Методическая статья

Недорогой метод для анализа захват как активность и движение в Дрозофилы

DOI:

10.3791/51460

⸱

19 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование веб-камера и сочетание свободных и недорогих программ, локомотивные узоры в дрозофилы могут быть проанализированы для определения различий в скорости, расстояния и времени различных мероприятий двигателя.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системы слежения Видео широко используются для анализа Drosophila движение MELANOGASTER и обнаруживать различные отклонения в опорно-двигательного поведения. В то время как эти системы могут обеспечить богатство поведенческого информации, стоимость и сложность этих систем может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Мы разработали недорогой тест для измерения локомотива поведение и движение изъятия в дрозофилы. Система использует веб-камеры для захвата изображений, которые могут быть обработаны с использованием комбинации недорогой и свободного программного обеспечения для отслеживания расстояние переехал, средняя скорость движения и продолжительности движения в течение определенного времени пролета. Чтобы продемонстрировать полезность этой системы, мы рассмотрели группа дрозофилы мутантов Bang-чувствительные (BS) расслабленных, которые в 3-10 раз более восприимчивы к захват как деятельности (SLA), чем диких мух типа. Используя эту новую систему, мы смогли обнаружить, что БС Mutanт взрыва бессмысленно (BSS) имеет более низкие уровни разведочного передвижения в новой среде, чем мух дикого типа. Кроме того, система была использована для выявления, что метформин препарат, который обычно используется для лечения диабета типа II, снижает интенсивность SLA в BS мутантов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Учитывая короткий срок службы и надежные генетические инструменты, доступные, дрозофилы является отличным модельной системой для исследования этиологии различных заболеваний и базовый физиологию различных биологических процессов. Во многих случаях это выгодно для измерения эффектов, что поведенческие, генетические или фармакологические манипуляции имеют на передвижения в этих модельных организмов 1,2.

Существуют различные методы, которые обычно используются для измерения движения летать в двух измерениях 3-7. Эти системы могут поддерживать отслеживание нескольких мух одновременно и может измерять скорости, записывать длину пути и записать процент времени муха потратил двигаться. Они были использованы для изучения движение в различных контекстах, включая воздействию препаратов на передвижения и сексуальной диморфного природы летучей движения 6-9. Основным недостатком этих систем является стоимость слежения системтемпера или соответствующего программного обеспечения и камеры. В некоторых случаях это может работать в тысячи долларов. Стоимость составляет особый интерес для лаборатории, которые должны бы только ограниченное использование такой системы, например, количественной локомотивных модели вновь изолирован мутанта.

Более простой, но менее надежный метод заключается в использовании системы, которые фиксируют движение, основанное на том, сколько раз муха пересекает инфракрасный путь к световой луч, который помещен в середине закрытой трубе 10,11. Хотя такие системы может дать ценную информацию о передвижении и сон-бодрствование циклов, они могут больше или меньше сметной движения, потому что они не в состоянии захватить фактический путь лету. Например, мухи, которые проявляют значительный движение на концах трубки будет зарегистрироваться в качестве низкую движение летит хотя дополнительные методы высокого разрешения были использованы, чтобы попытаться обойти эти ограничения 12.

Проще и еще дешевле поднимаются устройства, которые измеряют geotaxiсек, движение вверх мух, через одну трубку или серии труб 2,13. Хотя такие системы дешевы и можно легко определить geotaxis дефекты, они не в состоянии захватить многие другие аспекты движения, которые будут представлять интерес для исследователей.

Для многих лабораториях, недорогой системы тщательный анализ, который прост в настройке и эксплуатации будет выгодно инструмент для характеристики поведенческих различий в дрозофилы штаммов. Здесь мы опишем анализ, который может быть установлен вверх в течение менее двух сотен долларов и способен дать информацию о пути, скорости и продолжительности движения мухи. Чтобы продемонстрировать эффективность анализа, приведены данные, показывающие, что он может быть использован для идентификации; 1) дефект опорно-двигательного аппарата в Bang-чувствительный (BS) мутанта, которое подвержено припадков и 2) способности метформина наркотиков, которые обычно используется для лечения диабета типа II, чтобы уменьшить интенсивность захват как деятельности (SLA) яп две BS мутанты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка личности Мухи для передвижения Пробирной

  1. Передача летит аккуратным постукиванием на отдельные пустые флаконы и крышки флаконов с ватным тампоном. Разрешить мухи сидеть спокойно 20-30 минут до наблюдения. Важно не обезболить мух в пределах часа до наблюдения за поведением, как предыдущие исследования показали экспозиции анестезия может изменить поведение по сравнению с наркозу мух 14.
  2. Слегка постучите муху из флакона и поместить отдельные мух под диаметром 5 см Петри охватывают (высокий 5 мм) с небольшими разрезами, чтобы воздушный канал. Освещать снизу и наблюдать мух помощью веб-камеры, установленный над чашкой Петри.

