Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и Экс естественных Фибробласты

Краткое содержание

Молекулярная профилирования лазерных микродиссекции клеток и стромы из синтетических, тканевой инженерии моделей колоректального рака представляет собой новый и которыми можно манипулировать подход характеризовать и анализировать отличительные биологии на границе раздела между опухолевых клеток в передней и инвазивного рака связаны стромальных клеток.

Аннотация

Вторжение колоректального рака (CRC) клетки приобрели способность освободиться от своих сестринских клеток, проникнуть стромы и реконструировать внеклеточный матрикс (ECM). Характеризуя биологии этого фенотипически отдельной группы клеток могут существенно улучшить наше понимание ранних событий в течение метастатического каскада.

Опухоль вторжение представляет собой динамический процесс облегчается двунаправленного взаимодействия между злокачественной эпителия и рака связаны стромы. С целью изучения клеточно-специфической реакции в строме опухолевой-интерфейса мы сочетании Органотипической совместное культивирование и лазерные методы микро-рассечение.

Органотипической модели, в которых ключевые стромальных составляющие, такие как фибробласты 3-dimentioanally совместном культивировании с раковыми эпителиальных клеток, весьма, которыми можно манипулировать экспериментальные инструменты, которые позволяют вторжение и рак-стромы взаимодействия, чтобы быть изучены в ближайшем телysiological условия.

Лазерная микродиссекции (РМР) представляет собой метод, который влечет за собой хирургическое вскрытие и извлечение различных слоев в опухолевой ткани, с точностью уровня микрон.

Комбинируя эти методы с геномной, транскриптомных и эпигенетической профилирования мы стремимся развивать более глубокое понимание молекулярных характеристик вторжения опухолевые клетки и окружающие стромальную ткань, и при этом потенциально выявить новые биомаркеры и возможности для разработки лекарств в КПР.

Введение

Органотипической со-культуры являются тканевой инженерии модели, которые помогают в восстановлении в естественных условиях опухоли микроокружения в 3 измерениях путем сопоставления злокачественные эпителиальные клетки и стромальные клетки в коллагенового геля, содержащей существенные компоненты внеклеточного матрикса ^1-3. В принципе задумана как метод измерения опухолевой инвазии, organotypics уменьшить зависимость от ин виво животных моделях, и избежать недостатков других методов в пробирке, таких как Transwell анализов, в которых вторжение клетки вынуждены искусственно в монодисперсные состоянии ^2-4. Включение стромальных клеток в этих моделях, таких как фибробласты, отражает важную роль микросреды опухоли в регулировании злокачественной инвазии и метастазирования ^3-4, однако фенотипическая гетерогенность стромы такова, что в целях обеспечения максимальной физиологическое значение Органотипической модели, определенный орган, анатомически точны экс естественныхфибробласты должны быть включены по мере возможности ^3,6.

Organotypics являются универсальной платформой для изучения взаимодействия между опухолью и стромальных клеток и все чаще используются в новых способов для изучения влияния на опухолевой инвазии химических ингибиторов и целевых изменения гена ^7,8. Изучая инвазивной запас опухоли является особенно захватывающая перспектива. В органотипических моделей, созданная колоректальный рак (CRC) клеточные линии, как правило, производят также стратифицированную эпителиального слоя, и в поперечном сечении, клетки, которые приобрели способность вторгаться внеклеточный матрикс (ECM) легко различимы. В свете сложившейся микро-топографической неоднородностью опухоли и опухоли связано стромальных клеток в естественных условиях, извлечение этих клеток с помощью лазерного микродиссекции и изучение их в изоляции, может выявить важные биологические идеи относительно истоков колоректального метастазов рака и как это может быть более эффективно целенаправленными. Ян следующая методология, все пациенты, которые пожертвовали образцы ткани было получено письменное информированное согласие, а исследование было одобрено учреждений региональных исследовательских комитет по этике.

