Лечение первичных остеобластов мыши с ретиноевой кислоты производит гомогенную популяцию разветвленных клеток, несущих морфологические и молекулярные особенности остеоцитов. Способ преодолевает трудность получения и сохранения первичных остеоцитов в культуре, и может быть выгодным для изучения клетки, полученные из трансгенных моделей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Необходимость остеоцитарного культур хорошо известно в сообщество исследователей кости; изоляция первичной остеоцитов трудно и производит небольшое число клеток. Таким образом, наиболее широко используется система сотовой связи является остеоцит, как MLO-Y4 клеточной линии.
Способ здесь описано относится к использованию ретиноевой кислотой с образованием гомогенной популяции клеток с разветвленными морфологических и молекулярных особенностей остеоцитарного.
После выделения остеобластов из свода черепа мыши, полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) добавляют к клеточной среде, а также мониторинг соты выполняется ежедневно под инвертированным микроскопом. Первые морфологические изменения обнаруживаются после 2 дней лечения и дифференциации обычно завершается в течение 5 дней, с прогрессивного развития дендритов, потеря способности производить внеклеточный матрикс, понижающей регуляции остеобластов маркеров и до регулирования остеоцитарного конкретных молекул. Содержание "> Мониторинг Ежедневно клеток необходим из-за присущего изменчивости первичных клеток, и протокол может быть адаптирован с минимальным изменением в клетках, полученных из различных линий мышей и применяемых к трансгенных моделей.
Метод прост для выполнения и не требует специального оборудования, это очень воспроизводимые, и быстро генерирует зрелого населения остеоцитарного в полном отсутствии внеклеточного матрикса, что позволяет использовать эти клетки для неограниченного биологических применений.
Введение
Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, неизлечимо дифференцированной, очень разветвленные клетки глубоко расположенные в скелете. Тело клетки зрелой остеоцитов содержатся в костном лакун и имеют различные формы; остеоцитов с удлиненных тел клеток находятся в кортикальной кости, в то время как закругленные остеоцитов становятся все более частыми в губчатой кости 1. Разветвленные дендриты простираются от тела клетки и проживать в крошечных каналов называемых канальцы, образуя запутанную сеть, которая делает несколько контактов не только с другими остеоцитов, но и с другими типами костных клеток, костного мозга, кровеносных сосудов и связанных с ними перицитами. Через межклеточной жидкости, содержащейся в лакун и канальцев, остеоциты также в конечном счете, подключен к системе циркуляции, поэтому они могут влиять не только местные, но и системные события, и наоборот их поведение может регулироваться как местных, так и системных изменений 2.
Изучение остеоцитов недавно набрала обороты, благодаря несколько технических достижений, таких как генерации ткани и клеточных конкретных трансгенных животных, использование мощных методов микроскопии и высокой пропускной молекулярной скрининга 3,4. Тем не менее, знание этих клеток еще не завершен, в основном за счет относительного дефицита адекватной в пробирке моделей. На самом деле, остеоциты были всегда трудно получить и поддерживать в культуре из-за глубокого расположения, и низкий уровень пролиферации, которая характеризует такой дифференцированный тип клеток.
Вдоль лет, ряд методов были разработаны, чтобы изолировать первичный остеоцитов 5-7, хотя они обычно производят урожаи низкие клеток и несут риск, что даже несколько загрязняющих фибробласты быстро перерастают остеоцитов 8. По этой причине, самый экспериментальный в пробирке работы было проведено до сих пор на устоявшихся остеоцитов клеток лНИС MLO-Y4 9.
Дополнительные методологии в пробирке может повысить возможность изучения этих клеток и может улучшить анализ остеоцитарного биологии и патофизиологии. Чтобы быть в значительной степени приняты, такие методы должны быть легко воспроизвести, и не потребует специальных инструментов или очень длинные раза до клеток созревание. Важно отметить, что если применимо к первичных клеток, они дают возможность использовать преимущества трансгенных животных. Мы недавно описали, что обработка остеобластов линии клеток MC3T3-E1 и первичных остеобластов с ретиноевой кислоты вызывает быстрое изменение фенотипа, ведущий к развитию гомогенной популяции клеток, несущих разветвленных морфологические и молекулярные особенности остеоцитами 10.
Полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) является активным продуктом метаболической трансформации витамина А, который регулирует транскрипцию генов путем связывания ядерных рецепторов ретиноевой кислоты (РАКС). RARsсвязываются с ДНК, как гетеродимеров с ретиноидных X рецепторов (RXRs), в конечном итоге приводит к модуляции ретиноевой кислоты (RA)-отзывчивым генов-мишеней 11. ATRA, как было показано модулировать дифференцировку и созревание нескольких типов клеток, в том числе другие разветвленные клетки, такие как нервные клетки 12 и подоцитах 13.
Способ здесь описано основана на добавлении к ATRA первичных остеобластов. Чтобы быть эффективной, ATRA должен быть добавлен в точном стадии созревания на клетки высевали при определенной плотности; в нашем опыте эти условия имеют решающее значение для получения переключатель фенотип от остеобластов к остеоцитов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с национальным и европейским действующих норм, касающихся защиты животных, используемых для научных целей и были рассмотрены и одобрены комитетом по этике Миланского университета.
1. Выделение первичных остеобластов
Метод, с небольшим изменением, в соответствии с процедурой, описанной Додиг и др. 14.
- Подготовка переваривание среды, путем добавления 0,1% коллагеназы P и 0,05% Трипсин (начиная с 2,5% трипсина 10X, не фенолового красного) в HBSS среды (Hanks Balanced Salt Solution, не кальций, магний, или фенола красного).
- Использование 3-4 день старых мышей (процедура может быть применена к всего лишь 1 мыши).
- Жертвоприношение путем обезглавливания. Спрей голову с 70% этанола и держать на льду. Удалить кожу и мышечные слои пинцетом и рассекая / хирургическими ножницами.
- Аккуратно удалите теменной кости иотделить их, следуя стреловидного шва в двух половинок. Убедитесь, что кости были свободны от швов и любой приверженец ткани и поместите отдельные части кости в хорошо планшеты, содержащие HBSS среду пока процедура не будет завершена.
- Отменить HBSS и добавить в каждую лунку переваривания среда в течение 15 мин при 37 ° С
- Удалите супернатант.
- Добавить вновь переваривая среды в течение 15 мин при 37 ° С.
- На этот раз сохранить супернатант и поместить его в альфа-MEM (минимальной основной среде), дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1% стрептомицина / пенициллину.
- Повторите шаги 1,7 и 1,8 2x.
- Бассейн три собранных фракций, вращение клетки центрифугированием при 425 г в течение 5 мин, отбросить супернатант, добавляют 3 мл дополнен альфа-МЕМ с ресуспендируют осадок клеток, и перевод в 25 см 2 колбы.
- Измените среду после 24 часов для удаления мусора и мертвых клеток.
- Добавить 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты (AA) и 3 мм Glycerol 2-фосфат динатриевой соли гидрат (GP) в среде альфа-МЕМ.
- После этого изменения среды (альфа-MEM плюс AA / GP) через день.
2. ATRA протокол
- Провести все эксперименты с ATRA (All-транс-ретиноевой кислоты) в затемненной комнате, чтобы предотвратить инактивации.
- Подготовка раствора трипсина 1X в HBSS среды и держать при 37 ° С до использования.
- Снимите среды из субконфлюентных клеток и тщательно промойте их HBSS.
- Добавить 1 мл трипсина, осторожно вращать колбу, чтобы все клетки должны быть охвачены трипсина и инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С.
- Проверьте фактического отряда клеток под инвертированным микроскопом.
- Добавьте 3 мл альфа-MEM среде для инактивации трипсина.
- Восстановление клеток и центрифугируют в течение 15 мин при 425 г.
- Ресуспендируют осадок клеток в свежей среде.
- Наведите падение счетной гемоцитометр камеры, дают отстояться в течение нескольких минут и подсчитать сеLL число.
- Место клеток в 25 см 2 колбы при плотности 10000 клеток / см 2 с альфа-MEM плюс AA / GP. Знайте, что плотность клеток имеет отношение к оптимального развития клеточных процессов и межклеточных контактов. Отправной плотность выше, чем 10000 клеток / см 2 ухудшает надлежащее развитие клеточных процессов, но более низкие количества клеток приводит к преждевременной гибели клеток, в связи с отсутствием межклеточных контактов.
- Добавить 5 мкм ATRA в среду каждые 24 часа.
- Монитор клетки ежедневно оценивать морфологию: морфологические изменения, как правило, наблюдается после 48 часов. Если после первых 24-48 часов, клетки все еще пролиферирующих, replate по указанному выше плотности. Однородная население зрелого остеоцитов присутствует через 4-5 дней. В зависимости от потребностей, использовать клетки в любой момент времени, до 12-15 дней.
- Когда клетки высевают на других опорах (например, покровные или хорошо пластин), убедитесь, что выше плотность поддерживается иПродолжайте добавлять ATRA каждые 24 ч до использования. Оставьте клетки прилипать к новой поддержкой по меньшей мере 24 ч до начала эксперимента.
3. Иммуноокрашивание
- Для иммуноокрашивания, пластины клеток на покровных и следовать установленным методологии (см., например, Барри 15).
- Например, для непрямой иммунофлуоресценции, фиксируют в 4% параформальдегида или холодным ацетоном, последовательно инкубируют с первичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа в увлажненной камере, а затем с вторичной флуоресцентной-меченого антитела в темноте, при комнатной температуре в течение 30 мин, в увлажненной камере.
- Используйте DAPI или аналогов для ядерной контрастного, и смонтировать в борьбе с выцветания среднего.
4. Ализарин Красный Окрашивание и Добыча
- Пластина клеток на покровные.
- Фиксации клеток путем погружения покровное в 70% этаноле в течение 10 мин.
- Обложка клеток с несколькими каплями ализарином решения красный окрашивания (1 мг / мл, рН 5,5)в течение 30 мин.
- Вымойте покровные с водопроводной водой. Установите с каплей глицерина на стеклах и получать изображения с использованием прямой микроскоп в 10 раз и 20-кратным увеличением.
- После описанной выше процедуры, восстановление покровные погружением слайдов в водопроводной воде.
- Поместите каждый покровное в луночного планшета.
- Добавить 60% хлорной кислоты (количество должно быть достаточно, чтобы полностью покрыть клетки) и оставить O / N при 4 ° С при осторожном перемешивании.
- Считать оптическую плотность надосадочной жидкости спектрофотометрически при длине волны 450 нм.
- Для нормализации значений числа клеток, добавьте Janus Green (0,2% раствор в PBS), чтобы покрыть клеточный препарат в течение 10 мин.
- Вымойте тщательно сверхчистой водой.
- Добавить 0,5 HCl (количество должно быть достаточно, чтобы покрыть все клетки) и слегка встряхнуть рукой в течение нескольких секунд.
- Считайте абсорбцию при 615 нм с помощью спектрофотометрии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты были получены от 5 до 10 независимых экспериментов.
Морфология клеток
А.А. / GP обработаны первичные клетки имеют в основном булыжником, как черты, характерные для зрелых остеобластов. Перемежаются разветвленные клетки (как указано красными стрелками на рисунке 1а) можно найти, что, вероятно, представляют собой некоторые остеоцитов.
При лечении ATRA, клетки быстро начать показ последствия, которые обычно наблюдаю...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В последние годы остеоцитов стала самой центральной ячейки в кости. Научно-исследовательские достижения постепенно выявить ряд ранее непредвиденных или недоказанных свойств остеоцитарного, которые имеют огромное значение для проектирования новых и лучшее лечение для различных костных заболеваний. Тем не менее, исследование остеоцитарного биологии страдает от ограниченной доступности моделей в пробирке до такой степени, что остеобласты были использованы в качестве суррогатных клеток в течение длительного периода...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Финансирование было предоставлено "Progetto Concorso Fondazione IRCCS Оспедале Маджоре Поликлинико 2009-2010", чтобы доктор медицинских наук, и Associazione Bambino Nefropatico ABN Онлус, Милан
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коллагеназа P | Roche Прикладная наука | 11213857001 | |
| трипсина | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Предварительный прогрев при 37 градусах; C перед применением |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Предварительно прогреть до 37 градусов; C перед применением |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Стрептомицин/Пенициллин | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Глицерин 2-фосфат динатриевая соль | гидрат Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Защита ATRA от света |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | P6148 | Растворить в PBS и отфильтровать перед использованием. Всегда работайте под химическим капотом. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Можно добавить к вторичному антителу |
| Ализарин красный | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Хлорная кислота | Sigma-Aldrich | 176745 | Используйте с осторожностью (рекомендуется защита кожи и глаз) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Используйте с осторожностью (рекомендуется защита кожи и глаз) |
| Глицерин | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Экономичный пинцет #7, 0,40 x 0,5 мм наконечники | World Precision Instruments | 501981 | |
| Экономичный пинцет #4, 0,40 x 0,45 мм наконечники | World Precision Instruments | 501978 | |
| Ножницы для препарирования, прямые, 10 см изогнутые | World Precision Instruments | 14394 | |
| Хирургические ножницы, 14 см, прямые, колбы для культуры S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Cultures | Corning | 430168 | |
| Луночные пластины | Corning | 3335 | |
| Покровные стекла Thermanox | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Микроскоп | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
Ссылки
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
