на поверхности слайда с продолжительностью 10 секунд разбрызгиванием и 30 сек времени сушки в между слоями.
    4. Тщательно очистите аэрограф снова метанолом, когда закончите, чтобы избежать засорения от матричного решения.
  2. Автоматическая Распылитель Применение MALDI Matrix
    1. Следуйте инструкциям пуско-наладочные, предоставляемые производителями системы автоматического опрыскивателя.
    2. Для MSI метаболитов в корневых клубеньков с использованием 40 мг / мл (в 50% methanol/0.1% ТФУ об / об) DHB в качестве матрицы, установить температуру до ~ 80 ° C, скорость до 1250 мм / мин, скорость потока 50 мкл / мин, и число проходов до 24. Для лучшего охвата, рекомендуется, чтобы повернуть насадку 90 ° и / или смещение сопла 1,5 мм между каждого прохода. Начните метод опрыскиватель.
      В сиде примечание, конкретная система распылитель используется здесь нагревает сопло для более быстрого испарения растворителя. По мере испарения растворителя, концентрация матрицы быстро возрастает. Матрица, приложенное к образцу с аэрографом и автоматического опрыскивателя имеют сопоставимые концентрации.
    3. Следуйте отключение инструкциям производителей автоматической системы опрыскивателя.
  3. Сублимация Применение MALDI Matrix
    1. Взвесить 300 мг DHB в нижней части камеры выгонки (см. таблицу материалов / оборудования).
    2. Придерживайтесь предметное стекло в холодном пальце (верхняя часть камеры выгонки) с срезы ткани вниз с двусторонним, проводящей ленты. Покройте всю заднюю часть слайда с помощью двухсторонней ленты для даже проводимости, производя даже матрицы осаждения.
    3. Зажим верхней и нижней половин камеры выгонки вместе с C-зажим. Подключите вакуум и объявлениег льда и холодной воды к началу водохранилища.
    4. Поместите камеры выгонки в нагревательным кожухом, который при комнатной температуре.
    5. Включите вакуумный насос. Подождите 15 минут и включите отопление мантии. Нагревательным кожухом должна достигать 120 ° C в течение 10 мин.
    6. Через 10 мин, выключите огонь, закройте клапан в вакууме (так внутри камеры остается под вакуумом) и выключите вакуумный насос.
    7. Разрешить камера до комнатной температуры, открыть клапан выпуская разрежение и удаления образца. Размер камеры выгонки будет определить количество матрицы сублимированной на предметное стекло. Более крупные сублимации камеры (размером с 400 мл стакан) будет использовать около 300 мг DHB то время как меньшие камеры (размер стакан емкостью 150 мл) будет использовать около 100 мг DHB и потребует резки предметное стекло так, чтобы он подходит в камере.

4. Приобретение изображения

    <литий> Марк шаблон + на каждом углу образца с ручкой WiteOut коррекция жидкости, которые будут использоваться как "учат точек». Поместите предметное стекло в MALDI адаптера слайд пластины и принять оптическое изображение образца с помощью сканера.
  1. Настроить файл получения изображений с использованием этой программы на приборной компании с растровой размером шага 50 мкм и лазерным диаметром, равным или меньшим, чем размер шага растра. На этой конкретного инструмента, минимальное значение лазер дает лазерное диаметр настройки лазера около 10 мкм и небольшой имеет диаметр 40-50 мкм.
  2. Загрузите оптическое изображение в программное обеспечение и выровнять тарелку с оптического изображения.
  3. Калибровка прибора перед началом приобретение с использованием общих матричных кластерные ионы, внутренние стандарты, или калибровки микс.
  4. Указать участки ткани должны быть проанализированы с MSI, в том числе пятна чистого матрицы на слайде, который будет использоваться в качестве "пустой".
  5. Начните переменного токаquisition.

5. Генерация изображения

  1. Откройте файл изображений в коммерчески доступного программного обеспечения, предоставляемой фирмой и извлечь ионные изображения. Другие программы с открытым исходным кодом доступен для MSI обработки данных 19.

