Моделирование Спонтанное раке почки (МСКЦ) у мышей после Нефрэктомия

Основной причиной смертности у пациентов с почечно-клеточной карциномы (РСС) носит системный характер метастазы, что обычно происходит после хирургического удаления первичной опухоли, растущей в почках. Однако, очень немногие доклинические моделях опухолей оценке экспериментальной терапии у мышей включают метастазы, и еще меньше добросовестно повторять клинические этапы локализованной роста, хирургии, и спонтанной микро-метастатическим инициации и прогрессировании ^1-3. Этот разрыв в тестировании становится все более важным в оценке новых методов лечения, как иногда поразительные эффекты противоопухолевые видели в моделях на животных не всегда переводятся на так же успешного лечения больных ^4. Такие различия в результатах может быть связано с дифференциальных эффективностью наркотиков между локализованными внематочной или ортотопических первичных опухолевых моделях и поздней стадии метастазирования ^5-7. В случае РСС, всего в нескольких исследованиях использовали созданапротоколы Нимал, которые включают спонтанную рецидив заболевания, что имитирует пациенты, которые, как правило, имели опухоли, несущие почки полностью или частично удалены ^2,3. Причины этого недостатка в мыши модели контроля на разных. Во-первых, существует высокая стоимость животного и присуща вариабельность отбора опухолевых клеток и метастатическим потенциалом. Например, клеточных линиях почки человека, как правило, редко метастазируют, и должны быть выбраны в течение нескольких раундов ортотопического первичной имплантации и метастатическим отбора чтобы вывести варианты, которые последовательно распространения и образуют отдаленные поражения (см. описание такого человека выводе клеточной линии ^8-10) . С другой стороны, клетки мыши в моделях иммунокомпетентных правило, ведут себя агрессивно, и низкие количества клеток должен быть введен с матригеле чтобы уменьшить немедленного системного распространения ^3. Во-вторых, технические трудности в выполнении надлежащего имплантации, хирургической резекции (нефрэктомии), и отслеживания (и количественного) спонтанное metastatiрост с может быть сложным и несколько критических переменных нужно учитывать при использовании этого метода (см. Обсуждение Подробнее). Цель этого протокола заключается в описании основные шаги (а также потенциальных ловушек) ортотопического имплантации, резекции (нефрэктомия), а также мониторинг спонтанной метастатической болезни РСС и предложить руководство для стандартизированной (и более широкое распространение) использовать среди научных лабораторий что оценить эффективность экспериментальной терапии.

1. Ортотопическая почек имплантации опухоли

1. Культура клеток
   1. До ортотопического имплантации, расти мыши RENCA ^LUC клетки в виде монослоя до 75% слияния.
   2. После трипсинизации и ресуспендированием в 5% FBS средах, центрифуги клеток при 1000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 5 мин, повторяя 3 раза, чтобы вымыть в PBS. Затем ресуспендирования клеток в бессывороточной среде до концентрации 5 × 10 ⁴ Ренка ^LUC / 5 мкл сыворотки среде.
      Примечание: В зависимости от варианта или клеточной линии, используемой, клетки могут быть ресуспендировали в соотношении 1:1 из матригеле и сыворотки свободных СМИ, чтобы замедлить весьма агрессивный рост клеток мыши и распространение после имплантации.
2. Хирургия и сотовый имплантация
   Примечание: Все исследования на животных там описано, в том числе технического обслуживания и определения экспериментальных конечных точек, были выполнены в соответствии с Институциональный комитет Уход и использованию животных (IACUC) рrotocol утвержден Roswell Park института рака.
   1. Обезболить один BALB / C мышь, используя изофлураном (2-3%). Pinch ногу и проверьте рефлекса для обеспечения достаточного обезболивания. Применить ветеринар мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание. Наведите мышь в правой боковой лежачее положение и бриться левой стороны между носовой и задних конечностей. Применить спирт и йод вместе спинной поясничной области в асептических условиях подготовить область для разреза.
   2. С помощью хирургических ножниц, чтобы инициировать 1 см разрез кожи в продольном направлении между последним ребром и тазобедренного сустава. Ослабить соединительной ткани под кожу с помощью тупым ножницами. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать 0,5 см разрез в продольном направлении в брюшной стенке. Используйте изогнутых щипцов, чтобы мягко надавите вокруг открытой раны - это экстериоризоваться почку и позволяют нежной иммобилизации органа перед инъекцией.
   3. Загрузить шприца Гамильтона с 5 мкл приготовленной смеси клеток. Для суб-капсульных имплантацииплантациях, два метода имплантации могут быть использованы:
      1. Поверхностная: Параллельно с продольно ориентированной почек, вставки иглы под почечную капсулу (но выше паренхимы) с скошенным краем вверх. После того, как игла находится в месте, не вводить все клетки, пока маленькие белые форм пузырь. Медленно снимите иглу из капсулы и сразу промокните над инъекции стерильной ватной палочки, чтобы поглотить любую утечку и предотвратить распространение клеток.
      2. Внутренний: со скошенной кромкой вверх и, начиная со стороны, противоположной почки для окончательного сайте имплантации, вставить иглу через интерьере почки, пока игла не видна (но не прокалывание) суб-капсульного пространство. Введите все клетки, пока белые формы пузыря и тампон место инъекции не для предотвращения любой утечки.
   4. Осторожно вернуть почку полости тела. Закройте брюшной стенки тела с использованием рассасывающиеся 5-0 викрил шов. После завершения тянуть слой кожи вместе и поместить 2-3 Вткруглый клипы. Обеспечить клипы являются твердыми и равномерно, чтобы исключить воздействие раны. До восстановления управлять 500 мкл 0,9% NaCl и 100 мкл бупренорфина (0,01 мг / мл) подкожно с помощью 25 G иглу. Регулярно контролировать размещение клипа и стабильности, и удалить через 10 дней.

