Методическая статья

Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

DOI:

10.3791/51443

⸱

19 июня 2014 г.

 ,  , 
1School of Medical and Molecular Biosciences, Faculty of Science, University of Technology, Sydney, 2Centre for Health Technologies, Faculty of Engineering and Information Technology, University of Technology, Sydney, 3The Sydney Head and Neck Cancer Institute, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описан способ извлечения малые РНК из сыворотки крови человека. Мы использовали этот метод, чтобы изолировать микроРНК от рака сыворотки для использования в массивах ДНК, а также однокомпонентных количественной ПЦР. Протокол использует фенола и гуанидиния тиоцианат реагенты с изменениями, и получают высокое качество РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ РНК и ее выражения является общей чертой во многих лабораториях. Важное значение имеет появление малых РНК, как микроРНК, которые находятся в клетках млекопитающих. Эти малые РНК являются мощными регуляторами ген, контролирующий жизненные пути, такие как рост, развитие и смерть и большим интересом была направлена ​​на их выражения в жидкостях организма. Это связано с их регуляции в человеческих заболеваний, таких как рак и их потенциального применения в качестве сыворотки биомаркеров. Тем не менее, анализ микроРНК выражения в сыворотке может быть проблематичным. В большинстве случаев количество сыворотки ограничения и сыворотка содержит небольшое количество общей РНК, из которых малые РНК составляют лишь 0,4-0,5% 1. Таким образом, изоляция достаточного количества качественного РНК из сыворотки является основной проблемой для исследователей сегодня. В этом техническом документе, мы демонстрируем метод, который использует только 400 мкл сыворотки крови человека, чтобы получить достаточную РНК или для массивов ДНК или анализа КПЦР.dvantages этого метода являются его простота и способность приносить высокое качество РНК. Она не требует специализированных колонки для очистки малых РНК и использует общие реагенты и оборудование, найденные в общих лабораториях. Наша методика использует блокировки гель фазу для устранения загрязнения фенола в то же время получают высокое качество РНК. Мы также ввести дополнительный шаг для дальнейшего удаления все загрязнения во время стадии выделения. Этот протокол является очень эффективным при выделении выходы общей РНК до 100 нг / мкл из сыворотки, но также могут быть адаптированы для других биологических тканей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы наблюдается растущий нажим для того чтобы обнаружить новые биомаркеры для раннего выявления заболеваний человека. Большое внимание было сосредоточено на использовании малых РНК, такие как микроРНК 2 (микроРНК или Мирс) в качестве потенциальных маркеров. Эти малые РНК находятся в жидкостях организма, таких как сыворотка и исследования показали, что они устойчивы к деградации и стабильны в широком диапазоне различных условий окружающей среды 3. Учитывая эти особенности, сыворотки или циркулирующие микроРНК являются идеальным биомаркеров 4, 5. В настоящее время существует два основных подхода к выделению малых РНК из биологических жидкостей. Первый подход использует технологию столбца на основе связывать и вымывания малые РНК 6, в то время как второй подход использует давние протокол с фенолом и гуанидиния тиоцианатных реагентов 7. Мы разработали простой и эффективный, колонка без протокола, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки крови человека. Выделенный РНК немедленноленно использовать в последующих применений, в том числе олигонуклеотидных ДНК массивов и РНК последовательности.

Этот протокол был разработан, потому что мы столкнулись с несколькими вопросами при использовании на основе фенола методы, чтобы изолировать РНК из сыворотки. Традиционный подход Chomczynski часто используется в большинстве лабораторий с диапазоном реагентов, доступных на большинстве коммерческих поставщиков. Однако, учитывая их широкое применение, строгие правила не были разработаны, чтобы постоянно производить высококачественный РНК из жидкостей организма, в частности, крови или сыворотке.

Общие проблемы, связанные с выделения РНК из сыворотки включают низкие урожаи РНК и загрязнения с реагентов, используемых в процессе выделения, в частности фенола. Наш подход устраняет эти фенольные загрязнений обеспечить высокое качество РНК для последующей анализа, таких как количественной ПЦР (КПЦР) и РНК последовательности. Далее мы тестировалась РНК на массивах микроРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: образцы сыворотки крови человека от здоровых пациентов или пациентов с раком были получены с информированного согласия при утвержденных этических протоколов человека от Королевского больница Принца Альфреда Сиднее (протокол номер X10-0016 и HREC/10/RPAH/24) и Технологическом университете, Сидней. Образцы сыворотки были получены от пациентов до операции из различных больницах Сидней и помещают на хранение при -80 ° С.

1. Малый Выделение РНК из сыворотки

Общую РНК получают из сыворотки крови человека с использованием модифицированной версии протокола LS Tri-Реагент RT.

