Методическая статья

Рестриктазой основе Клонирование метод оценки В пробирке Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 августа 2014 г.

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ВИЧ-1 патогенез определяется как вирусными характеристиками, так и генетическими факторами хозяина. В этой статье мы описываем надежный метод, который позволяет проводить воспроизводимые измерения для оценки влияния вариации последовательности гена gag на способность вируса к репликации in vitro.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Защитный эффект многих аллелей HLA класса I на патогенез и прогрессирование заболевания ВИЧ-1 отчасти объясняется их способностью нацеливаться на консервативные участки генома ВИЧ-1, которые с трудом ускользают. Изменения последовательности, связанные с клеточным иммунным давлением, возникают по всему геному во время инфекции и если они обнаруживаются в консервативных областях генома, таких как Gag, могут повлиять на способность вируса к репликации in vitro. Передача HLA-сцепленных полиморфизмов в Gag с HLA-несовпадающими реципиентами была связана со снижением заданной вирусной нагрузки. Мы предположили, что это может быть связано со сниженной способностью вируса к репликации. В данной работе мы представляем новый метод оценки репликации ВИЧ-1 in vitro под влиянием гена gag, выделенного в острые моменты времени у инфицированных подтипа С замбийцев. Этот метод использует клонирование на основе фермента рестрикции для вставки гена gag в общую провирусную основу подтипа C ВИЧ-1, MJ4. Это делает его более подходящим для изучения последовательностей подтипа С, чем предыдущие методы, основанные на рекомбинации, которые оценивали in vitro репликацию хронически полученных последовательностей gag-pro. Тем не менее, протокол может быть легко модифицирован для изучения вирусов других подтипов. Кроме того, в этом протоколе подробно описан надежный и воспроизводимый метод оценки способности к репликации химерных вирусов Gag-MJ4 на Т-клеточной линии на основе CEM. Этот метод был использован для изучения химерных вирусов Gag-MJ4, полученных из 149 пациентов подтипа С, остро инфицированных замбийцев, и позволил идентифицировать остатки в Gag, которые влияют на репликацию. Что еще более важно, внедрение этого метода способствовало более глубокому пониманию того, как репликация вируса определяет параметры раннего патогенеза ВИЧ-1, такие как заданная вирусная нагрузка и продольное снижение CD4+ Т-клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение хоста и вирусные характеристики, которые влияют на ВИЧ-1 патогенез и прогрессирование заболевания имеет первостепенное значение для рационального проектирования вакцины. Клеточный иммунный ответ является ключевым компонентом человеческого иммунного ответа на ВИЧ-1 инфекции. Цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) необходимы для первоначального контроля острой виремии, и позволяют с хозяином, чтобы создать устойчивое состояние (уставка) вирусной нагрузки 1,2. Экспериментальный истощение этих эффекторных клеток приводит к потере вирусных управления 3,4. Несмотря на это, избежать мутации возникают в вирусном геноме, что подорвать CTL признание инфицированных вирусом клеток 5-9.

Некоторые аллели HLA были связаны с более низким уровнем вирусной нагрузки и более медленными прогрессирования заболевания в том числе B * 57, B * 27 и B * 81 10-15. Часть защитного благо аллелей HLA класса I может быть связано с тем, что они ориентированы на функционально ограниченных областей генома, такие как Gagи выберите для эвакуации мутаций, которые снижают способность вируса к репликации в пробирке 16-21. Хотя побег из клеточной иммунной системы полезно для вируса в контексте класса выбора HLA Я аллель, эффект этих мутаций может иметь дифференциальные последствия для хозяина при передаче на HLA-несоответствие индивидуального 22,23. Таким образом, понимание последствий передаваемых HLA-ассоциированных эвакуации мутаций на вирусной мощностью репликации будет важно углубить наше понимание ранней ВИЧ-1 патогенезе.

Несмотря на значительный прогресс был достигнут, чтобы идентифицировать и охарактеризовать фитнес дефекты отдельных мутаций эвакуации, связанных с конкретной HLA класса I аллелей 24-29, естественным штаммы ВИЧ-1 были уникальные и сложные следы HLA-ассоциированного полиморфизма, вероятно, возникающие в связи с HLA -опосредованной иммунная давление различных иммуногенетических фоны 30. В арrevious анализ, Goepfert др. показал, что накопление HLA-ассоциированных мутаций в передаваемых Gag последовательностей, полученных из 88 остро инфицированных Замбии было связано со снижением уставки вирусной нагрузки 31. Это позволило предположить, что передача вредных мутаций эвакуации, в частности, в Gag, чтобы HLA-получателей несоответствие обеспечивает клинический эффект, и могут быть ослаблены вследствие вирусной репликации. Двигаясь вперед, необходимо изучить, насколько сложным комбинации Gag полиморфизмов в природе изолятов работать согласованно определить характеристики передаваемого вируса, таких как емкости репликации, и как рано репликация может в свою очередь влияет на ВИЧ-1 клинические параметры и поздней стадии Патогенез.