2. Подготовка личности Мухи об изъятии Пробирной

  1. Поток двухдневные старые припадок чувствительные мух либо стандартные дрожжей / фуражное зерно / агар СМИ или стандартные СМИ смешивают непосредственно с наркотиками. Для приведенных данных, мухи питались либо 1 Перейдитее стандартные СМИ или 1 г стандартных СМИ смешанных с 25 мг метформина.
  2. После мухи накормили в течение двух дней на средства массовой информации или средства массовой информации, плюс лекарства, передавать их, осторожно нажав на отдельных пустых флаконов и крышки флаконов с ватным тампоном. Разрешить мухи сидеть спокойно в течение 20 мин до наблюдения. Важно не обезболить мух в пределах часа до наблюдения за поведением, как предыдущие исследования показали экспозиции анестезия может изменить поведение по сравнению с наркозу мух 14.
  3. Вихревые отдельные пробирки, содержащие один муху на лабораторном Вортекс используя максимальные установки для 10 сек. Поместите иммобилизованного муху на пустой белый лист бумаги прямо под веб-камеры, установленной над бумаги.

3. Запись видео

  1. Запишите движение или SLA с помощью программного обеспечения HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Эта программа использует веб-камеру длязахвата изображений, основанные на пользовательских настроек.
  2. Выберите покадровой изображений опцию на вкладке Capture, Когда откроется окно, выберите веб-камера в качестве устройства захвата. Для большинства экспериментов размер видео кадра 640 х 480 является адекватной.
  3. Выберите Intel IYUV кодек для сжатия и выберите 0,1 сек / кадр для захвата анализа или выбрать 0,1-0,5 сек / кадр для движения анализа. На вкладке Дополнительно выберите создать. Файл изображения BMP для каждого захвата и выберите папку для программы для хранения изображений, которые он принимает (стек изображения).
  4. Наведите мертвую муху на листе бумаги. Кликните на окне параметров видео и настроить параметры на вкладке Параметры устройства так, чтобы было ярко-белый фон и четкий контраст с темным лету.
  5. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать запись. После того, как срок окончания записи, нажмите кнопку остановки. Теперь Стек изображение должно быть в папке, выбранной. Примечание: Прежде чем начать запись, убедитесь, что следуюдер выбран для стека изображений пуст.

4. Анализ данных с помощью ImageJ

  1. Free Image программное обеспечение для обработки ImageJ Open НИЗ, который может быть загружен в http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Примечание: В дополнение к загрузке программы, Multitracker плагин должен быть загружен и установлен, как указано в http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. Импорт стека изображений в ImageJ, нажав на вкладке Файл, а затем выбрав Импорт → последовательность изображения.
    1. Выберите папку, содержащую стека изображений, выделите одно из изображений и выберите открытым. Диалоговое окно Параметры последовательности откроется. Нажмите Сортировка имена численно, а затем выберите ОК и стек изображения будут загружены в ImageJ.
  3. Пороговые все изображения так, чтобы каждый состоит из белом фоне с муха бытьпреобразуется в черную точку. Чтобы начать этот процесс, преобразовать изображение в 8-битном формате, выбрав Тип → 8 бит на вкладке Image.
    1. Перейдите на вкладку Image еще раз и выберите Настройка → Порог. Это откроет диалоговое окно Threshold, в котором порог отсечения точка может быть настроена.
    2. Сканирование через образы, чтобы увидеть, есть ли дополнительные черные точки или если кусочек не хватает черную точку. Если это так, то регулировать порог, чтобы облегчить эту проблему. Обычно порог не должны быть скорректированы как программа по умолчанию на достаточный стоимости.
      Примечание: Каждый слайд в стеке должны иметь только одной черной точки, представляющие позицию лету.
    3. Выберите применяются в диалоговом окне Threshold и Преобразовать в Маска диалоговое окно откроется. Не выберите любой из вариантов, но просто нажмите кнопку ОК для порога стек изображения.
  4. После пороговой стек изображения, выделите Multitracker плагин на вкладке Плагины для того, чтобыизмерить движение лету в пикселях. Появится диалоговое окно Объект Tracker.
    1. Нажмите всех четырех вариантов, приведенных в диалоговом окне, а затем нажмите ОК. Multitracker плагин будет затем приложите координаты в черной точкой в ​​каждом срезе и перечислите их в окне результатов, а также от общей длины пути в пикселях. Окно Пути дает графическое отображение пути муха взял.
    2. Скопируйте х-и у-координат список из окна Результаты и вставить данные в таблицу Excel. Если какой-либо слайд в стеке не имеет черную точку в нем, программа Multitracker остановится на этом слайде. Если это происходит, необходимо вернуться к шагу 4.2 и повторно пороговое стек для того, чтобы регистры летят, как черная точка на слайде в вопросе.
  5. Для того чтобы преобразовать пробеги от пикселей см, принять отдельный образ двух точек, которые расположены один см друг от друга на пустой белый лист бумаги.
    1. Следуйте вышеэтапы (3.1-4.4.2), чтобы определить, X, Y координаты пикселей для двух точек и использовать эту информацию, чтобы определить количество пикселей, соответствующих см. Этот коэффициент используют на стадии пять генерировать данные движения в см. Примечание: После того, как это будет сделано, важно держать камеру, установленной для всех будущих записей. Каждый раз, когда камера перемещается или регулировать, нужно повторить этот шаг для преобразования пикселей в см.
    2. Длина пути, что порождается Multitracker плагина переоценивает движение, потому что незначительные колебания в положении тела и интенсивности света / отражения будет влиять на размер и центр черной точкой, который создается при пороговой изображения. Этот шум должен быть удален, чтобы получить точную оценку движения лету.

5. Анализ данных с помощью Excel

  1. Удалить шум из записанных данных путем импорта серию х, у координаты, порожденная пр. MultitrackerОГР А ММЫ в Fly анализ, Excel Visual Basic программы, созданной авторами. (Программа можно получить, связавшись с авторами.)
  2. Нажмите Нажмите Me кнопку и выберите пороговое значение отсечки. Выберите пороговое значение 0,5 см / сек для анализа SLA или выберите значение между 0,1-0,3 см / сек для анализа движения. Нажмите кнопку ОК, и программа рассчитает скорость, время и расстояние передвижения. Примечание: Программа использует скользящую анализ окно для оценки данных в последовательных 0,5-1,0 сек бункеров и вычисляет скорость в течение этого окна. Все, что выше определенного пользователем отсечки трактуется как движение летучей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника, описанная здесь был использован ранее для анализа различий в SLA в дрозофилы BS мутантов 1. Представленные здесь результаты связаны штаммов BS легко потрясли (EAS), Bang бессмысленную (BSS) и техническим нокаутом (ТКО). EAS локус кодирует этаноламин киназы, участвующих в фосфатидилэтаноламином синтеза 15 и TKO локус кодирует митохондриальную riboprotein 16. Мутация BSS является аллель паралитического (пункт) напряжен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При рассмотрении опорно-двигательного аппарата или модели движения у дрозофилы, полезно, чтобы иметь возможность извлечь информацию о пройденное расстояние, скорость передвижения и образец движения. Для того чтобы извлечь эту информацию, дорогостоящее оборудование традиционно используется, что часто является чрезмерно высокой для небольших лабораторий или лабораторий, которые хотят использовать такие анализы экономно 4,8,9.

Анализ, описанный здесь, может использоваться, ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы также хотели бы выразить благодарность Kris Burner, Стивен МакКинни, Лаура Тобина, Дженни Gilbreath, Эшли Olley, Меган Хоффер, и Меган Хайда за их работу в тонкой настройки этого анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
WebCamLogitechPro900Подойдет любая качественная веб-камера.
Программное обеспечение для покадровой съемки HandiAVIПрограммное обеспечение AzcendantПоследнюю версию можно найти по адресу http://www.azcendant.com/
Большинство вихревых аппаратов стандартного размера, таких как Vortex Genie 2, будут достаточными.
Крышка чашки Петри 5 смLabM LimitedD011Меньшие или большие крышки для чашек Петри можно использовать для арены при анализе движения.
Световой коробизготовленна заказ Построен из подручного материала. Освещение используется для анализа локомоции. В зависимости от освещения помещения, возможно проведение анализа без светового короба.
ImageJ NIH Последнюю версию можно найти по адресу http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html Multiracker Plug-In NIH Последнюю версию можно найти по адресу http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html Vortexer VWR Vortex Genie 2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaImage Jbang

Похожие статьи