Методическая статья

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

DOI:

10.3791/51446

⸱

27 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1LENS - European Laboratory for Non-linear Spectroscopy, University of Florence, 2Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 3Department of Biology, University of Florence, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5National Institute of Optics-National Research Council, Italy, 6International Center of Computational Neurophotonics

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем инструменты и методы обнаружения одиночных флуоресцентно меченных белковых молекул, взаимодействующих с одной молекулой ДНК, взвешенной между двумя оптически захваченными микросферами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В статье описывается комбинация оптического пинцета и обнаружения флуоресценции одной молекулы для изучения взаимодействия белка и ДНК. Метод дает возможность исследовать взаимодействия, происходящие в растворе (что позволяет избежать проблем из-за близких поверхностей, как в других методах с одной молекулой), контролировать удлинение ДНК и отслеживать динамику взаимодействия в зависимости как от механических параметров, так и от последовательности ДНК. Проиллюстрированы методы создания успешной оптической ловушки и нанометровой локализации отдельных молекул. Проиллюстрированы экспериментальные условия, позволяющие изучить взаимодействие репрессора лактозы (lacI), меченного Atto532, с молекулой ДНК, содержащей специфические последовательности-мишени (операторы) для связывания LacI. Метод позволяет наблюдать специфические взаимодействия у операторов, а также одномерную диффузию белка в процессе поиска мишени. Метод широко применим для изучения взаимодействий белка и ДНК, а также для молекулярных моторов, где желательно контролировать натяжение, приложенное к полимеру-партнеру (например, актину или микротрубочкам).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной молекулы методы (SM) значительно разработаны в течение последних тридцати лет, чтобы реагировать на потребности преодоления некоторых ограничений традиционных, измерений объемных решений 1-3. Манипулирование отдельными биологическими молекулами создал возможность измерить механические свойства биополимеров 4 и контролировать механические параметры белок-белок 5 и взаимодействий белок-ДНК 6,7. С.М. оценки флуоресценции, а с другой стороны, представляет собой чрезвычайно универсальный инструмент для исследования активности белка в пробирке и в естественных условиях, что приводит к возможности локализации и отслеживания одиночных молекул с нанометровой точностью. Посредством установки прибора точечного распространения-функции к изображению SM, на самом деле, этого можно добиться локализации с точностью в зависимости, главным образом, на сигнал-шум (SNR) и достигнув предела порядка нанометра 8,9. Эти методологии найти мощныйприложения в изучении динамики моторных белков, а также процессов диффузии, лежащие в основе целевой поиск в ДНК-связывающих белков. Возможность определения диффузионных констант в зависимости от последовательности ДНК, время пребывания на мишени и точного измерения длины ДНК изучены в ходе одномерных диффузионных событий, представляют собой мощный инструмент для исследования динамики белок-ДНК взаимодействия и для исследования механизмов конкретной целевой категории.

Недавно, сочетание этих двух методов привело к появлению нового поколения экспериментальных установок 10-14 позволяющих одновременное манипулирование биологического субстрата (например актин нить или молекулу ДНК) и обнаружения / локализацию взаимодействующего партнера фермента (например миозина или ДНК-связывающего белка). Преимущества этих методов в основном опираются на возможности оказывать механическое контроль над захваченного полимера, таким образом, ENAшику изучение динамики взаимодействия против сил или крутящих моментов. Кроме того, методология позволяет измерять биохимические реакции далеко от поверхности, избегая одним из главных ограничений классических методов СМ, т.е. необходимость для иммобилизации молекул изучаемых на поверхности (стекло или микросфер).