Брокман и др. Впервые показали связь между способностью репликации кляп-про последовательностей, выделенных во время хронической инфекции стадии и вирусной нагрузки в обоих подтипа C и B инфекций32-35. Экспериментальный подход представлены в этих исследованиях, хотя подходящими для изучения возможностей репликации в пробирке последовательностей, полученных из хронически инфицированных лиц, имеет несколько технических предостережений и ограничений, которые делают изучающих ВИЧ-1 репликативной способности в подтипа C остро инфицированных трудно. Этот метод основан на рекомбинации основе население ПЦР-амплифицированных последовательностей в подтипа B NL4-3 провирусом, производного частично от LAV, лаборатория адаптированы вирусов запас 36. Вирус поколение было достигнуто путем ко-трансфекции с СЕМ на основе линии Т-клеток 37 с ПЦР-ампликонов и расщепляли дельта-GAG-Pro NL4-3 ДНК. Этот метод требует вырост вируса в течение нескольких недель или месяцев, потенциально перекоса природу выделенного вируса складе в отношении вирусных квазивидов в живом организме, и, следовательно, изменения измерение мощности репликации в пробирке. Этот метод яS больше подходит для изучения хронически инфицированных индивидуумов, где он эффективно выбирает на вирус с самой высокой репликативной способности, и где клонирование многочисленные различные вирусные варианты с большим количеством хронически инфицированных лиц довольно трудоемким и, следовательно, не представляется возможным. Тем не менее, в рамках остро инфицированным человеком, там, как правило, 1:59 варианты присутствуют, и, таким образом, устраняя риск перекоса природу восстановленного вируса складе, через в пробирке давлений отбора, позволяет для более точной оценки в пробирке емкостью репликации. Во-вторых, этот метод требует рекомбинации подтип C кляп-про последовательности в подтип B полученной позвоночника, и может ввести магистральных несовместимости предубеждения в анализ. Вследствие этих ограничений, большое количество последовательностей должны быть проанализированы с целью преодоления любых потенциальных предубеждений, введенные.

Здесь мы опишем альтернативный экспериментальный APPROACH подходит для изучения последовательности, полученные из подтипов C остро инфицированных. Мы используем рестрикции стратегию, основанную клонирования ввести ген рвотный полученный из острых моментов времени инфекция ВИЧ-1 подтипа С инфицированных лиц в подтип C провирусного позвоночника, MJ4. Использование MJ4 в качестве общего позвоночника в которой клонировать гены кляп имеет решающее значение для анализа подтипа C полученных последовательностей. MJ4 является производным от первичного изолята 38, и, таким образом, менее вероятно, чтобы ввести смещение вследствие несовместимости между подтипа позвоночника и рвотным гена. Кроме того, подход с использованием фермента рестрикции на основе клонирование позволяет провирусной конструкции для трансфекции непосредственно в клетки 293Т, и для восстановления клонального вирусного штамма, идентичной последовательности клонированного затычки.

Метод, представленный ниже, является высокая метод пропускная способность для оценки способности репликации подтипа C происходит Gag-MJ4химерные вирусы. Трансфекцию в клетках 293Т является простым и восстановление вируса занимает всего три дня. В пробирке емкость репликации анализируют на той же CEM-CCR5 основе линии Т-клеток, созданной Брокман соавт. 37, но с использованием важные изменения протокола необходимо для успешного тиражирования из подтипов C MJ4 химерных вирусов. Использование соответствующей линии Т-клеток, а не МНПК позволяет для большого числа подтип С MJ4-химерных вирусов, которые будут протестированы с высокой анализа воспроизводимости. Наконец, с помощью меченого обратной транскриптазы анализа для количественного определения вируса в супернатанте является более экономически эффективным, чем с использованием коммерчески доступного p24 ELISA комплектов. Это также дает более широкий динамический диапазон, который был важен для обнаружения как плохо и очень реплицирующиеся вирусы внутри же анализе и для обнаружения тонкие различия в репликации между изолятов.