2. Нефрэктомия / Первичная удаления опухоли

1. Следуйте идентичный протокол для мыши обезболивания, иммобилизации, разрез, и воздействия почки, как описано в разделах 1.2.1 и 1.2.2 (см. выше).
2. Используйте вторую пару щипцов, чтобы изолировать почку, осторожно удаляя соединительный жировой ткани от хвостового конца и надпочечники от краниального конца почки. В то время как нежно схватив почку, использовать рассасывающиеся 5-0 викрил шов сделать двойной узел вокруг мочеточника, почечной артерии и вены. Медленно безопасности, а затем разрезать над узлом, чтобы удалить почку. Если какой-либо признак немедленно кровопотерей, или Существует риск недостаточного удержаниеиз шва на мочеточника, артерии и вены, а затем использовать cauterizer вместо ножницы, чтобы вырезать выше узла.
3. После того, как почки удаляют, тщательно проверьте, нет ли кровотечения из привязанной артерии и при необходимости использовать cauterizer. Закройте брюшной стенки тела с использованием 5-0 викрил. Потяните слой кожи вместе и поместить 2-3 раны клипы следующем же меры предосторожности, как описано в 1.2.4. Внимательно следить за животное в день после операции по поводу признаков неблагополучия, кровотечение или ограниченной подвижностью. Следуйте институциональные рекомендации по животным безопасно.

3. Мониторинг Metastatic прогресс и локализация в конечной точке

1. Метастазы количественное болезнь: Биолюминесцентный мониторинг
   1. См. методологию, описанную ранее в Юпитер для мониторинга метастазов с использованием клеток, трансфицированные люциферазы и количественно, используя системный изображений ^11,12 Xenogen ИВИС.
2. Визуальный руководство вскрытие для сравнительной оценки метастатического распреТион
   1. Жертвоприношение животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам, используя конечные точки, включая признаков неблагополучия, затрудненное дыхание, потеря веса и т.д.
      Примечание: Тщательный мониторинг животных имеет решающее значение как спонтанное метастатическим развитие болезни может быть сильно варьирует и быстрый.
   2. Используйте хирургические ножницы, чтобы начать разрез выше уретры, которая продолжает до грудной полости в нижней челюсти. Используйте затупляли ножницы, чтобы отделить кожу от мышц брюшной стенки.
   3. Инициировать разрезы вдоль рук и ног. Пил кожи прочь. Внимательно осмотрите фасции кожи и брюшной стенки для узелков, то поверхностные лимфатические узлы: паховые, плечевого, подмышечные и поверхностным шейки матки.
   4. Сделать разрез в брюшной стенке и разрезают вдоль левой и правой боковых сторон до диафрагмы. С одной горизонтального разреза снять переднюю часть брюшной стенки, чтобы обнажить внутренние органы.
   5. Изучите спокойно внешний вид внутренних органов еили грубой заметные опухоли. Также обратите внимание на содержимое желудка и кишечника; если они пустые, мышь, возможно, не в состоянии съесть. Если содержимое темные, это может указывать доказательства верхнего / нижнего желудочно-кишечные кровотечения.
   6. Визуально оценить каждый орган на наличие опухоли или отсутствие, назначив общий балл для каждой группы мыши (4 животных в группе используется в качестве примера на рис 1D-и).
      Примечания: 1) Расширение лимфатических узлов, не обязательно означает, что это рост опухоли; если это существенно размера, очень твердая, и беловатый цвет, вполне вероятно, метастатическим узелок. 2) Чрезмерное молочный или мутноватая жидкость в брюшной полости указывает асцит. Асцит может включать твердые накопления на органах брюшной полости, в частности между долей печени и желудка. 3) для органов, таких как легкие, множественные узелки могут присутствовать и подсчитывали для сравнений между отдельными животными (см., например, ^13).
   7. Определите валовой опухоли или аномалии отдельных органов брюшной полости: печень, селезенка, почки и поджелудочной железы, тщательно удаляя и промывания PBS из бутылки шприц.
   8. После удаления органов брюшной полости, осмотреть живота лимфатические узлы, в том числе поясничного, крестцового, почек и брыжейки лимфатического узла.
   9. Оценка диафрагму на наличие метастазов.
      Примечание: широкое распространение на мембрану может сбить его сократимость, что приводит к затрудненное или потеря дыхания.
   10. Удалить диафрагму и сделать два боковых разрезов в грудной полости, удаляя переднюю часть, чтобы разоблачить легкие и сердце.
   11. Удалить легкие и сердце, осторожно потянув за пищевод и резки выше сердца трахею. Оценка тканей для узелков. Сожмите сердце. Отсутствие пружинистой консистенции может указывать подарок опухоли.
   12. Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать линейно через череп. Аккуратно удалить небольшие кусочки черепа до тон весь мозг подвергается. Посмотрите на протяжении мозга для видимых узелков или аномалии обесцвечивания.