Сочетание двух отдельных методов молекул требует преодоления ряда технических трудностей, в основном, вытекающие из требований механической устойчивости и адекватной SNR (особенно, когда требующих локализации с точностью нм) 15. В частности, при соединении SM обнаружение флуоресценции с оптического пинцета, снижения шума и фотообесцвечиванию от прилипания инфракрасных лазеров 16 и контролем биохимических буферов для сборки биологических комплексов и выполнении экспериментальных измерений 11 имеют первостепенное значение. Здесь мы опишем методы для выполнения успешнойизмерения в установке двойного локализации захват / SM флуоресценции. Методология иллюстрируется на примере лактозы репрессор белка (LacI) флуоресцентно меченого (с Atto532) и обнаруженного как он связывается с молекулой ДНК (находящуюся между двумя оптического пинцета), содержащий конкретные Лачи связывающие последовательности (например, операторами). Мы демонстрируем эффективность метода в определение связывания LacI с ДНК и диффузии вдоль его контура в процессе целевой поиск. Метод применим к любой комбинации ДНК-последовательности и ДНК-связывающего белка, а также к другим системам (микротрубочек или актиновых филаментов, и двигатель белков, взаимодействующих с ними).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Настройка оптического пинцета со стабильностью в нанометрах

Экспериментальная установка должна обеспечивать два оптических пинцета со стабильностью наведения на нанометровом уровне и колебаниями интенсивности улавливающего лазера ниже 1%. Сочетание этих условий обеспечит нанометровую стабильность гантели при типичном натяжении (1 пН - несколько десятков пН), жесткости ловушки (0,1 пН/нм) и ширине полосы измерения (скорость получения изображения 20 сек-1). Схема экспериментальной установки представлена на рисунке 1.

  1. Проектирование и изготовление оптического пинцета15,17:
    1. Установите экспериментальную установку на оптический стол с активными изоляторами для снижения механических колебаний. Установите конструкцию микроскопа на эластомерные изоляторы для поглощения акустического шума и механических резонансов конструкции микроскопа.
    2. Вставьте оптический изолятор на пути улавливающего лазера, рядом с источником лазера, чтобы уменьшить случайные колебания амплитуды из-за оптической обратной связи.
    3. Максимально уменьшите длину пути улавливающего лазера и заключите всю траекторию в герметичный бокс, чтобы уменьшить колебания лазерного наведения из-за воздушных потоков и турбулентности.
    4. Создание двойного оптического пинцета путем расщепления одного лазерного источника ближнего инфракрасного диапазона (лазер Nd:YAG, длина волны 1064 нм) на два луча с ортогональной поляризацией. Не используйте ловушки с разделением времени, потому что они вызывают колебания гантели под напряжением12.
    5. Используйте акустооптические дефлекторы (AOD), приводимые в действие прямыми цифровыми синтезаторами (DDS), чтобы обеспечить тонкие движения (по крайней мере) одной ловушки и точную регуляцию натяжения ДНК. DDS обеспечивают лучшую стабильность ловушек по сравнению с генераторами, управляемыми напряжением (ГУН).
    6. Вставьте два квадрантных детекторных фотодиода (QDP) в заднюю фокальную плоскость конденсора, чтобы определить положение захваченных шариков с точностью до субнм.
  2. Убедитесь, что флуктуации интенсивности улавливающего лазера на входе в микроскоп составляют менее 1% с помощью фотодиода с полосой пропускания, превышающей скорость получения изображения.
  3. Проверьте стабильность наведения двух улавливающих лазеров:
    1. Приготовьте гранулы диоксида кремния в фосфатном буфере: разведите 20 мл гранул диоксида кремния (1,54 мкм, 10% сухих веществ) в 1 мл ацетона, обработайте ультразвуком 30 секунд, кратковременно переборщите и центрифугируйте 2 минуты при 19 000 x г. Повторно суспендируйте в 1 мл ацетона и повторите промывку. Ресуспендировать в 1 мл 50 мМ фосфатного буфера, промыть 2 раза и, наконец, повторно суспендировать в 100 мкл 50 мМ фосфатного буфера.
    2. Откалибруйте оптический пинцет с помощью гранул диоксида кремния: подготовьте проточную ячейку, прикрепив покровное стекло к предметному стеклу микроскопа с помощью двойной липкой ленты (толщиной около 60 мкм). Налейте 1 мг/мл BSA и подождите 3 минуты. Налейте шарики кремнезема, разведенные на 1/1 000 в фосфатном буфере, и герметизируйте проточную камеру силиконовой смазкой. Поместите по одной бусине в каждую ловушку и откалибруйте ловушки с использованием метода спектра мощности 18.
    3. Приготовьте гранулы диоксида кремния в пентилацетате и нитроцеллюлозе: разведите 20 мл гранул диоксида кремния (1,54 мкм, 10% сухих веществ) в 1 мл ацетона, обработайте ультразвуком 30 секунд, кратковременно переборщите и центрифугируйте 2 минуты при 19 000 x г. Повторно суспендируйте в 1 мл ацетона и повторите промывку. Суспендировать в 1 мл пентилацетата и промыть 2 раза. Наконец, ресуспендируйте их в пентилацетате с 0,1% нитроцеллюлозой, растворенной в пентилацетате.
    4. Распределите 2 мкл гранул диоксида кремния диаметром 1,54 мкм, растворенных в пентилацетате + 0,1% нитроцеллюлозы, на поверхность покровного стекла (24 x 24 мм) с помощью второго покровного стекла (24 x 60 мм). Прикрепите покровное стекло к предметному стеклу микроскопа с помощью двух кусков двустороннего скотча для создания проточной ячейки. Заполните проточную ячейку фосфатным буфером с концентрацией 50 мМ и запечатайте ее силиконовой смазкой.
    5. Изображение одной бусины кремнезема в светлопольной микроскопии с увеличением 2000X. Поле зрения должно составлять 7 x 5 мкм, полученное при разрешении 768 x 576 пикселей, так что изображение бусины должно иметь диаметр 190 пикселей. Компенсация тепловых дрейфов с помощью программного обеспечения с обратной связью, которое, как показано в ссылке 17, вычисляет положение x-y по центроиду изображения и z по дифракционным кольцам и корректирует дрейфы при перемещении пьезокаскада с точностью до нм или выше.
    6. Наложите центр левого трапа на центр шва (уровни сигнала x-y от QDP должны быть такими же, как и измеренные во время калибровки) и измерьте шум положения и его стандартное отклонение от QDP. Повторите измерение для правильной ловушки.