В заключение, метод, представленный здесь позволилоуглубленное изучение способности репликации кляп последовательностей, взятых у ВИЧ-1 подтипа C остро инфицированных лиц из Замбии, и как написано, может также быть расширен для изучения другой подтип C зараженный населения. Наблюдался высокая степень изменчивости в емкостях репликации между различными изолятов Gag. Кроме того, мы смогли показать статистическую связь между мощностью репликации передаваемого Gag и установить точки вирусной нагрузки, а также с CD4 + упадка в течение 39 три года. Такие результаты указывают на важность изучения как передаются вирусные характеристики, такие как емкости репликации, взаимодействуют с иммунной системой хозяина влиять патогенеза в начале инфекции и будет неотъемлемой частью для разработки эффективных мер вакцины, а также лечение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Усиление ВИЧ-1 кляп гена от Infected, Frozen Plasma

  1. Выделите вирусную РНК из 140 мкл талых инфицированных ВИЧ-1 в плазме с использованием набора для экстракции.
    1. Когда это возможно, незамедлительно приступить к синтеза кДНК после экстракции РНК как разморожены вирусная РНК дает наилучшие результаты амплификации. Если это возможно, установить ПЦР основной смеси для первого раунда амплификации ДНК и хранить при температуре 4 ° С до вирусного выделения РНК.
  2. Обратный-транскрибировать кДНК из РНК и амплификации ДНК-продукты в первом раунде с помощью обратной транскриптазы и термостабильной ДНК-полимеразы в одностадийном RT-PCR.
    1. Возьмите РНК из -80 ° C морозильник (если было необходимо замораживание) и кратко оттепели при комнатной температуре, затем поместить в холодную блока. Передача 5 мкл РНК в каждую ПЦР-пробирку, содержащую 45 мкл мастер-смеси с получением конечного объема 50 мкл. Сразу же место оставшиеся образцы РНК в -80 ° C морозильник.
    2. После ферментdded в первом раунде ПЦР мастер-микс (Таблица 1А), аликвотной 45 мкл в каждую тонкостенной ПЦР-амплификации трубки для ряда реакций желаемых. Обязательно используйте ПЦР пробирок с отдельными крышками, а не лишить колпачки для обеспечения минимального перекрестного загрязнения между образцами. Поместите ПЦР трубы в холодном блоке, чтобы защитить чувствительный RT фермента РНК-шаблон и температуры. Примечание: Образцы должны быть запущены в трех экземплярах для того, чтобы адекватно отведать вирусные квазивидов. Кроме того, важно, чтобы использовать продукт с высокой точностью фермента ДНК-полимеразы с целью минимизации ПЦР-введенную основанных на ошибке включени. Пожалуйста, обратитесь к списку реагентов для рекомендуемого продукта.
    3. После матрицы РНК была добавлена ​​всех реакционных труб, передачи ПЦР пробирок в амплификатор для амплификации с помощью программы Cycler, описанный в таблице 1В. Примечание: Продукт этой усиления будет использоваться во втором раунде ПЦР.
  3. Выполните вложенными себеусл-тур ПЦР-амплификации, используя 1 мкл первого раунда ПЦР-амплификации (1.2) в качестве матрицы ДНК.
    1. Алиготе 49 мкл второго круга ПЦР мастер-микс (Таблица 2A) к каждой тонкостенной ПЦР-пробирку для ряда реакций желаемых. Передача 1 мкл из первого раунда ПЦР-амплификации с каждой реакционной трубы, чтобы дать конечного объема 50 мкл. Примечание: Это будет служить матричной ДНК для второго круга усиления. Важно также использовать ДНК-полимеразы с очень высокой точностью и корректура возможностей для того, чтобы свести к минимуму ПЦР-введенный основанных на ошибке включени. Пожалуйста, обратитесь к списку реагентов для рекомендуемого продукта.
    2. Трансфер второго круга ПЦР реакции микс Термоциклеры и программу запуска, описанную в таблице 2B. Примечание: После завершения программы, продукты этой реакции будут работать на агарозном геле, чтобы подтвердить получение продукта.
  4. Добавить 3 мкл 5х загрузки красителя 5 и #181; л из 50 мкл второго раунда реакционного объема и работать при 120 В на 1% агарозном ТАЕ-геле, содержащем УФ-флуоресцентным красителем ДНК, пока полосы не будут решены. Визуализация 1,6 кб полосы на синем света осветителя (рисунок 1А).
  5. Запустите оставшиеся 45 мкл реакционного объема на 1% агарозном-TAE геля, содержащего пятно ДНК, и вырезать соответствующие полосы с чистым лезвием бритвы.
    1. Извлечение ДНК из геля среза с использованием набора для очистки гель, элюируют в нуклеазы без воды, объединить три положительные реакции на человека, и заморозить продукт при -20 ° С для последующего использования.