Протокол

1. Установление первичной культуры фибробластов из толстой эксплантов

1. Получение образцов нормальной слизистой оболочки толстой кишки человека ткани непосредственно из хирургической операционной, и приостановить в 7-10 мл ФСБ с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл Fungizone.
2. В лаборатории, поместите образец в центре 10-см блюдо культуры ткани и промыть 3 раза с PBS / Пен-острый / Fungizone. Не аспирации после последней промывки.
3. С стерильным пинцетом и скальпелем, разрезал ткань на мелкие кусочки (примерно 2 мм) и поместите каждую часть в центре креста, проведенной с лезвием скальпеля в 12-луночный планшет. Rock скальпель мягко по ткани, чтобы позволить ему придерживаться.
4. Культура образцы в 750 мкл первичного медиа роста фибробластов (DMEM, дополненной 20% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 100 Е / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 292 мкг / мл L-глутамина), который должен submeRGE ткани без включения его плавать. Избегайте нарушая пластину в течение следующих 5 дней, за исключением вновь корма каждые 2 дня.
5. В течение следующих 5 дней фибробласты будет медленно начинают расти из края ткани. Примерно в 7 дней, это будет более заметным. Примерно через 3-4 недели, а при наличии достаточных фибробласты, растущие из, добавить 750 мкл трипсина в каждую лунку. После клетки отдельно (это может занять 5-10 минут), бассейн и передачи в культуре ткани колбу Т-25.

2. Органотипической Подготовка

Подготовка фибробластов пропитанные органотипической геля:

1. Подготовка фибробластов клеточной суспензии, содержащей 5 × 10 ⁵ клеток на Органотипической в DMEM с добавлением 10% FCS и 292 мкг / мл L-глутамина.
2. Составляют органотипической гели на льду, в следующих соотношениях:
   • 7 объемов Rat-Хвост коллагена: Матригель смесь (1:1)
   • 1 объем отфильтрованной 10x DMEM
   • 1 объем ФТС
   • 1 объем суспензии клеток фибробластов, содержащей 5 х 10 ⁵ фибробласты
     За 9 гелей (1 мл на гель) подготовить 10 мл и аккуратно перемешать, чтобы избежать пузырей.
3. Добавить 1 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубировать 1 час при 37 ° С в увлажненной атмосфере, чтобы позволить гели для установки. Через 1 час добавляют 1 мл DMEM (10% FCS) / GLUT в верхней части гели и возвращают в инкубатор на ночь.
4. На следующий день аспирации среды из верхней части гели и пластины 1 мл среды, содержащей 5 × 10 ⁵ CRC эпителиальные клетки.

Подготовка геля покрытием нейлона листов:

5. Приготовьтесь стерильные, автоклавного нейлоновые листы измерительные 1,5 см х 1,5 см, заранее.
6. Использование стерильного пинцета, поместить необходимое количество нейлоновых листов в 10 см блюдо культуры (обычно 4 нейлоновые листы могут быть размещены за блюдо).
7. Макияж гель на льду в следующем порядке (250 всего мклОбъем требуется на нейлоновой листа):
   • 7 объемы Rat-Хвост коллагена
   • 1 объем отфильтрованной 10x DMEM
   • 1 объем ФТС
   • 1 объем DMEM 10% FCS / Перенасыщение
8. Если раствор желтого цвета, нейтрализовать добавлением 0,1 М NaOH в 50 мкл аликвоты, пока раствор не станет розовым.
9. Добавить 250 мкл этого раствора в каждую из нейлона листа и инкубируют при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ в течение 30 мин, чтобы позволить гель для установки.
10. Макияж 1%-ный раствор глютаральдегида в PBS. Добавьте 10 мл на каждый 10 см чашки для культивирования после того, как гель установил и инкубируют при 4 ° С в течение 1 часа.
11. Нейлоновые листы Вымойте 3x в PBS и 1x в DMEM (10% FCS) / Glu и инкубировать в течение ночи в DMEM / Glu при 4 ° С.