2. Локализация одной молекулы с нанометровой точностью

  1. Проектирование и конструирование флуоресцентной микроскопии15,19
    1. Используйте высокую квантовую эффективность и ПЗС-матрицу с умножением электронов для достижения высоких отношений сигнал/шум, необходимых для нанометровой точности локализации.
    2. Выберите оптику, чтобы получить размер пикселя изображения ~80 нм (например, увеличение изображения ~200X при размере пикселя камеры 16 мкм). Это достаточно мало, чтобы пренебречь ошибкой локализации из-за пикселизации8, но достаточно велико, чтобы собрать значительное количество фотонов на пиксель
      3. .
    3. В качестве источника возбуждения используйте лазерный свет, который является неполяризованным (проходящим через оптическое волокно, не поддерживающее поляризацию) или кругово поляризованным (проходящим через волновую пластину λ/4) для максимального возбуждения одиночных хромофоров, независимо от их ориентации.
    4. Выбирайте эмиссионные полосовые фильтры, которые эффективно отсекают как возбуждение, так и улавливание лазерного излучения. Примечание: В наших экспериментах мы помечали наш белок красителем Atto532 и использовали полосовой фильтр излучения с центром 600 нм и шириной полосы пропускания 100 нм.

3. Микрофлюидика

Для достижения точного контроля буферного обмена и сборки "гантели", т.е. закрепления одной молекулы ДНК между двумя оптически захваченными микросферами, необходимо разработать специально сконструированную ламинарную многоканальную систему потока. Он состоит из проточной камеры, напорного резервуара и системы регулирования давления (Рисунок 2).