2. Подготовка кляп Ампликоны для клонирования по внесение необходимых сайтов рестрикции

  1. Amplify длинного концевого повтора (LTR) / 5 'UTR часть плазмиды MJ4 (таблица 3).
  2. Представьте 1.3 кб продуктов ПЦР на осветителя, акцизные положительные ампликоны, гель для очистки и заморозить как ранееописано (1.4,1.5; рис 1В).
  3. Создать слиты MJ4 LTR- кляп ампликоны через "сплайсинга перекрытия-расширения" ПЦР (таблица 4).
  4. Представьте, акциз, очистить и заморозить 3,2 кб ампликоны как в 1.4,1.5 (смотрите рисунок 1С).

3. Клонирование Усиленный кляп гены в MJ4, подтип C, инфекционных молекулярной Clone

  1. Дайджест 1,5 мкг MJ4 плазмиды и 1,5 мкг очищенного продукта LTR- кляп ПЦР с BclI (метилирование чувствительны) рестриктазы для 1,5 ч при 50 ° С (см таблицу 5A).
  2. Добавить 1 мкл NgoMIV к реакции переваривания и инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
  3. Добавить 5x красителем к ограничению переварить реакции и медленно electrophorese общий объем на 1% агарозном ТАЕ-геле, содержащем ДНК из геля пятно в течение 1-2 ч при 100 В. визуализации, акциза и очистить указанные полосы для клонирования, как ранее алфавитуribed (рисунок 2).
  4. Подготовьте перевязки реакции с использованием очищенного LTR- рвотный вставку и MJ4 векторной ДНК в 3: 1 вставки соотношения вектора. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С (таблица 5B).
  5. Преобразование JM109 химически компетентные бактерии с лигирования продуктов и выкладывают на LB чашках с агаром с 100 мкг / мл ампициллина и расти при 30 ° С в течение 22+ часов.
    1. Оттепель JM109 компетентных клеток на льду в течение 15 мин. Этикетка 1,5 мл микроцентрифужных пробирок и охладить на льду.
    2. Алиготе 50-100 мкл JM109 клеток предварительно охлажденной 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Добавить 2,5-5 мкл реакции связывания в JM109 клеток, стряхивая трубку слегка перемешать и сразу же возвращаются на лед. Инкубируйте компетентных клеток с продуктом лигирования на льду в течение 30 мин.
    3. Тепловой удар 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих JM109 компетентных клеток и реакцию лигирования в 42 ° C тепла блока в течение 45 с и вернуться на лед в течение не менее 3 мин.
    4. Добавить 50 мкл SOC сред к каждому микроцентрифужных трубки и пластины всю реакцию на преобразование при комнатной температуре LB-агаром с добавлением 100 мкг / мл ампициллина.
    5. Передача пластины до 30 ° С инкубатор и оставить на 20 часов, или до тех пор, колонии не будут четко сформированы.
  6. Выбор изолированных колоний и расти в 4 мл LB с 100 мкг / мл ампициллина, при 30 ° С в течение 22+ часов.
  7. Спин вниз культур в 3200 мкг в течение 15 мин, слить бульон, и извлечь ДНК плазмиды.
  8. Для подтверждения клонирования верность, сократить минипрепаративную ДНК с NgoMIV и HpaI ферментов рестрикции в двойной переварить при 37 ° С в течение 2 часов. Анализ на 1% агарозном ТАЕ-геле (таблица 5, в).
  9. Последовательность LTR-GAG вставка область каждой плазмиды с использованием следующих праймеров: GagInnerF1, GagF2, REV1, rev3 и GagR6 (Таблица 6), чтобы подтвердить идентичность последовательности.
  10. Сравнение клонированных последовательностей, полученных с последовательностями населения дерived от первоначального очищенной ампликоне от 1.5.1. Примечание: Важно, в конечном счете оценить потенциал репликации двух независимых клонов, чтобы гарантировать, что любые в пробирке фенотипы репликации не связаны с магистральных ошибок, вносимых в процессе клонирования.

4 поколение и титрование репликации компетентных Gag-MJ4 химерных вирусов

  1. Генерация репликации компетентного вируса путем трансфекции 1,5 мкг химерного MJ4 плазмиды ДНК минипрепаративную в клетках 293Т с использованием 4: соотношение Fugene HD 1, как описано в Prince соавт 39.
  2. Титр собирают вирусные акции на ТЗМ-BL клеток, как описано ниже и в Принс и соавторы 39.
    1. Пластинчатые ТЗМ-бл клетки 24 часа в сутки до заражения вирусом, чтобы иметь на 30-40% монослоя сливающийся клеток на следующий день. Это обычно может быть достигнуто путем добавления 5 × 10 4 клеток в общем объеме 800 мкл на лунку в 24-луночный планшет.
    2. После добавления клеток в лунку, слегка перемещать 24-луночного планшета вперед и назад, а затем из стороны в сторону для того, чтобы эффективно распределить клетки. Никогда не циркулируют - это приведет к клеток, накапливающихся в центре пластины.
    3. На следующий день, подготовить 1% FBS в DMEM; это будет использоваться для разбавления DEAE-декстрана и для разбавления вируса натуральной оспы. Со DEAE-декстран 10 мг / мл или 125x, и конечная концентрация 80 мкг / мл или 1x желательно.
    4. Выньте вирусов запас для тестирования от -80 ° C морозильник и место на шейкере таять при комнатной температуре.
    5. Использование многоканальную пипетку, последовательно разбавленной запасами вируса в культуре круглым дном ткани обрабатывают 96-луночный планшет с крышкой. Это протокол разведения в 3 раза. Смотреть таблицу 7 для схемы разбавления.
    6. Удалить носитель из посеянных 24-луночных планшетах ТЗМ-бл при помощи вакуумного аспиратора решений, чтобы не нарушить клеточный монослой. Только извлекайте носитель из одного 24-луночного планшета в то время, так что клетки делаютне высыхают.
    7. Добавить 150 мкл 1х DEAE-декстрана + 1% FBS в DMEM смеси в каждую лунку с использованием 1000 мкл пипетки. Не использовать повторное пипетки, так как это нарушает монослой.
    8. Добавить 150 мкл каждого разведения вируса в соответствующую лунку. Добавить вирус в центре скважины и вихревой нежно, чтобы равномерно распределить вирус через клеточный монослой. Инфицированные клетки инкубируют в течение 2 ч в инкубаторе для тканевых культур при 37 ° С и 5% СО 2.
    9. После 2 ч инкубации, добавление 0,5 мл 10% FBS в DMEM в каждую лунку и возврата пластин в инкубаторе в течение еще 48 часов.
    10. Через 48 ч клетки должны быть на 100% сливной. Потому MJ4 является репликация компетентный вирус, будет некоторое гибель клеток, но это и следовало ожидать.
    11. Удалить СМИ из каждой лунки и добавить 400 мкл / лунку фиксации решение (см Таблицу 8A для рецепта). Закрепить только одна пластина одновременно. Добавить фиксации решение с использованием 1000 мкл пипетки, и оставьте на 5 мин припри комнатной температуре.
    12. Удалить крепежный решение и промыть 3 раза с PBS с Са 2 + / Mg 2 +. Используйте шприц бутылку осторожно добавить PBS в сторону колодца, чтобы избежать нарушения монослой. После третьего промывания, промокните знак сухой на впитывающую бумагу.
    13. Добавить 400 мкл / лунку окрашивание раствора (таблица 8B для рецепта) в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение по крайней мере 2 часов. Более длительное время инкубации являются приемлемыми, но время инкубации должны храниться в соответствии между титрованием экспериментов.
    14. Вымойте 2x с PBS с Са 2 + / Mg 2 + и забить на инфекции, или добавить PBS и хранят при температуре 4 ° С для озвучивания позже. Плиты можно хранить при 4 ° С в течение до четырех дней, до тех пор, монослой хранится гидратированный.
    15. Забить на инфекции, использовать постоянный маркер разделить лунки пластины 24-а на сектора. Подсчет всех синих клеток в поле зрения, используя общее увеличение порядка 200Х, один раз вкаждого из четырех квадрантов скважины.
    16. Вычислить инфекционных единиц на мкл следующим образом: [(# синий клеток / 4) × 67] / (мкл вирус, добавленный) = МЕ / мкл. В Таблице 8C по объему в мкл вируса в каждую лунку добавляли. Средние несколько скважин вместе; цифры должны быть относительно одинаковы для точного титрования.

5 приготовления питательных сред и распространении GXR25 клеток для экстракорпорального репликации Пробирной

  1. Подготовить всю RPMI (cRPMI) для распространения GXR25 клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно важно, чтобы культура GXR25 клеток не менее 4 месяцев до запланированных экспериментов репликации (таблица 9).
  2. Разбить ячейки 1:10 два раза в неделю и поддерживать плотность клеток между 1 х 10 5 до 2 × 10 6 клеток / мл.

