Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Краткое содержание

Взаимодействия между белками являются основополагающими для всех клеточных процессов. Использование биолюминесценции резонансный перенос энергии, взаимодействие между парой белков можно контролировать в живых клетках и в реальном времени. Кроме того, эффекты потенциально патогенных мутаций могут быть оценены.

Аннотация

Анализы, основанные на Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) обеспечивают чувствительные и надежные средства контроля за белок-белковых взаимодействий в живых клетках. BRET является безызлучательное передача энергии от «донора» фермента люциферазы к «акцепторной» флуоресцентного белка. В наиболее общем конфигурации этом анализе донор Renilla reniformis люциферазы и акцептора желтый флуоресцентный белок (YFP). Поскольку эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, наблюдение явления BRET требует, чтобы донор и акцептор находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя представляющих интерес белков в культивируемых клетках млекопитающих, один белок экспрессируется в виде слияния с люциферазы, а второй в виде слияния с YFP. Взаимодействие между двумя представляющих интерес белков может привести донора и акцептора достаточно близко для передачи энергии происходит. По сравнению с другими методами для исследования белок-белковых ввзаимодействий, анализ BRET чувствителен, требует мало практического времени и несколько реагентов, и способен обнаруживать взаимодействия, которые слабы, преходящее, или зависит от биохимической среде найденного в живой клетке. Поэтому идеальный подход для подтверждения предполагаемых взаимодействий предложенные дрожжей двух гибридных или масс-спектрометрии протеомики исследований, и, кроме того это хорошо подходит для отображения взаимодействия регионов, оценивает эффект от пост-трансляционных модификаций на белок-белковых взаимодействий, и оценки воздействия мутаций, выявленных в ДНК пациента.

Введение

Оба классическая связь и следующего поколения секвенирования анализ нарушений в организме человека являются выявление клиническую значимость белков, участвующих в диапазоне биологических путей. Это часто бывает, что до их идентификации в таких исследований, было мало или вообще не исследование биологической роли этих белков. Один плодотворным начать изучение биологической функции белка интереса является определить, какие другие белки он взаимодействует с в физиологическом контексте. Характеризуя молекулярные сети таким образом дает представление о биологических путей, лежащих в основе фенотипа человека.

Наиболее часто используемый масштабный скрининг подходов для идентификации партнеров кандидатов взаимодействия белков, представляющих интерес, дрожжи двугибридная скрининг ¹ и масс-спектрометрии на основе протеомики ^2. Эти методы могут быть очень успешным в предложении потенциальных взаимодействующих белков, но аре уязвимы к ложным положительным результатам. Таким образом, подтверждение взаимодействия, определенных дрожжей двух гибридных или массового скрининга спектрометрии требуется проверку взаимодействия с использованием второго технику. Обычно со-иммунопреципитацию или тянуть вниз анализ используют для этой цели ^3. Одним из недостатков использования таких методов для проверки является требование к лизису клеток, которая разрушает внутриклеточные условия, которые могут быть необходимы для поддержания определенных белковых взаимодействий. Вторым недостатком является то, что слабые или переходные белковых взаимодействий может быть нарушена во время стадий промывки. Кроме того, эти анализы требуют значительных практического времени, ограничены в количестве образцов, которые могут быть обработаны одновременно, и часто требуют много времени оптимизации реагентов и протоколов.

Чтобы преодолеть некоторые из проблем, связанных с со-иммунопреципитации экспериментов, несколько анализы были разработаны на основе флуоресцентных и bioluminescent белки, которые могут быть использованы в живых клетках. Первые такие анализы были основаны на флуоресценции (или Ферстер) резонансный перенос энергии (FRET), не-лучистого переноса энергии между двумя флуоресцентных белков с перекрытием спектров испускания и возбуждения ^4. Эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, поэтому наблюдение явления FRET требует, чтобы доноров и акцепторов флуорофоры находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя белками, представляющих интерес, один белок экспрессируется в виде слияния с донорного флюорофора (обычно голубой флуоресцентный белок; CFP) и второй виде слитого с акцепторного флюорофора (обычно желтого флуоресцентного белка; YFP). Взаимодействие между двумя белками интересов может привести донора и акцептора флуорофоры достаточно близкие для передачи энергии происходят, что приведет к ощутимым увеличением эмиссии света от YFP акцепторной относительно донора CFP. FRET успешно обнаружения белок-белковых взаимодействий в живых клетках ^4. Основным недостатком использованием FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий является требование наружного освещения для возбуждения доноров флуорофора. Внешние результаты освещенности в высоком фоне в сигнале выбросов, нежелательного возбуждения акцептора и фотообесцвечивания как донора и акцептора флуорофорами. Эти эффекты уменьшить чувствительность анализа для обнаружения белок-белковых взаимодействий.

Модификация FRET анализа, который преодолевает проблему высокой фоне из наружного освещения является передача Биолюминесценция резонансной энергии (BRET) анализ ^5,6. В системе BRET донор флуорофор заменен фермента люциферазы. Таким образом, энергия возбуждения акцепторного флюорофора генерируется внутри системы окислением люциферазы субстрата, что делает ненужным внешний освещение. В наиболеестандартная конфигурация этого анализа, донором является Renilla reniformis люциферазу и акцептора YFP (для обсуждения альтернативного донора и акцепторных белков см. Pfleger соавт. ^5). Соответственно, в этой системе, представляющий интерес белок слит с люциферазы и потенциально-взаимодействующего белка к YFP, или наоборот. BRET анализ требует добавления коэлентеразина в качестве субстрата для люциферазы. Поскольку целентеразин является проницаемым для клеток, можно выполнить BRET анализов в живых клетках. Тем не менее, родной целентеразин неустойчиво в водном растворе, и фермент-независимый пробой коэлентеразина и снижает концентрацию субстрата, доступной для анализа и генерирует autoluminescence, что снижает чувствительность измерений активности люциферазы. Использование BRET в живых клетках было облегчено развитию охраняемых coelenterazines, устойчивых в водном растворе, но расщепляются цитозольным эстеразыс после диффузии через клеточную мембрану, чтобы генерировать активный коэлентеразина внутри клетки ^7.

После добавления субстрата в клетках, экспрессирующих люциферазы-и YFP-слитые белки, передача энергии в результате белок-белковых взаимодействий количественно путем мониторинга выбросов от люциферазы и YFP. Поскольку белковые взаимодействия можно контролировать непосредственно в живых клетках в мульти-луночных планшетах, анализ BRET представляет собой простую, масштабируемую способ проверки предполагаемых взаимодействий, что является экономически и эффективный по времени.

В дополнение к проверке предполагаемых interactors выявленных в протеомных скрининговых исследований, система BRET также может быть использован для тестирования кандидатов interactors, вытекающих из предыдущих биохимических и структурных исследований по представляющим интерес белком. После того, как существование белок-белкового взаимодействия было установлено (либо с помощью анализа BRET или другими методами), существует возможность BRET анализ быть EMPloyed далее характеризуют взаимодействие. Например, взаимодействующие участки могут быть отображены путем генерации усеченные варианты белков, и вовлечение специфических остатков в взаимодействия может быть продемонстрирована путем создания точечных мутаций. Кроме того, модулирующее действие посттрансляционных модификаций или малых молекул (например, лекарственных препаратов или лигандов) на белок-белковых взаимодействий могут быть исследованы ^8-10.

BRET анализ также имеет большой потенциал для исследования мутаций, выявленных в ДНК пациента. В случаях, когда была создана причинную роль для мутации, изучении влияния мутации на белок-белковых взаимодействий с помощью BRET может выявить больше о молекулярном этиологии фенотипа ^11. С появлением методик секвенирования следующего поколения, становится все более распространенным в течение нескольких потенциально повреждающих мутации, которые будут определены в течение индивидуума, и в этом случае остается неясным, которые РелеВант в фенотипе ^12. В этой ситуации анализ BRET может быть ценным в оценке воздействия мутаций на функцию белка и, следовательно, их актуальность для расстройства.

Протокол

1. Создание плазмид

1. Субклонировани кДНК для каждого интересующего белка в обоих векторов pLuc и pYFP, ​​с использованием стандартных способов молекулярной биологии (рис. 1). Подробные протоколы см. Зеленый и др. ^13.
2. Последовательность всех строит, чтобы убедиться, что белки интересные в рамке с последовательностью Люк / YFP без промежуточных стоп-кодонов.
3. Выполнение функциональных анализов по желанию, чтобы подтвердить, что слитые белки сохраняют биологическую активность. В случае представленной здесь внутриклеточной локализации слитых белков YFP было установлено путем флуоресцентной микроскопии.
4. Сделать плазмиды экспрессии для соответствующих белков управления Люк и YFP инженерными соответствующие сигналы таргетинга в векторы экспрессии pLuc и pYFP. В случае, представленном здесь, генерировать ядерных таргетингом Luc и YFP конструкции, вставив сигнал ядерной локализации в векторы pLuc и pYFP.
5. Делатьположительное конструкция управления, в котором Люк и YFP слиты в единый полипептид. В случае, представленном здесь, генерировать положительный контроль, в котором кодирующая последовательность YFP вставлен в вектор pLuc.
6. Выбор нейтральный наполнитель плазмиды, которые будут использоваться для выравнивания массу ДНК в трансфекции смесей. Использование плазмиды, которая не имеет эукариотический промотор и, следовательно, будет транскрипционно неактивный в клетках млекопитающих, таких как бактериальный клонирующий вектор.

2. Подготовка ДНК Mixes

1. Оценить концентрацию всех плазмид, описанных в разделе 1 на основе поглощения при 260 нм (1 оптическая плотность единица эквивалентна 50 мкг / мл ДНК). Определить молекулярную массу каждой плазмиды путем умножения количества пар оснований на 650 дальтон. С помощью концентрации и молекулярную массу вычислить молярную концентрацию каждого препарата плазмиды. Развести препараты плазмидной ДНК в концентрации 36 нМ. Это будут рабочие запасы, который будет использоваться для приготовления смесей ДНК для трансфекции.
2. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 1800 нг плазмиды наполнителя в конечном объеме 20 мкл воды.
3. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
4. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции и 5 мкл pYFP контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
5. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл положительного контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
6. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки гомодимеризации белка интересов, X. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл РуFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
   А) pLuc-контроль и pYFP-X
   Б) pLuc-X и pYFP-контроль
   С) pLuc-X и pYFP-X
7. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки взаимодействия между парой белков, представляющих интерес, X и Y. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл pYFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
   А) pLuc-контроль и pYFP-X
   Б) pLuc-X и pYFP-контроль
   С) pLuc-контроль и pYFP-Y
   D) pLuc-Y и pYFP-контроль
   Е) pLuc-X и pYFP-Y
   F) pLuc-Y и pYFP-X

3. Трансфекцию

1. Урожай субконфлюентные HEK293 клетки от 75 см ² колбы. Развести 10% от общего количества клеток в 13 мл культуральной среды. Внесите 130 мкл клеточной суспензии в каждую лунку белыйпрозрачным дном 96-луночного планшета для культуры ткани. Культуры клеток течение 24 часов.
2. Рассчитайте количество скважин для трансфекции путем умножения количества миксов ДНК на 3. Принесите бессывороточную культуральной среды до комнатной температуры. Подготовка основной смеси, содержащей 6,3 мкл бессывороточной среды и 0,18 мкл реагента для трансфекции на лунку. Смешайте на вортексе и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
3. Подготовка трансфекции смеси путем добавления 2 мкл смеси ДНК в 20 мкл сыворотки средний / трансфекции реагента мастер-микса. Не вихрь. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Трансфекции три скважины с каждым трансфекции смеси дозирования 6,5 мкл трансфекции смеси в каждую лунку. Культура клетки для дальнейшего 36-48 часов.

4. Измерение BRET сигнала

1. Растворите живых клеток субстрата люциферазы в 34 мг / мл в ДМСО встряхиванием.
2. Развести восстановленного субстрата люциферазы живых клеток на 1:1000 в подложки разбавления среды рповторно нагревали до 37 ° С. Разрешить 50 мкл субстрата разбавления среды на каждую лунку. Vortex перемешать. Может образовываться осадок, но не будет мешать анализа.
3. Аспирируйте культуральной среды из 96-луночного планшета. Внесите 50 мкл разбавленного субстрата люциферазы живых клеток в каждую лунку. Культуры клеток, по крайней мере 2 часов (до 24 ч).
4. Удалить крышку с 96-луночного планшета и инкубировать пластины в течение 10 мин при комнатной температуре внутри люминометра.
5. Измерьте излучение Люком и YFP одной хорошо одновременно. Измерьте излучение Luc используя фильтр блокировки длины волн длиннее 470 нм. Измерьте излучение YFP ​​использованием 500-600 нм полосовой фильтр. Интеграция сигналы выбросов в течение 10 сек.

5. Анализ данных

1. Среднее значение на основании показаний выбросов Luc от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов Luc производить значения выбросов Luc фоновые вычитается.
2. Среднее значение на основании показаний выбросов YFP от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов YFP производить значения выбросов YFP фоновые вычитается.
3. Для каждой лунки, разделить значение выбросов YFP фона вычитается на величину выбросов, Люк фон вычитается дать нескорректированного соотношение Брет.
4. Нормальное нескорректированных отношения Брет из трех скважин, которые были трансфицированных только pLuc-контрольной плазмиды. Вычтите это значение от всех других неисправленных отношений BRET дать скорректированные коэффициенты Брет.
5. Для каждого из оставшихся наборов исправленных коэффициентов BRET, усреднить значения за три трансфектированных скважин для получения конечного соотношение Брет.