  1. Размораживайте образец сыворотки на льду, а затем передать 400 мкл свежей талой сыворотки в меченым микроцентрифужных трубки.
  2. Развести сыворотку со 100 мкл РНКазы свободной H 2 O и добавить протеиназы К в концентрации 1 мг / мл.
  3. Инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин, чтобы позволить белка пищеварение протеиназой К.
  4. То обеспечить полное растворение, добавить 1,5-кратном объеме Tri-реагента РТ LS и 100 мкл 4-броманизола.
  5. Кратко инвертировать гомогената, выполнять повторяющиеся пипетирование в течение 5 сек и передачи в меченым 2 мл Тяжелая Фаза блокировки трубки.
  6. Спин гомогената при 12000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
  7. Тщательно слейте по крайней мере 1 мл полученного водного раствора в свежий ДНК LoBind трубки. Органический и межфазного следует ловушке под белым гелем трубки фазовой автоподстройки.
  8. Добавить 5,0 мкл гликогена (5 мг / мл) и 500 мкл 100% изопропанола в водном растворе, смешивают путем инверсии, и инкубировать O / N при -20 ° С.
  9. После O / N инкубации, центрифуги образец течение 20 мин при 12000 х г в 4 ° C центрифуге.
  10. Откажитесь от прозрачного супернатанта и выполнить "Flash" спина в течение 2 мин при 16000 × г в 4 ° C центрифуге.
  11. Осторожно снимите четкое зольution окружающих гранул с помощью пипетки.
  12. Промыть гранулу с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин. Слейте промывочного раствора и повторите мыть шаг.

2. РНК Ресуспендирование в раствор

  1. Ресуспендируют гранул в 10 мкл РНКазы свободной H 2 O, обеспечение осадок полностью не растворится. Чтобы гарантировать, что РНК полной солюбилизации образца может быть нагрета до 55 ° С в течение 5 мин. В течение этого времени смешивания образца с повторным пипетки. Для более высокой общим выходом РНК, бассейн два РНК препараты из того же пациента.
  2. Количественной оценки РНК ресуспендировали с помощью UV-VIS спектрофотометр и оценки качества РНК с использованием 2100 Bioanalyzer. Храните объединенных образцов РНК при -80 ° С для использования в последующих применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 представляет собой типичный UV / VIS спектр РНК, выделенной из сыворотки. Из этого профиля уже отмечалось загрязнения белка при 280 нм с фенолом и органических загрязнений и при 270 нм и 230 нм, соответственно. Остаток гуанидиния Тиоцианат Было также отмечено, при 260 нм. Для уменьшения загрязнений, ряд шагов по оптимизации были сделаны в стандартный Tri-реагента процедуры RT-LS. Мы добавили 5 мг / мл гликогена, чтобы увеличить как общий выход РНК и уменьшить загрязнение (черные линии,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Популяция микроРНК составляет примерно 0,4-0,5% от общей РНК, найденного в сыворотке крови. Кроме того есть также высокое содержание белка, обнаруженного в сыворотке крови человека. Для улучшения РНК и снизить как белок и фенола загрязняет мы изменили традиционный подход Chomczynski 9 с добавлением нескольких шагов.

Общую РНК выделяли из сыворотки с использованием стандартного Tri-реагентов RT-LS (Molecular Research Centre), однако, когда выполняется в нашей лаборатории, этот мето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Там нет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Саманта Хури и Памела Ajuyah поддерживаются Австралийской последипломного премии. Мы также хотели бы выразить признательность за трансляционных исследований рака Сеть, Лоуи исследования рака центр, Университет Нового Южного Уэльса и исследования рака Unit Северная Поступательное для их дополнительной поддержки Саманта Хури.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центр молекулярных исследованийРТ ЛСTR 118
РНКазы свободный H<суб>2ОGIBCO Invitrogen10977-023
Протеиназа КФиннзимы, ФинляндияEO0491
Тяжелая фазовая блокирующая трубка5PRIME2302830емкостью 2 мл
ДНК Лобиндовая пробиркаEppendorf0030 108.0781,5 мл емкость
ГликогенInvitrogen, США10814-0105 мг/мл
РНК класс изопропанолаSigma Aldrich, СШАI9516100%
Охлаждаемая центрифугаJohn Morris
Nanodrop UV-Vis спектрофотометрThermo Fisher Scientific, США
РНК этанол классаSigma Aldrich, СШАE702370%
Биоанализатор Agilent 2100Agilent, США
, США

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
  2. Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
  3. Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
  4. Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  6. Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
  7. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
  8. Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
  9. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
  10. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
  11. Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
  12. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
  13. Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
  14. Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
  15. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
  16. McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Phase Lock GelBioanalyzer

Похожие статьи