Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модифицированный

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51480

⸱

24 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Stress Biology, Roswell Park Cancer Institute, 2Department of Pharmaceutical, Social and Administrative Sciences, School of Pharmacy, D'Youville College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой видеостатье описывается модифицированный метод in vitro для изучения роли гормонов, цитокинов и/или факторов роста в стимулировании инвазии раковых клеток.

Аннотация

В сыворотке крови служит хемоаттрактант, к которой раковые клетки мигрируют и вторгнуться, облегчая их intravasation в микрососудов. Тем не менее, фактические молекулы, к которой клетки мигрируют остаются неизвестными. Это измененный вторжением анализ был разработан для определения целей, которые управляют миграцию клеток и вторжения. Этот метод сравнивает индекс вторжения при трех условиях, чтобы определить, фактор роста, цитокин или играет ли конкретный гормон роль в опосредовании инвазивный потенциал раковых клеток. Эти условия включают в себя I) нормальным фетальной бычьей сыворотки (FBS), II) уголь-лишен ФБС (CS-FBS), который удаляет гормоны, факторы роста и цитокины и III) молекулу, CS-FBS + (обозначается "X"). Существенное изменение в клеточной инвазии с CS-FBS, по сравнению с FBS, указывает на вовлечение гормонов, цитокинов или факторов роста в опосредовании изменение. Отдельные молекулы затем могут быть добавлены обратно в CS-FBS для анализа их способность повторностих или спасти фенотип вторжения. Кроме того, два или более факторов, могут быть объединены, чтобы оценить дополнительный или синергический эффект нескольких молекул в движении или ингибирования инвазии. В целом, этот метод дает возможность исследователю, чтобы определить, является ли играть роль в инвазии клеток гормоны, цитокины и / или факторы роста, служа хемоаттрактанты или ингибиторов инвазии для конкретного типа раковой клетки или конкретного мутанта. Путем выявления конкретных хемоаттрактанты и ингибиторы, этот измененный вторжением анализ может помочь выяснить пути, которые прямого вторжения раковых клеток сигнализации.

Введение

Роман вторжение анализ был разработан с целью выявления участия конкретных гормонов, цитокинов и / или факторами роста, как хемоаттрактантов в вторжения раковых клеток. Способность опухолевых клеток вторгнуться через внеклеточного матрикса (ЕСМ) является отличительной чертой метастатического фенотипа 1-3. Вторжение камеры были широко использованы в качестве инструментов в пробирке для изучения вторжение раковых клеток и миграции, и может обеспечить знаний в отношении механизмов в естественных опухолевой инвазии и метастазирования. Камеры состоят из цилиндрических вкладышей для культивирования клеток, вложенных в лунки для культивирования клеток пластин. Днища вставок являются полупроницаемые поликарбоната или полистирола мембраны определенных размеров пор.

В стандартном анализе инвазии, клетки высевают на пластины с мембраной свободных средств массовой информации сыворотки и помещают в лунки для культивирования клеток, которые заполнены сыворотки или в сыворотке, как хемоаттрактанты чтобы си др до chemoattractive силой. Это диски сила клетки для перемещения через полупроницаемую мембрану (миграции) или, альтернативно, через покрытие внеклеточного матрикса (вторжения), которые затем могут быть окрашены с использованием обычных красителей, чтобы обнаружить и определить число клеток. Число клеток затем нормализованы в зависимости от степени миграции и инвазии в неинвазивной клеточной линии. Этот метод позволяет исследователю оценить инвазивный потенциал различных типов клеток при различных условиях, в том числе генетических манипуляций.

Гормоны, цитокины и факторы роста являются важными компонентами сыворотки и чаще показано, что связано с вождением инвазивный фенотип 4. Тем не менее, природа, роль и специфика этих chemoattractive молекул в сыворотке крови посредником вторжение еще остаются неизвестными. Задача по-прежнему, чтобы определить, какие конкретные факторы в сыворотке или сыворотки, как хемоаттрактантов несут ответственность за вождениевторжение раковых клеток, а также то, что молекулы могут ингибировать процесс инвазии. В этом докладе мы описываем методологию для оценки потенциального участия гормонов, цитокинов и / или факторов роста, присутствующих в сыворотке крови, так как молекулы вождения хемоаттракции и проникновение раковых клеток.

В этом предлагаемого модифицированного протокола, древесный уголь зачистки используется для удаления гормоны, цитокины и факторы роста от 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы генерировать 2% FBS уголь зачищенный (CS-FBS). И 2% FBS и 2% FBS, CS-используют в качестве агентов для настройки chemoattractive силу для управления инвазию раковых клеток. С использованием 2% CS-FBS в chemoattractive агента по сравнению с обычной 2% FBS дает несколько преимуществ, включая первую и наиболее заметно, способность к обучению на инвазию раковых фенотип в восстановленном / относительном отсутствии гормонов, цитокинов и факторов роста. Это позволяет экспертам оценить, является ли коллективной удаления гормонов, факторов роста, и суtokines вызывает увеличение или уменьшение инвазивной индекса. Анализ затем предназначен для определения того, добавление отдельного компонента, обозначенного как "X" может ингибировать, уменьшение, увеличение или восстановление инвазивной индекс к исходному значению (рисунки 2 и 3). Хотя эта методика является специфическим для достижения физиологические уровни компонента, который удаляется из сыворотки во уголь зачистки, следует также отметить, что древесный уголь зачистки также может влиять путей сигнальной трансдукции. Например, сообщалось, что уголь зачистки может уменьшить активность щелочной фосфатазы из osteoprogenitor клеток и индуцируют липогенез за счет снижения МАРК активаторов 5. Древесный уголь лишенные средств массовой информации, являются коммерчески доступными и основаны на протоколе указано, что сочетает в себе уголь с декстрана и инкубируют с эмбриональной бычьей сыворотки O / N 6.

Этот анализ был разработан в RESPONSE в результате сообщенных Zucker и др. 7 Авторы показали, что мутант фенотип влияет щелевых связи продемонстрировал увеличение индекса инвазии при переходе к среде с нормальной 2% FBS. Это увеличение было устранено с заменой древесного угля раздели сыворотке крови. Из этого результата, авторы пришли к выводу, что этот мутант зависит миграции к липофильной молекулой (более конкретно, гормон, фактор роста, цитокин или) 7. Хорошо известно, что гормоны, факторы роста и цитокины опосредуют путей, участвующих в продвижении и инвазия опухоли 4 сигнализации. Таким образом, это важно для ученых-исследователей, чтобы определить, какой фактор (ы) за рулем опухоли вторжение своих конкретных раковых клеток или мутантов в стадии изучения. Анализ предназначен для решения роли отдельных компонентов по их физиологической концентрации, как определено в соответствии с разницей между концентрацией компонента &# 8220; X "в нормальном FBS и CS-FBS. Благодаря развитию этого анализа, исследователи могут получить более глубокое представление о конкретной инвазивной пути, регулирующего их системы.

Гормоны, факторы роста и цитокины, часто были классифицированы как опухолевых промоторов 8. Некоторые из этих факторов, таких как EGF, используются в качестве непосредственных источников для хемоаттрактанты в инвазии камер 9. Таким образом, вполне вероятно, что они представляют собой основные компоненты сыворотки этого вторжения прямой опухоли. Этот протокол предлагает простой, но существенный, модификацию обычного экстракорпорального вторжения анализе, который позволяет исследователю оценить участие гормонов, факторов роста и цитокинов в опосредовании инвазивный потенциал раковых клеток. Тем не менее, анализ предназначен для обеспечения следователю с ответа на вопрос, будет ли процедура эффективно для их изучения на ранней стадии в анализе, так как не использовать драгоценное время и гЕСУРСЫ если это будет сочтено ненужным. Этот метод использует CS-FBS и полагается на усмотрение следователей, какие молекулы преследовать в качестве ведущих кандидатов, которые потенциально опосредуют вторжение раковых клеток. Результаты этих анализов должны оказаться полезным в определении, какие компоненты сыворотки служить хемоаттрактанты или ингибиторы для конкретной клеточной линии или мутанта изучается. Кроме того, этот подход может помочь следователь определить ключевые сигнальные пути либо способствующие или мешающие вторжение раковых клеток; Таким образом, направление будущих созданию лекарственных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовьте различные средства и дополнительные компоненты

  1. До экспериментировать, подготовить средства массовой информации, состоящий из DMEM или другие указанные средах с добавлением либо нормальной FBS, древесный уголь лишен FBS, или древесный уголь лишен FBS и компонент для тестирования. Следует отметить, что многочисленные компоненты могут быть проверены в каждом эксперименте.
  2. Взвесить и разбавленной гормоны, факторы роста или цитокины, соответственно, чтобы быть растворен в уголь лишен сыворотки в физиологической концентрации.