6. Метаболита Идентификация

  1. Выбор конкретного M / Z представляет интерес с масс-спектре при помощи конкретного поставщика программного обеспечения (см. таблицу материалов / оборудования). Аналит можно отличить от матрицы иона когда пик аналита, выбранного из масс-спектра и ионные изображения генерируются специально локализована в разделе ткани.
  2. Создайте список анализируемых интересов и выполнять MS / MS экспериментов. См. таблицу 1 и таблицу 2 в Представитель результаты выборочных списков веществ.
  3. Выполните адресный анализ LC-MS на масс-спектрометре высокого разрешения (или с высоким разрешением MALDI-MS при наличии) для получения точноймассовые измерения аналитов интересов, а также выполнять LC-MS/MS целевых аналитов получить характерные модели фрагментации.
  4. Выполните базу данных поиска, чтобы определить предполагаемые идентификации для целевых аналитов. Примеры метаболитов баз данных включают в себя: Метлин, ChemSpider, PubChem, KEGG и HMDB.
  5. Чтобы подтвердить предполагаемые идентификации от точного поиска масса баз данных, соответствует МС / МС от целевых аналитов МС / МС спектров стандартов, литературы, и / или программного обеспечения прогнозирования фрагментации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальный обзор MSI показан на рисунке 1. В самом начале эксперимента, пробоподготовка является важным шагом. Узелки удаляются из корня растения и заливали в желатин. Ткань должна быть нажата квартиру против криостата чашки, без пузырьков, во время его заморожены, при этом достигается легче и надлежащее выравнивание ткани во время его срезы. Когда ткань в настоящее время нарезанный, важно, чтобы сократить ткани на должном толщины; слишком тонкий секций порвется, разрушая целостность тканей, в то...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как уже говорилось выше, пробоподготовка является наиболее важным шагом в рабочем процессе MSI. Встраивание ткани неравномерно вызовет секционирования быть трудно или не возможно в некоторых случаях. Размер раздела и адекватное время установления равновесия имеют решающее значение для поддержания целостности тканей и избежать складывания и слезы. Выбор матрицы и метода нанесения будет играть роль в определении видов анализируемых чтобы быть замеченным, пространственное разрешение и воспроизводимость результатов. Использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность доктору Жан-Мишель Ане в Департаменте агрономии в UW-Мэдисон для предоставления образцов truncatula Medicago. Эта работа была частично поддержана финансирование от Национального научного фонда (NSF) грант CHE-0957784, Университет Висконсина Высшая школа и Висконсин выпускников исследовательский фонд (WARF) и программа Romnes факультет исследовательский грант (для LL). Е.Г. подтверждает получение NSF Высшее исследовательский грант (DGE-1256259).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЖелатинDifco214340heatдля растворения
Cryostat- HM 550Thermo Scientific956564A
Стеклянные слайды с покрытием из оксида индия олова (ITO) Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 мм x 75 мм x 0,8 мм (ширина x длина x толщина)
матрица 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB)ICN BiomedicalsPI90033
АэрографPaasche Airbrush CompanyTG-100Dв сочетании со стальным контейнером объемом 75 мл
Автоматическая система матричного распыления - TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX. ТМСП. H021-UКонкретные инструкции по запуску и останову будут даны при установке прибора
Сублимационное устройство Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Вакуумный насос- Alcatel 2008 ИдеальныйвакуумP10976Предельное предельное давление = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
FlexImagingBruker Daltonics269841Один из примеров "специализированного программного обеспечения"
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZПрибор высокого разрешения MALDI для точных измерений массы
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRПрибор высокого разрешения LC-MS для точных измерений массы

Ссылки

  1. Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
  2. van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
  3. Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
  4. Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
  5. Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
  6. Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
  7. Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
  8. West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
  9. Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
  10. Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
  11. Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
  12. Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
  13. Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
  14. Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
  15. Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
  16. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  17. Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
  18. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
  19. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
  20. Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
  21. Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
  22. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
  23. Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
  24. Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
  25. Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
  26. Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
  27. Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
  28. Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MALDI-масс-спектрометрический изображений по расследованию метаболитов в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.