  1. Подготовка проточной ячейки
    Проточная камера, используемая для экспериментов с одной молекулой по взаимодействию белка и ДНК, предпочтительно имеет 4 входных отверстия и 1 выходное отверстие, чтобы обеспечить до 4 параллельных буферных потоков, каждый из которых содержит один из различных компонентов, необходимых для эксперимента: шарики, ДНК, флуоресцентно меченный белок и буфер для визуализации. Разделение компонентов в проточных каналах позволяет эффективно собирать гантель. Кроме того, канал визуализации полезен для того, чтобы избежать фоновой флуоресценции от диффундирующих белков и достичь высокого отношения сигнал/шум, необходимого для локализации ДНК-связывающего белка с точностью порядка нескольких нанометров.
    1. Просверлите отверстия диаметром 1 мм в предметном стекле микроскопа (76 x 76 x 1 мм) с алмазным наконечником, чтобы создать 4 входных отверстия и одно выходное.
    2. Очистите предметные стекла микроскопа этанолом и отцентрируйте порт со вставленным уплотнительным кольцом и клейким кольцом в предметное стекло, окружающее отверстия для доступа. Очень важно надевать перчатки во время этого этапа, чтобы избежать отпечатков пальцев, которые могут нарушить процесс склеивания.
    3. Зажмите NanoPorts на предметном стекле и поместите его в духовку, разогретую до 180 °C на 1 час, чтобы обеспечить полное крепление.
    4. Нарисуйте на листе бумаги контур ячейки потока. Каналы должны быть шириной ~3 мм и совпадать с расположением отверстий на предметном стекле микроскопа.
    5. Поместите рисунок поверх двух кусков парапленки, и скальпелем сделайте резкие и непрерывные надрезы по нарисованному контуру. Удалите образовавшийся выступ. Откажитесь от нижнего слоя парапленки, который используется только для обеспечения чистой поддержки.
    6. Поместите предметное стекло микроскопа с прикрепленными нанопортами вверх дном в металлическую опору.
    7. Тщательно выровняйте контур камеры парапленки с отверстиями, следя за тем, чтобы парапленка не выступала из входных и выходных отверстий камеры.
    8. Накройте очищенным покровным стеклом микроскопа (62 x 56 x 0,15 мм) и осторожно удалите излишки парапленки вокруг камеры.
    9. Поместите два тепловых блока, предварительно нагретых до 120 °C, поверх проточной ячейки, чтобы оказывать на нее постоянное давление. Дайте парапленке растаять в течение примерно 25 минут.
  2. Напорный бак и буферные контейнеры
    Напорный резервуар должен быть изготовлен из плексигласа (или аналогичного) и позволять размещение шести буферных контейнеров. Возможность установки как минимум двух дополнительных буферных контейнеров повышает гибкость прибора. Обратите внимание, что прозрачные контейнеры и трубки значительно облегчают работу с проточной системой и устранение неисправностей захваченных пузырьков воздуха. Стерильные и одноразовые шприцы со стопорным наконечником Люэра (2,5 мл), из которых предварительно были удалены поршни, являются хорошими буферными контейнерами и позволяют легко соединить их с входной трубкой. Убедитесь, что общий объем жидкости мал по сравнению с объемом воздуха внутри напорного резервуара, что является необходимым условием для получения плавного и стабильного потока.
    1. Подсоедините запорные клапаны на выходе из буферных контейнеров для включения или выключения буферного потока во время экспериментов.
    2. Установите проточную ячейку на предметный столик микроскопа. Подсоедините запорную арматуру к входным отверстиям проточной камеры с помощью трубки из полиэфирэфиркетона (внутренний диаметр ~150 мкм) и бесфланцевых фитингов. Добавьте ~3 см трубки из фторированного этиленпропилена (внутренний диаметр ~500 мкм) в качестве связующего звена между трубкой и узлами NanoPort проточной ячейки. Этот шаг необходим для уменьшения буферного потока на входе в камеру, чтобы избежать поломки проточной ячейки или отсоединения NanoPort от стекла. С другой стороны, использование только трубок большого внутреннего диаметра потребовало бы огромных объемов биологических образцов.
    3. Подсоедините выходное отверстие проточной камеры к открытой трубке Falcon при атмосферном давлении. Эта трубка служит для утилизации буфера, выходящего из проточной камеры.
  3. Система контроля давления
    1. Постройте систему контроля давления, способную точно регулировать давление воздуха внутри напорного бачка. Это можно сделать с помощью двух электромагнитных клапанов, управляемых компьютером, один из которых подключен к источнику давления +0,5 атм (компрессору), а второй — к атмосферному давлению. Электромагнитные клапаны многократно открываются в течение примерно 7 мс, чтобы увеличить или уменьшить давление в магистрали до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое значение. ПРИМЕЧАНИЕ: этот подход был заимствован у Карлоса Бустаманте20, и он обеспечивает более плавный поток, чем использование шприцевого насоса21 с шаговым двигателем.
    2. Добавьте датчик давления, управляемый специально разработанным программным обеспечением, для контроля эффективного давления, оказываемого на напорный резервуар. Типичное рабочее давление составляет порядка 20 мбар для сборки гантелей и 200 мбар для промывки компонентов проточной системы.