Повышение органотипической гели на стальные сеток для вторжения:

12. Предварительная подготовка строительных лесов сетки путем складывания из нержавеющей стали листы в пласт штатива. Автоклав перед использованием.
13. С помощью пинцета стерилизованные в этаноле разместить стальную сетку в каждую лунку луночного планшета шесть.
14. Поставьте нейлона лист гель покрытием с коллагеновой стороной вверх, на каждой сетке.
15. Тщательно передать органотипической гели от пластины 24-а в нейлоновой листа повышенной помощью шпателя стерилизованное в этаноле.
16. Заполните скважины с DMEM 10% FCS / Glut с добавлением 10% FCS, пока нейлон лист не находится в контакте со средой, но не погружен в воду. Убедитесь, что среда не прикасайтесь к органотипической гель.
17. Инкубировать в течение 14 дней при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO _2, замену носителя каждые 2 дня.

3. Органотипической Фиксация

1. Удалить всю Органотипической включая нейлона листа из хорошо и поместить на пищевой пленкой.
2. Пополам Органотипической и нейлона лист, используя чистую одноразовую скальпель и исправить обе половинки в формальдегиде в течение 24 часов при комнатной температуре.
3. Заменить формальдегид 70% Итаномол после 24 часов и оставить на ночь до внедрения в парафин, секционирования и окрашивания.

4. Лазерная микродиссекция из инвазивным маржи

1. Раздел 10 мкм толщины на мембрану слайды.
2. Deparaffinize секции, применяя ксилоле в течение 1 мин, а затем удалить ксилол и зафиксировать в 75%-ном этаноле в течение еще 1 мин.
3. Удаление этанола и пятно с 0,125% раствора крезиловым фиолетовым в течение 1 мин. Крезил Фиолетовый подчеркивает эпителиальные клетки и позволяет легко с дискриминацией со стороны стромы.
4. Удалить крезиловым фиолетовым и применить 100% этанола в течение 1 мин перед промывкой 100% этанола. Разрешить слайды высохнуть на воздухе в течение 30 мин.
5. Проведение лазерного микродиссекции используя выбранную платформу (например, системы Leica AS).
6. Поместите предметное стекло с окрашенных разделе должны быть микродиссекции лицом вниз на столик микроскопа.
7. Установите на 0,5 трубки микроцентрифужных мл в кассету сбора и добавить 50 мклбуфера для лизиса клеток (например, ДНК, РНК или белок буфера для лизиса) с крышкой, в которую микродиссекции ткани будет собирать.
8. Под контролем зрения с помощью джойстика для идентификации ткани интересов, и с помощью программного интерфейса, комментировать запятнанную органический раздел, выделяя ячейки, которые будут микродиссекции в опухолевой инвазии фронт.
9. Поручить лазер, чтобы огонь, который должен как вырезать выделенную секцию и вывести микродиссекции ткани в крышке трубки микроцентрифужных.
10. После того, как достаточное количество материала было собрано, извлечь кассету для сбора, закройте микроцентрифужную пробирку и осторожно вращать обратить буфере для лизиса на дне пробирки.
11. Поместите образцы на льду до микродиссекции не будет завершена. Образцы процесс, с помощью соответствующего метода для извлечения интерес аналит.

Результаты

Мы применили данный метод для нескольких комбинаций CRC клеточных линий и стромальных клеток. Одним из примеров, представленные здесь, SW480 эпителиальных CRC клеточные линии с первичными Экс Vivo толстой фибробластов человека. 3-мерные сокультурах построены (рис. 1), подвергают микроскопии и лазерного захвата микродиссекции (рис. 2), и анализировали с помощью микроРНК (микроРНК) профилирования (рис. 3) для сравнения разному экспрессируются микроРНК между клетк...

Обсуждение

Здесь мы опишем метод специально выделить и охарактеризовать опухолевые клетки, которые приобрели способность вторгаться в рака, связанного стромы на самых ранних стадиях метастатического прогрессирования в 3-мерном сокультуры конструкции эпителиальных и стромальных клеток.

Модели Сотрудничество культуры, состоящие из CRC эпителиальных клеток, расположенных рядом с синтетическим стромы, содержащей Экс Vivo толстой фибробласты человека были использованы для изучения CRC вторжение в 3...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточные линии колоректального рака - показан пример SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Коллаген	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Нейлоновая мембрана	Merck Millipore	VVLP01300
Металлическая сетка	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Лазер платформа для микродиссекции	Leica	Microsystems Leica AS LMD
Мембранные накладки	Молекулярные приборы
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025