2. Подготовьте коллагеновой матрицы на льду

  1. Подготовка 2 мл коллагена I матрицы при 2,2 мг / мл, добавив следующие стерильно фильтруют компонентов на льду: 200 мкл 10х PBS (рН 7,4), 5,4 мкл 1 N NaOH, 600 мкл бидистиллированной H 2 O и 1,2 мл коллагена I (в 3,63 мг / мл).
  2. Держите коллагена I решение на льду до готовности к пластине.

3. Подготовить Миграция / Вторжение Плиты для анализа

  1. Для каждого клеточная линия для тестирования, используйте один 24-а камерная плита, в которой 12-колодцы содержать вставки. С помощью дополнительных 12 скважин, которые не содержат вставки для добавления хемоаттрактанту носитель и передачи вставки для экспериментальной установки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: коллагеновый матрикс на тарелках с полиэтиленовой терафталат (ПЭТ) мембраны и размера пор 8 мкм является оптимальным для клеточные линии использовать здесь. Тем не менее, Матригель матрица в предварительно покрытых пластин также может быть замещен с размером пор уменьшается в соответствии с клеточной линии исследуется.
  2. Четкая маркировка пластину, используя 3 скважин в состояние анализируемого (FBS миграции, CS-FBS миграции, FBS вторжения, и CS-FBS вторжения, а также FBS-миграции для контроля, неинвазивный клеточной линии). Анализ миграции в движение через поры в мембране ПЭТ и анализа вторжения движения через коллагена или Матригель матрицы, а затем через поры в мембране. Используйте различные цветовые маркеры для каждого состояния клеток кID в процессе нанесения покрытия.

4. Отказаться от вторжения Matrix

  1. Тщательно пипетки 75 мкл коллагенового матрикса раствора в вставок, которые будут использоваться для инвазии анализов. Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей. Дисперсные пузырьки, применяя инвертированный пипетки на поверхность.
  2. Передача пластины с коллагеном покрытием вставками в 37 ° С и 5% CO 2 инкубаторе в течение 30 минут для того, чтобы гель для затвердевания.

5. Плита клетки на мембране или вторжения Matrix

  1. Между тем, Trypsinize клетки и добавить носитель с 10% FBS. Побочные клетки в 200 мкг в течение 5 мин на настольной центрифуге и полоскание 3 раза в сыворотке крови свободных средств массовой информации.
  2. Ресуспендируют в сыворотке крови свободных средств массовой информации. Граф клеток с гемоцитометра или автоматизированном режиме слайд счетчика. Добавить бессывороточной среды до конечной концентрации 5 х 10 4 клеток / мл.
  3. Когда коллаген матрица затвердеет (через 30 мин), добавляют 700 мкл среды либо с2% FBS, определенные или древесный уголь, раздели FBS в каждую лунку. Из 12 вставок на пластине:
    • 3 вставки имеют коллаген и скважин со средствами массовой информации + 2% FBS
    • 3 вставки имеют коллаген и скважин со средствами массовой информации + 2% CS-FBS
    • 3 вкладыша нет коллагена и скважин со средствами массовой информации + 2% FBS
    • 3 вкладыша нет коллагена и скважин со средствами массовой информации + 2% CS-FBS
    1. Использование дополнительных пластин в зависимости от ряда факторов, которые испытаны и с контролем не коллагена, соответствующего каждому условию.
  4. Добавить клеточной суспензии с вставками в 5 х 10 4 клеток / мл, покрытие 500 мкл клеток на вставке во всех миграции и инвазии вставками.
  5. Инкубируйте клетки в течение 22 ч при 37 ° С.

6. определить число мигрирующих и проникают в клетки

  1. Настройка окрашивание скважин с использованием метанола фиксатором, эозин, и hemotoxylin, в отдельных скважинах.
  2. Используйте ватные тампоны для удаления клеток и матричных из каждой лунки.Rrepeat со вторым приложением тампоном для каждой лунки.
  3. С пинцетом, окуните каждой вставки 5 раз за 1 сек в каждом из 3 решений подряд.
  4. Разрешить вставки, чтобы высушить O / N.
  5. Либо я) снять фильтры с помощью скальпеля, резка тщательно по краям и смонтировать на слайде с покровного и иммерсионного масла, или II) позволяют вставки для сушки O / N переворачивают и использовать вставки непосредственно для микроскопии.
  6. На следующий день, просматривать слайды или вставки под микроскопом с целью 20X и принять 5 изображений в различных регионах фильтра. Для улучшения консистенции, взять 4 внешних полей и один центр.
  7. Граф клеток для всех условиях с использованием программного обеспечения ImageJ и применить к формулам, приведенным ниже.
  8. Определить процент инвазии следующим образом:
    Средняя # клеток вторжения через коллагена вставить = а
    Средняя # клеток, мигрирующих через регулирующий вставки = Ь
    Вторжение% = (A / B) * 100
  9. Определения индекса вторжения в 2% FBS следующим образом:
    % Инвазия клеток, подвергаемые исследованию (в 2% FBS) = C
    % Вторжение управления неинвазивных клеток в (2% FBS) = d
    Индекс Вторжение (ФБС) = (C / D)
  10. Определения индекса вторжения в 2% CS-FBS следующим образом:
    % Инвазия клеток, подвергаемые исследованию (в 2% CS-FBS) = е
    % Вторжение управления неинвазивных клеток в (2% CS-FB) = F
    Индекс Вторжение (CS-FBS) = (E / F)

7. Повторите Экспериментальный протокол Сравнивая уголь раздели FBS, чтобы уголь раздели FBS + X N с множественными факторами Комбинированные

  1. Повторить процедуру несколько раз, сколько необходимо, используя различные компоненты для "X" или комбинации компонентов.
  2. Применить расчеты, чтобы определить вклад каждого фактора «Х» к миграции и инвазии эффектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Индекс вторжение рассчитывается для каждого состояния в соответствии с нормализацией к неинвазивным клеточной линии. Для наших экспериментов мы используем линию 1205Lu клеток меланомы и создана вариантные стабильных клеточных линий, как наши инвазивных линий, а также предраковые неинвазивный вариант, WM793, из которого клетки 1205Lu были получены, 10, который служит в качестве логического контроля. Мы также используем коллагена I, как вторжение матрицы, потому что это основной компонент дермы. Это в соответст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Опухоль метастазы многоступенчатый процесс. Клетки должны прорваться через базальную мембрану, intravasate ни в одну лимфатической системы и кровеносных микрососудов, в которых они перевозятся в отдаленные участки. Опухолевые клетки затем extravasate и колонизировать в macrometastasis 12. Прогрессирование через эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT), опухолевой инвазии, и метастазирования была повышена стероидных гормонов 13,14, факторы роста 15-18 и цитокины 19-21. Эти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают источники финансирования от Фармацевтической школы колледжа Д'Ювилль, Буффало, штат Нью-Йорк.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Контрольные вставки BioCoat с 8.0 и микро; m ПЭТ мембранаCorning35457812 в каждом из двух 24-луночных планшетов. ПЭТ = полиэтилентерефталат
Коллаген I, крысиный хвостCorning354236Источник = сухожилие крысиного хвоста, чистота = 90%
Фиксатор; Diff-QuickThermo Fisher ScientificNC9844047Фиксатор на основе метанола, гематоксилин/эозин
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies16000Обозначена как FBS
Древесный уголь Фетальная бычья сывороткаLife Technologies12676Обозначена как CS-FBS
Фетальная бычья сывороткаThermo Scientific HycloneSH30070Обозначена как FBS
Очищенная древесным углем фетальная бычья сывороткаThermo Scientific HycloneSH30068обозначена как CS-FBS

Ссылки

  1. Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  4. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  5. Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
  6. Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
  7. Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
  8. Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
  9. Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201(2010).
  10. Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
  11. Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
  12. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
  13. Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
  14. Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
  15. Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
  16. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  17. Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
  18. Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
  19. Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
  20. Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
  21. Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
  22. Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
  23. Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FBSin vitro
Модифицированный
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.