4. ДНК-хвост с биотинилированным дезоксицитидинтрифосфатом (biotin-dCTP)

Молекула ДНК должна быть длиннее 1 мкм, чтобы облегчить ее растяжение под потоком и закрепление на захваченных бусинах. Более того, длинная ДНК не позволит ИК-улавливающему свету освещать ДНК-связывающий белок. Это имеет особое значение, поскольку поглощение ИК-излучения от возбужденного хромофора приводит к повышенному фотообесцвечиванию. Примечание: В настоящем исследовании молекула ДНК имела длину 3,7 мкм. Молекула содержала три копии первичного оператора О1 и по одной копии каждого из двух вспомогательных операторов, О2 и О3. Эти последовательности были вставлены в середину молекулы, что привело к примерно равному удалению от захваченных шариков и инфракрасных лазерных лучей.

  1. Смешайте 1 пмоль линейной ДНК 3'-концов с 60 пмоль биотин-14-dCTP, 4 мкл 5x Терминального буфера дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) (1 М какодилата калия, 125 мМ Триса, 0,05% (v/v) Triton X-100, 5 мМ CoCl2 (pH 7,2 при 25°C)) и 1,5 мкл TdT и ddH2O до общего объема 20 мкл. Инкубируйте смесь при 37° C в течение 15 мин. Это приведет к добавлению до 60 нуклеотидов на конец ДНК. Обратите внимание, что выступы ДНК 3'-имеют хвост с более высокой эффективностью, чем утопленные или тупые концы.
  2. Очистите хвостатую ДНК с помощью спиновых колонок или экстракции фенолом/хлороформом и последующим осаждением этанола для удаления CoCl2 из реакционного буфера TdT.
  3. После очистки ДНК можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель или при -20 °C в течение более длительного времени, но при этом следует избегать повторного размораживания и повторного замораживания.

5. Мечение белковых тиоловых групп с помощью ATTO532

Мечение путем модификации остатков цистеина не должно изменять активность белка. Чтобы решить эту проблему, мы использовали мутант LacI, LacIQ231C, который несет только один цистеин на мономер в положении 231. Этот мутант сохраняет те же характеристики, что и дикий тип, и было показано, что химические модификации в положении 231 не влияют на стабильность белка 22. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы пометили белок ATTO532 малеимидом.

  1. Убедитесь, что белок растворен в буфере с pH от 7,0 до 7,5 и концентрацией от 2 до 10 мг/мл. ПРИМЕЧАНИЕ: в этих экспериментах LacI растворяли в фосфате калия 0,3 М, 5% глюкозы, pH 7,5 (буфер А).
  2. Растворите трис-(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТЦЭП) до конечной концентрации 100 мг/мл вН2О. Раствор ТХЭП перед применением необходимо приготовить в свежем виде.
  3. Смешайте 100 мкл белка с 3 мкл TCEP и осторожно
    4. перемешайте.
  4. Растворите краситель в N,N-диметилформамиде (ДМФА) до конечной концентрации 10 мг/мл при работе в условиях низкой освещенности. Вортекс до полного растворения.
  5. Реакционная смесь: Добавьте 33 мкл красителя к белку + TCEP и осторожно перемешайте. Быстрый спин для сбора как можно большего количества раствора.
  6. Инкубируйте реакционную смесь в течение 2 часов в шейкере (8 000 об/мин) при температуре 20 °C (или при 4 °C O/N), защищенном от света.
  7. Растворите восстановленный L-глутатион (GSH) до конечной концентрации 100 мг/мл в H2O. Добавьте 3 мкл в реакционную смесь и инкубируйте в шейкере при 8 000 об/мин в течение 15 мин. GSH остановит реакцию, блокируя реакционную способность тиоловых групп.
  8. Очистите меченый белок с помощью стандартных гелевых фильтрующих колонок, диализа или спиновых концентраторов. Примечание: В этих экспериментах меченый LacI очищали с помощью концентраторов с отсечкой 10 кДа.
    1. Разбавьте реакционную смесь до 12 мл буфера А, нанесите его на концентратор и центрифугируйте при 8000 x g, 1 час, 4 °C. Таким образом, меченый LacI концентрируется до конечного объема около 500 мкл, а избыток красителя проходит через мембрану в проточном потоке. Откажитесь от проточной трубки и повторите шаг 5.8.1 не менее трех раз.
  9. Разделите меченый белок на небольшие аликвоты и храните при температуре -80 °C. Избегайте многократного замораживания и размораживания.