Рисунок 1А показана схема с изложением изложенными в данной итогового протокола. Несколько важных факторов должны быть рассмотрены для каждого шага. Например, в шаге 1 показывает два способа суб-капсульного имплантации опухолевых клеток в почках. Опухолевые клетки могут быть имплантированы в суб-капсульного пространства с небольшим белым пузырь, подтверждающего локализованную размещение клеток с утечкой предотвратить путем тщательного удаления иглы и моечные избыточного выделение материала (рис. 1В-я). Для предотвращения утечки, клетки могут быть имплантированы внутренне первым добраться до суб-капсульный пространство (рис. 1В-II), и в сочетании с матригеле чтобы предотвратить начальное распределение опухолевых клеток в кровоток. Для хирургического удаления почки, точное время зависит от роста и метастатического потенциала клеточной линии использовали. Оптимальное практика нефрэктомия включает быстрый, но контролируемый хирургическую процедуру, чтобы минимизировать стресс и восстановление мыши. ТРАВО и безопасно заузливание Vicryl закрыть мочеточник, почечную артерию и вену является ключевым, чтобы избежать кровоизлияния (см. рисунок 1С). Прижигание следует использовать, но только если потенциал избыточного кровотечения требует вмешательства. Наконец, отслеживание спонтанного заболевания по неинвазивной биолюминесцентной оценки позволяет продолжать мониторинг оккультных поражений и роста, а также количественное в конечной точке (см. рис 1D). Тем не менее, использование люциферазы меченных клеток в спонтанных метастазов моделей может иногда приводить к клональной селекции опухолевых клеток вариантов, которые не могут выражать введенный ген, и поэтому не всегда могут быть видны после нескольких циклов селекции или долговременного роста опухоли. В этом случае клинически значимых гистологический анализ может быть проведен, чтобы определить микро-или метастатические повреждени, если не технически (финансово) возможно, визуальный метод подсчета очков для оценки визуального макро-метастатического заболевания можно использовать в качестве поверхностной меры ПресеNCE / отсутствие поражений в ткани органа (фиг. 1D-я и 1D-II).

Рисунок 1.) Схема хирургических процедур, включая имплантации (этап 1), хирургическая резекция / нефрэктомия (шаг 2), и оценка послеоперационной метастатической болезни (шаг 3). Б) Пример суб-капсульного имплантации в том числе (я) поверхностным и (II) внутренняя техника. C) Пример хирургической процедуры нефрэктомии (I) и представительного образа вырезали почки с имплантированным опухоли (II). D) оценка послеоперационный спонтанное метастазов с помощью I) зрительной системы скоринга для оценки Распределение болезнь (представительные результаты 5 групп по 4 животных), и II) биолюминесцентные данных непосредственно до и после жертва Цюйantitatively оценки микро-и макро-метастатических поражений. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Авторы не имеют ничего раскрывать.