Модели спонтанного метастатическим почечно-клеточная карцинома (RCC) прогрессирования заболевания может быть использован для оценки процедуры в клинически значимых обстановке. Этот протокол демонстрирует различные процедуры для ортотопической имплантации почки опухолевых клеток, правильного нефрэктомии, и, наконец, излагается вскрытии руководство для визуального и биолюминесцентной скоринга метастатического бремени и локализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моделирование Спонтанное раке почки (МСКЦ) у мышей после Нефрэктомия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Один из ключевых вызовов для улучшения тестирования новых экспериментальной терапии в почечно-клеточной карциномы (РСС) является разработка моделей, которые добросовестно повторять прогрессирование ранней и поздней стадии метастатического заболевания. Типичные модели имплантации опухоли используют внематочной или ортотопической имплантации первичной опухоли, но мало включают в себя системную спонтанное метастазы, который имитирует клинических условиях. Этот протокол описывает ключевые шаги по развитию прогрессирование заболевания РСС стадии похожи на пациентов. Во-первых, он использует очень метастатического мыши линии клеток опухоли у сингенных модели, чтобы показать ортотопической имплантации опухолевых клеток. Методы включают поверхностную и внутреннюю имплантации в суб-капсульного пространства с клетками в сочетании с матригеле, чтобы предотвратить утечку и раннее распространение. Затем это описываются процедуры удаления несущей опухоль почки (нефрэктомии), с критическим пред-и пост-хирургической помощи мыши. Наконец, показывает шаги, необходимые для мониторинга и оценкимикро-и макро-метастатического прогрессирования заболевания, в том числе биолюминесцентной изображений, а дает подробное визуальное руководство вскрытии забить общее распределение заболевания. Цель этого описания протокола является содействие широкому использованию клинически значимых метастатических моделей РСС улучшить прогностическую ценность будущего терапевтического тестирования.
Введение
Основной причиной смертности у пациентов с почечно-клеточной карциномы (РСС) носит системный характер метастазы, что обычно происходит после хирургического удаления первичной опухоли, растущей в почках. Однако, очень немногие доклинические моделях опухолей оценке экспериментальной терапии у мышей включают метастазы, и еще меньше добросовестно повторять клинические этапы локализованной роста, хирургии, и спонтанной микро-метастатическим инициации и прогрессировании 1-3. Этот разрыв в тестировании становится все более важным в оценке новых методов лечения, как иногда поразительные эффекты противоопухолевые видели в моделях на животных не всегда переводятся на так же успешного лечения больных 4. Такие различия в результатах может быть связано с дифференциальных эффективностью наркотиков между локализованными внематочной или ортотопических первичных опухолевых моделях и поздней стадии метастазирования 5-7. В случае РСС, всего в нескольких исследованиях использовали созданапротоколы Нимал, которые включают спонтанную рецидив заболевания, что имитирует пациенты, которые, как правило, имели опухоли, несущие почки полностью или частично удалены 2,3. Причины этого недостатка в мыши модели контроля на разных. Во-первых, существует высокая стоимость животного и присуща вариабельность отбора опухолевых клеток и метастатическим потенциалом. Например, клеточных линиях почки человека, как правило, редко метастазируют, и должны быть выбраны в течение нескольких раундов ортотопического первичной имплантации и метастатическим отбора чтобы вывести варианты, которые последовательно распространения и образуют отдаленные поражения (см. описание такого человека выводе клеточной линии 8-10) . С другой стороны, клетки мыши в моделях иммунокомпетентных правило, ведут себя агрессивно, и низкие количества клеток должен быть введен с матригеле чтобы уменьшить немедленного системного распространения 3. Во-вторых, технические трудности в выполнении надлежащего имплантации, хирургической резекции (нефрэктомии), и отслеживания (и количественного) спонтанное metastatiрост с может быть сложным и несколько критических переменных нужно учитывать при использовании этого метода (см. Обсуждение Подробнее). Цель этого протокола заключается в описании основные шаги (а также потенциальных ловушек) ортотопического имплантации, резекции (нефрэктомия), а также мониторинг спонтанной метастатической болезни РСС и предложить руководство для стандартизированной (и более широкое распространение) использовать среди научных лабораторий что оценить эффективность экспериментальной терапии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Ортотопическая почек имплантации опухоли
- Культура клеток
- До ортотопического имплантации, расти мыши RENCA LUC клетки в виде монослоя до 75% слияния.
- После трипсинизации и ресуспендированием в 5% FBS средах, центрифуги клеток при 1000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 5 мин, повторяя 3 раза, чтобы вымыть в PBS. Затем ресуспендирования клеток в бессывороточной среде до концентрации 5 × 10 4 Ренка LUC / 5 мкл сыворотки среде.
Примечание: В зависимости от варианта или клеточной линии, используемой, клетки могут быть ресуспендировали в соотношении 1:1 из матригеле и сыворотки свободных СМИ, чтобы замедлить весьма агрессивный рост клеток мыши и распространение после имплантации.