6. Экстракорпоральное тиражирования Gag-MJ4 химерами в GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Клетки

  1. Накануне Infection, разделить клетки в концентрации между 2-3 × 10 5 клеток / мл таким образом, что они находятся в логарифмической фазе роста в день инфекции.
  2. В день инфицирования, удалить с запасами вируса от -80 ° C морозильник и оттепели. Рассчитать объем необходимой вируса от каждого складе на основе МЕ / мкл титра от ПЗМ-BL анализе клеток для того, чтобы инфицировать 5 х 10 5 клеток GXR25 при множественности заражения 0,05, используя формулу:
    Объем вируса для заражения (мкл) = 1 мкл / X МЕ х 0,05 х 500000
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выбрали МВД 0,05, как это приводит к логарифмической фазе роста для всех вирусов, которые мы проверили. Важно провести начальные эксперименты, чтобы определить оптимальный MOI, чтобы захватить логарифмический рост на вирус, подлежащего испытанию.
  3. Развести вирус в cRPMI до объема 100 мкл (для того, чтобы достичь 0,05 MOI) и добавить в лунку культуры V-Нижний ткани обрабатывают 96-луночного планшета. Примечание: включать как positiве (MJ4 WT зараженный) и отрицательный (макет инфицированные клетки) контроль в каждой серии экспериментов репликации. Настройте пластину таким образом, что каждый второй столбец пустой ограничить перекрестное загрязнение между скважинами. Положительный контроль является обязательным, так как он будет использоваться в дальнейшем в качестве стандарта для нормализации склоны репликации, которые мерой скорости репликации экспериментальных повторах.
  4. Количество GXR25 клеток с использованием автоматизированной счетчика клеток. Подсчитайте количество клеток, необходимых в общей для всех инфекций (5 х 10 5 х # инфекции). Алиготе необходимый объем в 50 мл коническую трубку и центрифуги для осаждения клеток. Всегда рассчитывать на 25% больше инфекций, чем нужно.
  5. Аспирируйте СМИ тщательно и ресуспендируют в cRPMI в концентрации 5 × 10 5 клеток / 100 мкл.
  6. Внесите клеток в стерильной корыто и тщательно перемешать. Использование пипетки многоканальный, добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего разбавленный вирус. Мих тщательно.
  7. Добавить 2 мкл 5 мг / мл (100x) раствору полибрена в каждую лунку и смешать клетки тщательно.
  8. Инкубируют при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе с 5% CO 2 в течение 3 часов.
  9. Для того, чтобы вымыть инфицированные клетки, центрифуги 96-луночный V-нижняя пластина для осаждения клеток. Затем осторожно удалить 150 мкл среды и заменить свежими 150 мкл cRPMI не нарушая осадок клеток. Повторите еще 2 раза (в том числе центрифугирования), чтобы достаточно мыть клетки.
  10. После последнего центрифугирования и добавлением 150 мкл cRPMI, ресуспендируют осадок клеток с помощью многоканальной пипетки и добавить весь клеток / вируса смесь (примерно 200 мкл) из каждой лунки независимо друг от друга до 800 мкл cRPMI в лунку 24-луночного культура пластины.
  11. Место пластины в 5% CO 2 культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C.
  12. Каждые два дня, удалить 100 мкл надосадочной жидкости с поверхности культуры хорошо и передать 96-луночный U-bottom пластины и хранить в замороженном виде при -80 ° С до запуска вируса количественный анализ. Примечание: Тщательное размещение супернатантах в 96-луночных планшетах позволит для передачи пипетки многоканального из культуральных супернатантов в течение вириона количественного через меченного обратной транскриптазы (RT) анализа. Каждая тарелка должна содержать образцы из стандарта инфекции с целью нормализации изменение между пластины в аналитическом считывания РТ.
  13. После удаления каждого образца 100 мкл, разбить ячейки 1: 2, тщательно ресуспендированием клеток и удаления половину оставшегося объема (450 мкл). Восстановление первоначального объема (1 мл), добавляя 550 мкл свежей cRPMI в каждую лунку.

7 Анализ обратной транскриптазы (RT) в надосадочной жидкости культуры клеток

Протокол адаптировано из Островского и др 40.

  1. Настройка биологический защитный кожух в BSL-3 объекта для использования с радиоактивными материалами.
    1. Поместите фильтровальной бумагой в ого-год и заменить аспиратор для аспиратора предназначен для радиоактивных использования. Примечание: Все радиоактивные отходы должны быть утилизированы неправильно с согласно правилам техники безопасности.
  2. Добавить 1-2 мкл 10 мКи / мл [α- 33 P] дТТФ и 4 мкл 1 М дитиотреитола (DTT) в каждую 1 мл аликвоты RT мастер-смеси (таблица 10 и Ostrowski и соавт. 40).
  3. Тщательно перемешать каждый 1,5 мл микроцентрифужную трубку РТ мастер-микс, DTT, и [α- 33 P] дТТФ с 1000 мкл пипетки и переносят в стерильную корыта.
  4. 25 мкл меченого комнатной температуре смешивают в каждую лунку 96-луночного тонкостенной пластины ПЦР. Примечание: Включите пространство для положительного контроля (MJ4 WT инфекции) и отрицательного контроля (Мок инфекции).
  5. Добавить 5 мкл каждого супернатанта к пластине ПЦР, содержащего основной смеси RT.
  6. Уплотнение ПЦР пластины с покрытием из фольги клей и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С в амплификатор. По соображениям безопасности, РинSE наконечники с Amphyl и распоряжаться советы в небольшой контейнер, содержащих Amphyl отходов, которые в дальнейшем будут утилизировать в радиоактивных отходов.
  7. После инкубации, сделать маленькие отверстия в крышке из фольги с использованием 200 мкл многоканальный пипетки. Примечание: Если наконечники трогать жидкости в хорошо, заменить советы, прежде чем перейти к следующему строки или столбца.
  8. Mix образцы 5x и передача 5 мкл каждого образца к DE-81 бумаги. Воздух сухой 10 мин.
  9. Wash блоты 5x с 1х SSC (хлорид натрия, цитрат натрия), а затем 2x с 90% этанола в 5 мин на каждую промывку. Дайте высохнуть на воздухе.
    1. Место каждого кляксу в отдельном стиральной контейнер, например, ящик для хранения сэндвич, добавить достаточно промывочный буфер (1x SSC или 90% этанол), чтобы покрыть кляксу, и встряхивают в течение 5 мин.
    2. Вылейте промывочного буфера в отдельном контейнере и повторите. Примечание: первые 3 моет считаются радиоактивными и должны быть утилизированы должным образом. Последние 2 моющие средства могут быть утилизированы регулярно.
  10. После высыхания, автомобильefully обернуть пятном в Саран обернуть и выставить на phosphoscreen в плотно закрытой кассеты в течение ночи при комнатной температуре.
  11. Анализ phosphoscreens с Phosphorimager и количественно радиоактивные стенограммы.
  12. Нарисуйте круг вокруг каждого радиоактивного сигнала с использованием OptiQuant программного обеспечения. Графике Digital Light Unit (DLU) величины для построения кривых репликации.
  13. В целях получения оценки потенциала репликации, значения DLU были журнал 10 -transformed и склоны были рассчитаны с использованием день 2, 4, и 6 временных точек. Репликация склоны затем делится на склоне WT MJ4 в порядок генерировать десятки мощности репликации. Важно, чтобы нормализовать на основе значений MJ4 WT, полученных из того же RT пластины, чтобы уменьшить вариабельность внутри теста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы правильно выполнить этот протокол, который создает провирусную плазмиды, способной сборки полностью функциональные, инфекционные химеры Gag-MJ4, большое внимание должно быть принято, чтобы генерировать соответствующие ампликоны ПЦР. Определение ПЦР породила ли соответствующего размера рвотный ампликон имеет решающее значение. Продукция должна быть в пределах 100 пар оснований (п.о.) от примерно 1700 б.п. ампликона, изображенной на рисунке 1а. Точная длина этого фрагмента будет ва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодаря длине и технического характера этого протокола, есть несколько шагов, которые имеют решающее значение как для успешного строительства химерных Gag-MJ4 плазмид, а также для количественного определения вирусной мощностью репликации. Хотя на основе стратегии клонирования рестриктазы для введения генов в иностранной кляп в MJ4, изложенной в настоящем протоколе имеет целый ряд преимуществ перед ранее используемых методов рекомбинации основе, протокол может быть технически сложным, если критические шаги не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследователи благодарят всех добровольцев в Замбии, которые участвовали в этом исследовании, и всех сотрудников Исследовательского проекта Эмори по ВИЧ в Замбии в Лусаке, которые сделали это исследование возможным. Исследователи хотели бы поблагодарить Джона Аллена, Смиту Чаван и Маккензи Херлстон за техническую помощь и управление образцами. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Марка Брокмана за его обсуждения и щедрое пожертвование ячеек GXR25.

Это исследование финансировалось R01 AI64060 и R37 AI51231 (EH) и Международной инициативой по вакцине против СПИДа. Эта работа стала возможной отчасти благодаря щедрой поддержке американского народа через Агентство США по международному развитию (USAID). Содержание исследования является ответственностью авторов исследования и не обязательно отражает точку зрения USAID или правительства Соединенных Штатов. Эта работа также была поддержана, в частности, Вирусологическим ядром Центра исследований СПИДа Эмори (грант P30 AI050409). DC и JP были частично поддержаны Action Cycling Fellowships. Эта работа была частично поддержана базовым грантом Национального центра исследования приматов Йеркса (2P51RR000165-51). Этот проект также частично финансировался Национальным центром исследовательских ресурсов P51RR165 и в настоящее время поддерживается Управлением программ исследовательской инфраструктуры/OD P51OD11132.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартный desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 нмоль, стандартное обеззоливание
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартное обезсоливание
для3: 5' CTAGGAAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартное обезсоливание
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартное обезлесение
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартная десоль
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTGCTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 нмоль, стандартная десоль
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Нуклеазная вода FisherSH30538FSПроизводитель Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, синий (плоский колпачок)DaiggerEF3647BX
SuperScript III одноступенчатая система ОТ-ПЦРLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II ДНК-полимеразаFisherF-549L
PCR Nucleotide СмесьRoche4638956001
Agarose, высокая прочность геляFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA лестницаFisher PRG5711производства Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV гель и Система очистки ПЦРPromegaA9282
Бритвенные лезвия, однолезвийныеFisher12-640производства Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Клонирование Реагенты
LB агар, МиллерФишерBP1425-2
LB Бульон, ЛенноксФишерBP1427-2
Стерильный 100 x 15 мм Полистирольные чашки ПетриФишер08-757-12
Ампициллин натриевая сольSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 мл Полипропиленовые трубки с круглым дномBD Biosciences
Эндонуклеаза рестрикции NgoMIVNew England BioLabsR0564L
BclI рестрикция эндонуклеазаNew England BioLabsR0160L
HpaI рестрикция эндонуклеазаNew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μ lRoche10799009001
компетентные ячейки JM109, >108 cue/μ gPromegaL2001
PureYield система miniprep для плазмидыPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Трансиллюминатор синего светаInvitrogenG6600
Microfuge 18 центрифугаBeckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl очиститель/дезинфицирующее средствоFisher22-030-394
Fugene HD, 1 млVWRPAE2311производства Promega
Гексадиметрин бромид (полибрен)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6-луночные, плоские Fisher07-200-83Произведены Corning Life
Costar Plates, 24-луночные, плоскиеFisher07-200-84Произведены Corning Life
Costar Plates, 96-луночные, круглыеFisher07-200-95Производитель Corning
Life Flasks, Крышка фильтра Corning/скошенная горловина, 75 см2Fisher10-126-37
Flasks, верхняя часть фильтра Corning/скошенная горловина, 150 см2Fisher10-126-34Производитель Corning Life
Conical Tubes, 50 мл, синий колпачокFisher14-432-22Производитель BD Biosciences
Conical Tubes, 15 мл, синий колпачокFisher14-959-70CПроизводитель BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIПроизводитель Mediatech
RPMI, 500 млLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 млLife Technologies/Invitrogen11965-118
Пенициллин/ Стрептомицин/Глютамин, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS с магнием и кальцием, 500 млLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS без магния и кальцияLife Technologies/Invitrogen20012-050
Трубки Sarstedt, разные цветаSarstedt72.694.996
Резервуарные лотки для Многоканальный, 55 млFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 хорошо прозрачный V культура донной ткани обработанный микропланшетFisher07-200-96Производитель Corning Life
HEPES, 1 м буферный растворLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, определенный, 500 млFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941производства Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25% в H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Раствор хлорида магнияSigma-AldrichM1028-100ML
Раствор формальдегида, для молекулярной биологии, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
калия гексацианоферрат(II) тригидратSigma-AldrichP9387-100G
Калия гексацианоферрат(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R центрифугаBeckman Coulter392932
TC10 автоматический счетчик клетокBio-Rad1450001
VistaVision инвертированный микроскопVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ки/ммоль, 10 мКи/мл, 1 мКиPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8,0Life Technologies/Invitrogen15568025Необходимо отрегулировать до pH 7,8 с помощью KOH
2 M Potassium chloride (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust к 1 М раствору
0,5 М ЭДТАЛайф Технолоджис/Инвитроген15575-020
Нондет Р40Рош11333941103
Полиадениловая кислота (Поли рА) соль калия Мидленд Реагент Ко.P-3001
Oligo d(T) праймерLife Technologies/Invitrogen18418-012
Дитиотреитол (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Люминофорный экран сверхвысокого разрешения, МалыйPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermohole 96-луночная пластина модель (M) ПоликарбонатFisher07-200-245Производитель Corning Life
Corning 96-луночная микропластина алюминиевая уплотнительная лента, нестерильнаяFisher07-200-684Производитель Corning Life
DE-81 аниообменная бумагаВатман3658-915
Дигидрат цитрата тринатрияСигма-ОлдричS1804-1KG
Хлорид натрияFisherS671-3
Авторадиографическая кассетаFisherFB-CA-810
Циклонный накопительный фошпорный экранPackard
352059<td colspan="4"><Реагенты для количественного определения сильной>сильной транскриптазы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HIV 1 Replication CapacityRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

Похожие статьи