6. Эксперименты по комбинированной оптической ловушке и флуоресцентной визуализации с использованием одной молекулы

  1. Добавьте 1 мл буфера А в буферные контейнеры и приложите давление 200 мБар для промывки соединительных трубок и проточной ячейки. Чтобы максимизировать диффузию связывающего белка на ДНК, здесь и на последующих этапах буфер А может быть заменен буфером с низкой ионной силой. ПРИМЕЧАНИЕ: В этих экспериментах мы использовали TBE 0,5x.
  2. Проверьте наличие пузырьков воздуха, которые могут нарушить плавность потока. Легкое похлопывание по выпускной трубке поможет удалить оставшиеся пузырьки.
  3. Уменьшите давление до 20 мБар и убедитесь, что все каналы и трубки очищены от пузырьков воздуха, а буфер течет с одинаковыми скоростями во всех каналах.
  4. Подготавливают образцы до конечного объема 300 мкл: покрытые стрептавидином гранулы полистирола 1,87 мкм; 20 пМ линейной ДНК, биотинилированной на обоих концах в соответствии с разделом 4; 300 пМ тетрамера LacI, меченного ATTO532 в соответствии с разделом 5.
  5. Добавьте каждый образец в одну из емкостей шприца в следующем порядке: шарики в первом канале, ДНК во втором, третьем канале только с буфером для визуализации (буфер А + система поглотителя кислорода) и меченый белок в четвертом канале.
  6. Включите поток при давлении 200 мбар на 3 минуты, чтобы образцы попали внутрь проточного канала. Затем уменьшите давление до 20 мБар.
  7. При съемке первого канала при ярком освещении включите два оптических пинцета и поймайте шарик из полистирола в каждую ловушку.
  8. Быстро переходите ко второму каналу, чтобы избежать попадания в ловушки других бусин. Обратите внимание, что приход в канал ДНК легко заметен по окончанию потока шариков.
  9. Используя одну AOD, перемещайте одну ловушку (бусину) вперед и назад в непосредственной близости от другой бусины, чтобы обеспечить прикрепление ДНК, расширенной потоком, между двумя оптически захваченными бусинами. Когда гантель из ДНК формируется, статичная бусина начинает следовать за движением бусины, которая активно перемещается вперед и назад с помощью ловушки.
  10. Быстро перейдите к буферному каналу и выключите буферный поток. Выполните анализ кривойсилы-растяжения 4, 23-25 для проверки наличия одной молекулы ДНК. Если присутствует более одной молекулы (т.е. энтальпическая, поднимающаяся фаза кривой сила-растяжение происходит на длине, меньшей длины контура ДНК), отбросьте гантель и начните снова с шага 6.7.
  11. Как только будет получена одна гантель из ДНК, снова включите поток и переместите гантель к белковому каналу. Переключитесь на широкопольную флуоресцентную микроскопию для мониторинга взаимодействия меченого LacI с ДНК. Выключите поток и начните сбор данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В успешном эксперименте один (или несколько) меченых белков подвергаются связыванию/разъединению и/или одномерной диффузии вдоль молекулы ДНК (Рисунок 3A). Локализация белков вдоль молекулы ДНК позволяет количественно оценить кинетические параметры в зависимости от последовательности ДНК. При применении буферных условий, вызывающих 1D-диффузию, можно проследить траектории белков и определить, например, коэффициент диффузии D1D.