- Хирургия и сотовый имплантация
Примечание: Все исследования на животных там описано, в том числе технического обслуживания и определения экспериментальных конечных точек, были выполнены в соответствии с Институциональный комитет Уход и использованию животных (IACUC) рrotocol утвержден Roswell Park института рака.- Обезболить один BALB / C мышь, используя изофлураном (2-3%). Pinch ногу и проверьте рефлекса для обеспечения достаточного обезболивания. Применить ветеринар мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание. Наведите мышь в правой боковой лежачее положение и бриться левой стороны между носовой и задних конечностей. Применить спирт и йод вместе спинной поясничной области в асептических условиях подготовить область для разреза.
- С помощью хирургических ножниц, чтобы инициировать 1 см разрез кожи в продольном направлении между последним ребром и тазобедренного сустава. Ослабить соединительной ткани под кожу с помощью тупым ножницами. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать 0,5 см разрез в продольном направлении в брюшной стенке. Используйте изогнутых щипцов, чтобы мягко надавите вокруг открытой раны - это экстериоризоваться почку и позволяют нежной иммобилизации органа перед инъекцией.
- Загрузить шприца Гамильтона с 5 мкл приготовленной смеси клеток. Для суб-капсульных имплантацииплантациях, два метода имплантации могут быть использованы:
- Поверхностная: Параллельно с продольно ориентированной почек, вставки иглы под почечную капсулу (но выше паренхимы) с скошенным краем вверх. После того, как игла находится в месте, не вводить все клетки, пока маленькие белые форм пузырь. Медленно снимите иглу из капсулы и сразу промокните над инъекции стерильной ватной палочки, чтобы поглотить любую утечку и предотвратить распространение клеток.
- Внутренний: со скошенной кромкой вверх и, начиная со стороны, противоположной почки для окончательного сайте имплантации, вставить иглу через интерьере почки, пока игла не видна (но не прокалывание) суб-капсульного пространство. Введите все клетки, пока белые формы пузыря и тампон место инъекции не для предотвращения любой утечки.
- Осторожно вернуть почку полости тела. Закройте брюшной стенки тела с использованием рассасывающиеся 5-0 викрил шов. После завершения тянуть слой кожи вместе и поместить 2-3 Вткруглый клипы. Обеспечить клипы являются твердыми и равномерно, чтобы исключить воздействие раны. До восстановления управлять 500 мкл 0,9% NaCl и 100 мкл бупренорфина (0,01 мг / мл) подкожно с помощью 25 G иглу. Регулярно контролировать размещение клипа и стабильности, и удалить через 10 дней.
2. Нефрэктомия / Первичная удаления опухоли
- Следуйте идентичный протокол для мыши обезболивания, иммобилизации, разрез, и воздействия почки, как описано в разделах 1.2.1 и 1.2.2 (см. выше).
- Используйте вторую пару щипцов, чтобы изолировать почку, осторожно удаляя соединительный жировой ткани от хвостового конца и надпочечники от краниального конца почки. В то время как нежно схватив почку, использовать рассасывающиеся 5-0 викрил шов сделать двойной узел вокруг мочеточника, почечной артерии и вены. Медленно безопасности, а затем разрезать над узлом, чтобы удалить почку. Если какой-либо признак немедленно кровопотерей, или Существует риск недостаточного удержаниеиз шва на мочеточника, артерии и вены, а затем использовать cauterizer вместо ножницы, чтобы вырезать выше узла.
- После того, как почки удаляют, тщательно проверьте, нет ли кровотечения из привязанной артерии и при необходимости использовать cauterizer. Закройте брюшной стенки тела с использованием 5-0 викрил. Потяните слой кожи вместе и поместить 2-3 раны клипы следующем же меры предосторожности, как описано в 1.2.4. Внимательно следить за животное в день после операции по поводу признаков неблагополучия, кровотечение или ограниченной подвижностью. Следуйте институциональные рекомендации по животным безопасно.
3. Мониторинг Metastatic прогресс и локализация в конечной точке
- Метастазы количественное болезнь: Биолюминесцентный мониторинг
- См. методологию, описанную ранее в Юпитер для мониторинга метастазов с использованием клеток, трансфицированные люциферазы и количественно, используя системный изображений 11,12 Xenogen ИВИС.
- Визуальный руководство вскрытие для сравнительной оценки метастатического распреТион
- Жертвоприношение животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам, используя конечные точки, включая признаков неблагополучия, затрудненное дыхание, потеря веса и т.д.
Примечание: Тщательный мониторинг животных имеет решающее значение как спонтанное метастатическим развитие болезни может быть сильно варьирует и быстрый. - Используйте хирургические ножницы, чтобы начать разрез выше уретры, которая продолжает до грудной полости в нижней челюсти. Используйте затупляли ножницы, чтобы отделить кожу от мышц брюшной стенки.
- Инициировать разрезы вдоль рук и ног. Пил кожи прочь. Внимательно осмотрите фасции кожи и брюшной стенки для узелков, то поверхностные лимфатические узлы: паховые, плечевого, подмышечные и поверхностным шейки матки.
- Сделать разрез в брюшной стенке и разрезают вдоль левой и правой боковых сторон до диафрагмы. С одной горизонтального разреза снять переднюю часть брюшной стенки, чтобы обнажить внутренние органы.
- Изучите спокойно внешний вид внутренних органов еили грубой заметные опухоли. Также обратите внимание на содержимое желудка и кишечника; если они пустые, мышь, возможно, не в состоянии съесть. Если содержимое темные, это может указывать доказательства верхнего / нижнего желудочно-кишечные кровотечения.
- Визуально оценить каждый орган на наличие опухоли или отсутствие, назначив общий балл для каждой группы мыши (4 животных в группе используется в качестве примера на рис 1D-и).
Примечания: 1) Расширение лимфатических узлов, не обязательно означает, что это рост опухоли; если это существенно размера, очень твердая, и беловатый цвет, вполне вероятно, метастатическим узелок. 2) Чрезмерное молочный или мутноватая жидкость в брюшной полости указывает асцит. Асцит может включать твердые накопления на органах брюшной полости, в частности между долей печени и желудка. 3) для органов, таких как легкие, множественные узелки могут присутствовать и подсчитывали для сравнений между отдельными животными (см., например, 13). - Определите валовой опухоли или аномалии отдельных органов брюшной полости: печень, селезенка, почки и поджелудочной железы, тщательно удаляя и промывания PBS из бутылки шприц.
- После удаления органов брюшной полости, осмотреть живота лимфатические узлы, в том числе поясничного, крестцового, почек и брыжейки лимфатического узла.
- Оценка диафрагму на наличие метастазов.
Примечание: широкое распространение на мембрану может сбить его сократимость, что приводит к затрудненное или потеря дыхания. - Удалить диафрагму и сделать два боковых разрезов в грудной полости, удаляя переднюю часть, чтобы разоблачить легкие и сердце.
- Удалить легкие и сердце, осторожно потянув за пищевод и резки выше сердца трахею. Оценка тканей для узелков. Сожмите сердце. Отсутствие пружинистой консистенции может указывать подарок опухоли.
- Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать линейно через череп. Аккуратно удалить небольшие кусочки черепа до тон весь мозг подвергается. Посмотрите на протяжении мозга для видимых узелков или аномалии обесцвечивания.
- Жертвоприношение животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам, используя конечные точки, включая признаков неблагополучия, затрудненное дыхание, потеря веса и т.д.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1А показана схема с изложением изложенными в данной итогового протокола. Несколько важных факторов должны быть рассмотрены для каждого шага. Например, в шаге 1 показывает два способа суб-капсульного имплантации опухолевых клеток в почках. Опухолевые клетки могут быть имплантированы в суб-капсульного пространства с небольшим белым пузырь, подтверждающего локализованную размещение клеток с утечкой предотвратить путем тщательного удаления иглы и моечные избыточного выделение материала (рис....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цель этого протокола заключается в оценке клинически значимого спонтанного метастазы использовании сингенную модель мыши опухоли описать методы имплантации / резекции. В настоящее время большинство доклинических исследований по оценке новых Experimental Therapeutics не включают изучение метастатического заболевания и только немногие резюмировать этапы роста первичной опухоли, хирургической резекции, и в конечном итоге спонтанного метастазирования. На сегодняшний день, генно-инженерные модели мыши (GEMMS) генерируется, ч...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны лаборатории д-ра Роберта С. Кербель (Университет Торонто, Sunnybrook научно-исследовательского института, Торонто, Канада) за техническую помощь и опыт в развитии этой процедуры. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Сандра Секстон и Roswell Park институт рака отдела лабораторного животных ресурсов. Эта работа была поддержана награду от Розуэлл Парк Альянс Foundation (к JMLE).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM-высокий уровень глюкозы с Pyr. и L-глутамин | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0,25% трипсин EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS без кальция и Магний | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | необходимо держать на льду |
| Искусственные слезы-смазка офтальмологическая мазь | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Карманный профессиональный триммер для домашних животных | Braintree научная | CLP9931B | |
| Спиртовой тампон | VWR | 326895 | |
| раствор бетадина тампон | VWR | 67618-152-01 | |
| МИКРО ПРЕПАРИРУЮЩИЕ ножницы прямые, тупые - 25 мм лезвия - 4.5" | Саутпойнт хирургический | RS-5982 | |
| Ирисовый щипец, зубчатый, изогнутый, длиной 10 см | Кент научный | INS15915 | нужны два из этих |
| 10 & микро; l Шприц Hamilton | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 градусов, RN игла | Hamilton | 7803-07 | |
| Аппикатор стерильный ватный наконечник | VWR | 10805-144 | |
| Высокотемпературный набор для прижигания | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 покрытый Vicryl, обычная режущая игла | Ethicon | J834 | |
| Аппликатор для зажимов 7 мм | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 мм, нестерильный | Kent scientific | INS500344 | |
| Щипцы для удаления, длина 12 см | Kent scientific | INS500347 | |
| 0,9% натрия хлорид | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Бупренорфин 0,01 мг/мл | |||
| Игла 25 G 5/8" | VWR | BD305122 | |
| шприц 1 мл без иглы | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
Ссылки
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