Результаты

Принцип BRET анализа показан на рисунке 2. Установка анализ используется во всех экспериментах, представленных здесь изображен на рисунке 3. Обнаружение сильного сигнала от BRET клеток, трансфицированных слитого белка люциферазы-YFP подтвердил, что передача энергии можно было наблюдать в этом экспериментальной установки (рис. 4).

Наше исследование фокусируется на роли семьи FOXP транскрипционных репрессоров в развитии мозга. Гетерозиготные м...

Обсуждение

Конструкция экспрессирующих конструкций гибридного белка является важным шагом в создании Брет анализа. В экспериментах, представленных здесь, белки, представляющие интерес, слит с С-концом люциферазы или YFP. Кроме того, возможно, и может быть необходимым, чтобы сплавить протеины к N-концу люциферазы / YFP. Для некоторых белков, слитых могут быть приняты только либо на N-или С-конца во избежание нарушения структуры и функции белков. Кроме того, для трансмембранных белков, в которых не указан и С-концы которого проживаю...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Nanodrop 8000	Nanodrop		Подойдет любой спектрофотометр, способный считывать поглощения на длине волны 260 нм. Определение молекулярной массы плазмиды имеет решающее значение для расчета количества ДНК, которое будет использоваться в трансфекционных смесях.
96-луночные планшеты, плоское дно, белые	Greiner Bio One	655098	White уменьшают перекрестные помехи между лунками и максимизируют чувствительность обнаружения люминесценции. Скважины с открытым дном позволяют контролировать плотность ячеек. Планшеты должны быть пригодны для культивирования клеток. При использовании люминометра с верхним считыванием крышку пластины следует снять.
Считыватель пластин Infinite F200Pro с управляющим программным обеспечением	TECAN		Используйте фильтры «Blue 1» и «Green 1» для измерения люминесценции, а также наборы фильтров и дихоичное зеркало для GFP для измерения флуоресценции. Подойдет любой считыватель пластин с верхним считыванием и возможностью измерения двухцветной люминесценции и флуоресценции.
pLuc, pYFP, плазмиды положительного контроля	Н/Д	/Д	Плазмиды предоставляются авторами по запросу.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Филлерная плазмида для уравновешивания массы ДНК в трансфекционных смесях. Подойдет любая плазмида, в которой отсутствует эукариотический промотор.
клетки HEK293	ECACC	85120602	другие клеточные линии, которые трансфектируют с разумной эффективностью.
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, с феноловым красным	Gibco	41966	Это среда, используемая для культивирования клеток HEK293. Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед применением. Если вы используете другую клеточную линию, замените описанную здесь питательную среду на среду, специфичную для клеточной линии.
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, без фенолового красного (среда для разбавления субстрата)	Gibco	21063	Это среда для разбавления субстрата, используемая для разбавления субстрата люциферазы (EnduRen), поскольку она не содержит фенолового красного, что снижает чувствительность анализа. Содержит HEPES для поддержания правильного pH во время измерений люминесценции, когда клетки находятся вне инкубатора CO2. Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед применением.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM используется для разведения реагента для трансфекции GeneJuice. Также подойдут другие среды, не содержащие сыворотки. Перед использованием подогреть до комнатной температуры.
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270	Для добавления питательных сред клеточных культур в концентрации 10% v/v.
Реагент для трансфекции GeneJuice	Novagen	70967	При использовании клеточной линии, отличной от HEK293, может потребоваться корректировка соотношения реагента для трансфекции Genejuice и ДНК в смесях для трансфекции. Могут быть использованы и другие реагенты для трансфекции. При использовании альтернативного реагента для трансфекции может потребоваться оптимизация количества ДНК, используемой в смесях для трансфекции, в соответствии с инструкциями производителя.
DMSO	Sigma	D2650	Используйте стерильный ДМСО, подходящий для культивирования тканей.
Субстрат для живых клеток EnduRen	Promega	E6481	восстанавливает EnduRen в концентрации 34 мг/мл в ДМСО. При разведении EnduRen в питательной среде может образоваться осадок. Это не помешает проведению анализа. Магазин восстановлен EnduRen при температуре -20 °°; C и избегать многократных циклов замораживания-оттаивания. Убедитесь, что восстановленный EnduRen полностью разморожен, прежде чем разбавлять его в питательной среде.