Точное положение одного пятна в каждом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие в области манипуляций с одиночными молекулами и методов визуализации был достигнут большой прогресс с точки зрения пространственного и временного разрешения. Комбинация манипуляций и методов визуализации лежит в основе мощных инструментов, которые теперь позволяют контролировать механические условия одного биологического полимера, такого как ДНК, РНК или цитоскелетные филаменты, и одновременную локализацию отдельных белков, взаимодействующих с одним и тем же полимером. Контроль механических услов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Гийса Вуите, Эрвина Дж.Г. Петермана и Питера Гросса за помощь с микрофлюидикой и Алессию Темпестини за помощь в подготовке образцов. Это исследование финансировалось Седьмой рамочной программой Европейского Союза (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения No 284464 и Министерством образования, университетов и исследований Италии FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, а также в рамках флагманского проекта NANOMAX.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эластомерные изоляторыNewportNewdampВыберите подходящий эластомер Newdamp в зависимости от веса микроскопа и резонансных частот
Оптический изоляторОптика для исследованийIO-3-YAG-VHP
Nd:YAG лазер, длина волны 1,064 нмСпектрофизикаMillennia ИК
Акустооптические дефлекторы (AODs)A & ОптоэлектронныйDTS-XY 250
Прямые цифровые синтезаторыAnalog Devices
Квадрантный детектор фотодиодовOSI оптоэлектроникаSPOT-15-YAG
DIO и плата FPGANationalInstruments NI-PCI-7830R
Галогенная лампаSchottKL 1500 LCD
КонденсаторOlympusU-AAC 1.4NA Апланат Apchromat
объективNikonCFI Plan Apochromat 60x 1.2NA водяное погружение
532 нм лазерCoherentSapphire
CCD 200X и 2000XHamamatsu XC-ST70 CE
Электронно-умноженная ПЗС-матрицаHamamatsu C9100-13
Пьезостолик с нм-точностьюPhysik InstrumenteP-527.2CL 
Эмиссионный фильтрChroma Technologies600/100m
Гранулы диоксида кремния (1,54 мм)Bangs LaboratoriesSS04N/5303
Альбумин из бычьей сыворотки (БСА)Sigma AldrichB4287
Пентилацетат Sigma Aldrich46022Легковоспламеняющиеся жидкости и пары (No 1272/2008)
НитроцеллюлозаSigma AldrichN8267-5EAЛегковоспламеняющиеся твердые вещества  (No 1272/2008)
Тепловой блокMPM Instruments SrlM502-HBDс 2 съемными блоками; предварительно нагретый до 120°; C
NanoPort сборкиUpchurch Scientific Inc.N-333
Трубки из полиэфирэфиркетона Upchurch Scientific Inc.1535
Самодельный металлический держатель для сборки проточной камеры напорного резервуара из оргстекла
Люэр стопорные шприцы 2,5 млTerumoSS 02LZ1
Запорная арматура Upchurch Scientific, Inc.P-732
Фитинги бесфланцевые Upchurch Scientific, Inc.LT-111
Трубки из фторированного этилена и пропилена Upchurch Scientific, Inc.1549
Два электромагнитных клапана с компьютерным управлениемClippard, Цинциннати, СШАET-2-H-M5
Преобразователь давленияDruck LTD PTX1400
biotin-14-dCTP Life Technologies19518-018
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT)ThermoscientificEP0161
ATTO532 малеимидSigma Aldrich68499
N,N-диметилформамид (DMF) Сигма Олдрич227056горючая жидкость, вредна при впитывании на кожу. Раздражающее средство, тератоген. Н226; Н303; Н312; Н316; Н319; Н331; Н360; П201; С261; С280; П305; С351; С338; P311
Трис-(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP)  Sigma AldrichC4706
L-глутатион с пониженным содержанием (GSH)Sigma AldrichG4251Острая токсичность, перорально (категория 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL мембрана, 10  Отсечные спиновые концентраторы MerckMilliporeUFC901024
полистирольные шарики со стрептавидиновым покрытием 1.87 &; мСферотек, Инк.СВП-15-5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
  3. Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
  4. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  5. Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
  6. Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
  7. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
  8. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  9. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  10. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
  11. Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
  13. Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
  14. van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
  15. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).
  16. Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
  17. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  18. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
  19. Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
  20. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
  21. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
  22. Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
  23. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
  24. van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
  25. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
  26. Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
  27. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи